Murine B 세포를 정화에 유도 및 클래스 스위치 재조합 평가

체액성 면역 반응 동안, 항원에 의해 활성화된 B 세포는 반응이 진행됨에 따라 증식하고 항체를 분비합니다. 증식 및 클래스 전환(class switching)을 평가하기 위해 기본 IgM 항체 동형(isotype)이 더 다양한 IgG, IgA 또는 IgE 동형으로 대체됩니다. 자성 세포 분리법을 사용하여 실험용 마우스로부터 시험관 내(in vitro) 비장 B 세포를 분리합니다.

세포는 증식 상태를 관찰하기 위해 형광 염료인 CFSE로 염색하며, 이러한 증식은 박테리아 L-P-S-L-P-S 처리로 인해 자극됩니다. L-P-S-L-P-S 자극은 증식과 더불어 IgG3 동형 단백질로의 클래스 전환 또한 유도하며, 이는 유세포 분석법으로 관찰할 수 있습니다. 오늘은 순수한 비장 B 세포를 분리하고 활성화하는 기술을 보여드리겠습니다. 이 기술은 인비트로(in vitro)에서 클래스 전환 재조합과 증식을 관찰하는 데 사용할 수 있으며, activation induced citing in deaminase의 기능 및 조절을 포함하여 B 세포 면역 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데에도 활용될 수 있습니다.

안락사시킨 마우스를 70% ethanol에 담그는 것으로 시작합니다. 면역 체계가 완전히 성숙하도록 마우스의 연령은 8~12주여야 합니다. 멸균 가위를 사용하여 복부 왼쪽 늑골하 구역의 피부와 근육을 절개합니다. 가위나 포셉을 사용하여 인접 조직으로부터 비장을 적출합니다.

다음으로, PBS 내에서 이를 세 개의 큰 조각으로 자릅니다. 그런 다음 1 mL 주사기 플런저의 고무 끝을 사용하여 비장을 70 µm 세포 스트레이너를 통해 PBS로 부드럽게 으깹니다. 이때 갈아내는 동작이 아니라 밀어내는 동작을 사용해야 합니다.

마쇄 과정에서 크기가 큰 증식 세포가 파괴될 수 있으므로, 세포를 350 G 이하의 속도로 5분 동안 원심 분리합니다. 그 후 펠렛을 PBS에 재현탁합니다.

멸균된 5 mL 폴리스티렌 튜브 내의 재현탁된 세포를 헤모사이토미터를 사용하여 계수하십시오. 5% 정상 쥐 혈청이 포함된 PBS에서 mL당 1 × 10⁸개의 세포 현탁액을 준비하십시오. 각 튜브에는 최대 2 mL까지 첨가할 수 있습니다.

다음으로, 세포 1 mL당 50 µL의 EP negative selection Mouse B-cell enrichment cocktail을 추가합니다. 그 후 튜브의 캡을 닫고 냉장고에 15분 동안 보관합니다.

세포 1 mL당 100 µL의 EP biotin selection cocktail을 첨가합니다. 튜브의 뚜껑을 닫고 냉장고에 넣어 15분 동안 보관합니다. biotin selection cocktail과 함께 배양한 후, EP magnetic nanoparticles를 혼합하여 세포 1 mL당 100 µL씩 첨가합니다. 혼합물을 파이펫팅하고 튜브의 뚜껑을 닫은 후 냉장고에 5분 동안 보관합니다.

PBS를 사용하여 용액의 부피를 2.5 milliliters로 맞춘 다음, cept 마그넷에 5분 동안 둡니다. 마그넷 내의 튜브를 뒤집어 새로운 폴리스티렌 튜브에 빠르게 붓습니다. 음성 선택된 세포들이 튜브 벽에 자기적으로 결합되므로 튜브를 흔들지 마십시오. 세포 현탁액의 순도를 더욱 높이려면, 세포가 담긴 새 튜브를 마그넷에 5분 동안 둔 다음 다시 새 튜브에 붓습니다.

이 단계에서 전체적인 세포 회수율이 감소할 수 있습니다. B 세포의 순도는 B 세포 표면 마커에 대한 유세포 분석으로 평가할 수 있습니다. 농축 후, 세포의 95% 이상이 B220 양성이어야 합니다.

멸균된 dimethyl sulf oxide에 희석된 5 mM CFSE 염료 스톡 솔루션을 사용하여, 최종 농도가 mL당 100만 개 세포가 되도록 0.1% BSA가 첨가된 따뜻한 PBS에 분리된 세포를 재부유합니다. 튜브 내의 세포 mL당 2 µL씩 첨가합니다. CFSE는 자극된 세포의 세포 분열을 모니터링하는 데 사용됩니다.

이소형 전환(isotype switching)에 필수적인 과정입니다. 일차 B 세포의 염색에는 10 micromolar의 최종 농도가 최적입니다. 37 degrees Celsius에서 10분 동안 암소 보관하여 배양합니다.

CFSE는 빛에 민감하므로 가능한 한 암소 상태로 보관해야 함에 유의하십시오. 배양 후, 세포에 동일한 부피의 bovine calf serum을 첨가하고 얼음 위에서 배양하여 염색을 중지시킵니다. 세포 세척을 위해 5분 동안 배양액으로 튜브를 채우는데, bovine calf serum의 점성을 상쇄하고 세포 펠렛이 형성될 수 있도록 최소 5배 부피에 해당하는 배양액을 첨가한 후 350 G에서 원심분리하십시오. 배양액으로 세포를 두 번 더 세척하면, 이제 세포를 자극할 준비가 된 것입니다.

RPMI 1640에 10% fetal bovine serum과 50 micromolar Beta-mercaptoethanol을 첨가하여 in vitro B-cell 배양 배지를 준비합니다. 다음으로, LPS를 최종 농도 50 micrograms per milliliter가 되도록 첨가하여 자극 배지를 준비합니다. 평저형 96 well 조직 배양 플레이트의 각 well에 자극 배지 125 microliters씩을 분주합니다.

LPS가 포함되지 않은 배양액에서 CFS E로 염색된 B 세포를 최종 농도가 3.2 × 10⁶ cells/mL가 되도록 준비합니다. 세포 현탁액 125 µL를 자극 배지가 들어 있는 웰에 첨가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 이제 각 웰에는 최종 LPS 농도가 25 µg/mL인 상태로 400,000개의 세포가 포함됩니다.

이는 세포 증식 및 클래스 전환(class switching)의 최적 수준을 제공합니다. 필요에 따라 이 값들을 조정할 수 있으나, 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 72~96시간 동안 배양하십시오. 48시간 후, 현미경으로 클래스 전환을 관찰하면 증식 중인 거대 B 세포 군집이 뚜렷하게 보일 것입니다.

세포를 배양기에서 꺼내 비특이적 항체 염색을 방지하기 위해 1 mL의 염색 완충액으로 2회 세척합니다. 350 G에서 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 그다음 100 µL의 염색 완충액(5% 일반 마우스 혈청 및 세포 10^6개당 1 µg의 FC block 포함)에 세포를 재현탁하고, 세척 없이 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 세포 10^6개당 1 µg의 형광 표지 anti-US IgG three 항체를 첨가하여 얼음 위에서 30분 동안 배양한 후, 세포를 2회 세척하고 200~300 µL의 염색 완충액에 재현탁합니다.

이제 세포를 유세포 분석기로 평가할 준비가 되었습니다. CFSE는 아르곤 이온 레이저에 의해 492 nanometers에서 최적으로 들뜨며 517 nanometers에서 방출됩니다. IgG 3 항체의 들뜸 및 방출 스펙트럼은 결합된 형광 염료에 따라 달라집니다.

자기 농축 후, 세포 현탁액은 구분이 불가능한 작은 원형 세포들이 균일한 집단을 이룬 것처럼 보여야 합니다. 48~72시간의 자극 후에는 비대해진 증식 세포들이 고립된 클러스터 형태로 명확하게 관찰될 것입니다. 증식하지 않는 세포의 상당 부분은 세포 사멸(apoptosis)이 진행됨에 따라 작고 과립형으로 나타날 것입니다.

CSR은 일반적으로 대부분의 세포가 사멸하기 시작하기 전인 자극 후 72시간에서 96시간 사이에 가장 높은 수준으로 검출될 수 있습니다. 이 단계에서 세포는 여러 번의 세포 분열을 거쳐야 하며, 전환된 세포가 후기 딸세포 집단에서 나타나야 합니다. 이러한 프로토콜을 따른 후, rna, AI 매개 유전자 넉다운과 같은 다른 기술을 사용하여 특정 유전자가 ID의 기능 및 클래스 전환 재조합 과정에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다.