Name: Murine B 세포를 정화에 유도 및 클래스 스위치 재조합 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 배우세요 마우스 비장 B 세포 분리 및 활성화를 통한 클래스 스위치 재조합 분석 방법입니다. 이 기술은 면역학 연구에서 항체 동형 전환과 세포 증식을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 도움이 토론에 대한 마틴의 실험실에 감사하고 있습니다. 이 책자는 건강 연구의 캐나다 연구소 (걸레 - 89783)에서 부여로 지원됩니다. AM은 캐나다 연구 의자 티어 II 수상에 의해 지원됩니다.

단계 I : 자기 강화를 통해 지라 B 세포의 절연 <ol><li> 실험 생쥐는 면역 체계의 전체 성숙을 보장하기 위해 8~12주 이상되어야합니다. </li><li> 자궁 경부 전위로 마우스를 안락사와 70 % 에탄올에서 만끽해보세요. 수술 복부의 왼쪽 hypochondrium의 피부와 근육을 통해 절개하여 비장을 제거하고 인산의 3 대 조각으로 잘라 (PBS) 살린 버퍼. 모든 도구와 시약은 멸균 수 있도록. </li><li> 부드럽게 매쉬는 PBS로 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 1 ML 주사기 플런저의 고무 끝을 비장 사용합니다. 연삭가 큰 (proliferating 예) 세포의 파열로 이어질 수 있으므로 추진 운동보다는 연삭 모션을 사용해야합니다. </li><li> 5 분 더 이상 350 이상 g에서 세포를 스핀 다운 및 PBS의 펠렛을 resuspend. hemocytometer를 사용하여 resuspended 세포를 계산합니다. </li><li> 뚜껑이있는 멸균 5 ML의 폴리스티렌 튜브 5% 정상 쥐의 혈청 (튜브 당 2 ML 최대 볼륨)과 1x10 8 셀 / PBS에 ML의 정지를 준비합니다. </li><li> 세포의 모든 ML에 대한 부정적 EasySep 선택 마우스 B 세포 농축 칵테일 50 μL를 추가합니다. 혼합물을 피펫, 튜브 캡, 15 분 동안 냉장고에 곳입니다. </li><li> 세포의 모든 ML 100 μL EasySep 비오틴 선택 칵테일을 추가합니다. 혼합물을 피펫, 튜브 캡, 15 분 동안 냉장고에 곳입니다. </li><li> 세포의 모든 ML에 대한 EasySep 마그네틱 Nanoparticles 100 μL를 (nanoparticles 잘 혼합되고 솔루션은 동질한지) 추가합니다. 혼합물을 피펫, 튜브 캡, 5 분 동안 냉장고에 곳입니다. </li><li> PBS로 5 분 EasySep 자석의 장소 2.5mL 위로는 솔루션입니다. 자석과 튜브를 반전하고 새로운 폴리스티렌 튜브에 신속하게 부어. 부정적인 선택 세포가 자기 (磁 气) 튜브 벽에 바인딩되므로 튜브를 흔들지 마세요. </li><li> 더욱 세포 현탁액의 순도를 높이려면, 튜브가 추가 5 분 자석에 다시 삽입하고 새로운 튜브로 부어있을 수 있습니다. 이것은 전체 세포 복구를 줄일 수 있습니다. </li><li> B 세포의 순도는 B 세포 표면 마커의 흐름 cytometric 분석에 의해 평가하실 수 있습니다. 농축 다음, 우리는 지속적으로&gt; 95% B220 긍정적인 세포의 순도를 참조하십시오. </li></ol> CFSE 세포 얼룩 : II 단계 <ol><li> ML 당 1 × 10 6 세포의 최종 농도에서 알부민 0.1 % 소 혈청과 보충 따뜻한 PBS에서 분리된 세포를 Resuspend. </li><li> CFSE (무균 디메틸 sulfoxide에 희석)의 5mM 재고 솔루션을 준비하고 튜브에 세포의 모든 ML에 대한 2μL를 추가합니다. 10μM의 최종 농도는 기본 B 세포의 얼룩에 최적입니다. </li><li> 37 품어 ° 어둠 속에서 10 분 동안 C (참고 : CFSE 빛을 민감한하고 가능하면 어둠에 보관한다.) </li><li> 당신의 세포에 소 송아지 혈청의 동일한 볼륨을 추가하고 5 분 얼음 잠복기로 얼룩을 끄다. </li><li> G.를 (제조법 단계 III 참조) 문화 매체로 튜브를 토핑하고 350에 centrifuging하여 세포 와시 미디어 적어도 5 배 부피 상응하는이 소 송아지 혈청의 점도를 중화하고 세포의 펠렛 생산에 추가할 수 있어야합니다. </li><li> 문화 매체에 두 번 더 세포를 씻으십시오. 세포는 이제 자극에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> III 단계 : LPS와 함께 세포 자극을 <ol><li> 10% 소태아 혈청 및 50 μm의 β - 메르 캅 토 에탄올 /로 RPMI 1640을 보완하여 체외의 B 세포 배양 매체에서를 준비합니다. </li><li> 50μg/mL의 최종 농도에서 LPS를 추가하여 자극 미디어를 준비합니다. 평평한 바닥의 각 잘 96 - 웰 조직 배양 플레이트에 자극을 매체의 나누어지는 125 μL. </li><li> 3.2 X 10 6 세포 / ML의 최종 농도에서 LPS없는 배지에서 CFSE - 스테인드 B 전지를 준비합니다. 귀하의 자극 미디어 부드럽게 pipetting으로 혼합을 포함하고있는 우물에 세포 현탁액 125 μL를 추가합니다. </li><li> 각 물론 지금은 25 μg / ML의 최종 LPS 농도 4 X 10 5 세포가 포함되어 있습니다. 이러한 값을 변경을 원하는대로 만들 수 있지만 이것은 세포 증식 및 클래스 스위칭의 최적 수준을 제공합니다. </li><li> 37 세포를 품어 ° C와 5% 72~96시간에 대한 CO 2. 48 시간 후, 큰 proliferating B 세포의 클러스터는 현미경으로 명확하게 볼 수 있습니다. </li></ol> 단계 IV : 클래스 스위칭의 흐름 cytometric 분석 <ol><li> 이 클래스 스위칭 볼 준비가되면, 그들의 문화 조건에서 세포를 제거하고 얼룩 버퍼 (2 % 소 송아지 혈청 PBS) 1 ML 두 번 그들을 씻으십시오. </li><li> 350g과 incuba에서 그들을 회전하여 세포 펠릿 세포가 아닌 특정 항체 얼룩을 방지하기 위해5% 정상 마우스 혈청 얼음에 15 분 동안 FcBlock per106 세포의 1μg과 버퍼를 얼룩의 100μL에 테 그들. 셀 차단은 얼음에서 수행되어야합니다. </li><li> 당신의 세포를 세척하지 않고, 찬란 태그를 방지 마우스 IgG3 항체의 10 6 세포 당 1μg을 추가하고 세포가 얼음에 30 분 동안 착색 수 있습니다. </li><li> 얼룩 버퍼의 200-300 μL에서 원심 분리하고 resuspend에 의해 두 번 세포를 씻으십시오. 세포는 이제 유동세포계측법에 의해 평가를위한 준비가되어 있습니다. </li><li> CFSE는 최적의 492 nm의에서 흥분 (아르곤 이온 레이저로)와 517 nm의에서 방출됩니다. IgG3 항체의 여기 및 발광 스펙트럼은 형광 염료 공액에 따라 달라집니다. </li></ol> 대표 결과 자기 강화에 따라 세포 현탁액은 분간 작은 원형 세포 (그림 1A)의 동질적인 인구처럼 보이게한다. 자극 48~72시간 후, 확대 proliferating 세포의 격리 클러스터 (그림 1B) 명확하게 볼 수 있습니다. 그들은 apoptosis를 받아야 같은 비 - proliferating 세포의 큰 비율은 작은 입상 나타납니다. 세포의 대부분 7 죽기 시작하기 전에 CSR은 일반적으로 자극 후 72 96시간 사이에서 가장 높은 수준에서 검색하실 수 있습니다. 이 단계에서, 세포는 나중에 딸 세포 인구에 나타나는 전환 세포와 세포 분열의 번호를받은 것입니다. CFSE 희석과 LPS의 자극 96 시간 후 IgG3의 표면 표현의 대표적인 흐름 cytometric 플롯은 그림 2에서 볼 수 있습니다. 표 1. 칵테일 스위칭 Isotype. 참고 : 흥분제 농도 값은 권장 사항입니다. Titrations가 필요할 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 원하는 Isotype </td><td> 자극 칵테일 </td></tr><tr><td> IgG1and IGE </td><td> LPS (25μg/mL)와 IL - 4 (10 NG / ML) </td></tr><tr><td> IgG1and IGE </td><td> 안티 CD40 (10μg/mL)와 IL - 4 (10 NG / ML) </td></tr><tr><td> IgG2a </td><td> LPS (25μg/mL)와 IFN - γ (10 NG / ML) </td></tr><tr><td> IgG2b 및 IgG3 </td><td> LPS (25μg/mL) </td></tr><tr><td> 이가 </td><td> LPS (25μg/mL), TGF - β (2 NG / ML)와 IL - 5 (1.5 NG / ML) </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 지라 분리 및 B 세포의 LPS의 자극. (A) 자기 (磁 气) LPS의 자극 전 지라 B 세포를 풍부하게. (B) 48시간 25 μg / LPS의 ML과 자극 후. Proliferating 세포 가공 및 apoptotic 세포의 배경에 클러스터로 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 96시간 후 확산 및 클래스 스위치 재조합. (A) LPS에 대한 CFSE 희석은 문화에 96시간 후 세포를 자극. 각각의 독립적인 피크는 독립적인 세포 분열에 대응하는 CFSE의 형광에 희석을 나타냅니다. (B) IgG3 표현은 세포 분열의 여러 순찰 다음 IgG3 긍정적인 인구의 출현을 보여주는.

<ol><li>Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+differentiation+and+isotype+switching+is+related+to+division+cycle+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number.</a> J Exp Med. 184, 277-281 (1996).</li>
<li>McCall, M. N., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+recombination+and+germ-line+transcription+are+division-regulated+events+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).</li>
<li>Manis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+links+DNA+damage-response+pathways+to+immunoglobulin+heavy+chain+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination.</a> Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).</li>
<li>de Yebenes, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-181b+negatively+regulates+activation-induced+cytidine+deaminase+in+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells.</a> J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).</li>
<li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li>
<li>Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNF8%2FRNF168+ubiquitin+ligase+cascade+facilitates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).</li>
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<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+class+switching+differs+among+SJL%2C+C57BL%2F6+and+129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice.</a> Int Immunol. 19, 545-556 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

위에서 설명한 프로토콜은 기본 murine B 세포의 클래스 스위칭하는 동안 보조 표현과 기능을 분석하기위한 표준 분석을 제공합니다. 자극 미디어에 수정이 다른 isotypes (표 1 8, 9에 요약)으로 전환 유도하기 위해 만들 수 있지만이 프로토콜은, IgM에서 IgG3로 전환 유발하는 박테리아 LPS를 사용합니다. 우리는 아직 알려지지 않은 이유로, 태아 송아지 혈청 클래스 체외에서 관찰 전환 수준에 영향을 미칠 수 있다고 지적했습니다. 그것은 같은 많은 번호가 실험 일관성을 보장하기 위해 모든 CSR 실험에 사용하는 것이 중요합니다. 또한 체외 스위칭 속도에 최적의 달성 소태아 혈청 소스 패널을 화면으로 도움이 될 수 있습니다. 마우스 변종은 또한 체외 10 본 클래스 스위칭의 정도에 영향을 줄 수 있습니다. 충분히 C57BL / 감지할 수있을 정도의 스위칭 속도를 달성 6 배경 backcross...

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염수(Phosphate Buffered Saline)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 마우스 B 세포 농축 키트(EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19754</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 튜브(Polystyrene tubes)</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 세포 증식 키트(CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit)</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>우송아지 혈청(Bovine Calf Serum)</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 배양 배지(RPMI 1640 Culture Medium)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; 유래 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharides)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum)</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>정상 마우스 혈청(Normal Mouse Serum)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>011-000</td><td></td></tr><tr><td>정제된 랫드 항-마우스 CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>랫드 항-마우스 IgG3(Rat Anti-Mouse IgG3)</td><td>BD Biosciences</td><td>553401</td><td></td></tr></tbody></table>

murine b 세포를 정화에 유도 및 클래스 스위치 재조합 평가

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

체액성 면역은 B 세포에 의해 유지 및 항체의 분비를 통해 중재 면역 시스템의 지점이다. B 세포 활성화되면 면역 글로불린 로커스는 바인딩 용량과 분비 항체의 이펙터 기능을 변경하는 유전자 수정 일련의를 겪습. 이 프로세스는 기본 IgM 항체의 isotype은 IgG, 이가, 또는 IGE 중 하나에 대체되는 클래스 스위치 재조합 (CSR)으로 알려진 게놈 재조합 이벤트로 강조 표시됩니다. 각 isotype되므로 면역의 유지 관리 CSR은 중요하고 독특한 이펙터 기능을 가지고 있습니다. 면역 글로불린 로커스의 다변화는 효소 활성 유발 cytidine deaminase의 (AID)에 의해 중재됩니다. 자세히이 과정을 설명하는 도식 동영상은 온라인 (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html)입니다. AID의 활동 및 CSR의 경로는 일반적으로 B 세포 기능과 마우스의 체액성 면역의 평가에서 공부하고 있습니다. 이 보고서에 제시된 프로토콜은 murine spleens와 클래스 (다른 항체 isotypes에 대한 표 1 참조) IgG3로 전환 유발하는 박테리아 lipopolysaccharide (LPS)와 후속 자극에서 B 세포 분리의 방법을 보여줍니다. 또한, 형광 세포 염색 얼룩 Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)를 자극 세포의 세포 분열, 스위칭 1, 2 isotype에 중요한 프로세스를 모니터하는 데 사용됩니다. 구호품과 CSR이 발생하는 메커니즘의 규정은 아직 불분명하고 있으므로 체외 클래스 스위치 assays 다양한 마우스 모델에서 이러한 프로세스를 테스트하기위한 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이러한 assays는 이전에 다음 ID로 녹아웃 마우스 3를 사용하여 유전자 결핍의 맥락에서 사용되었습니다. 또한, 관내는 B 세포의 스위칭 RNA의 분해 또는 transgene 표현 4-6에 의해 유전자 발현을 조절하는 바이러스 전달 앞에 수 있습니다. 실험 이러한 종류의 데이터는 구호 활동, CSR 반응의 해상도 및 마우스에서 항체 - 매개 면역에 대한 우리의 이해에 영향을합니다.

항원 노출에 따라 활성화된 B 세포의 subpopulations는 독특한 효과기 기능 항체 isotypes를 만들어 클래스 스위치 재조합 (CSR)으로 알려진 공정을 받고있다. 이 보고서에 제시된 프로토콜은 CSR을 유도하고 분석하는 방법을 설명합니다<em&gt; 체외에서</em&gt; B 세포 기능을 공부 목적.

Murine B 세포를 정화에 유도 및 클래스 스위치 재조합 평가

체액성 면역은 B 세포에 의해 유지되며 항체 분비를 통해 매개되는 면역 체계의 한 분야입니다. B 세포가 활성화되면, ...

체액성 면역 반응 동안, 항원에 의해 활성화된 B 세포는 반응이 진행됨에 따라 증식하고 항체를 분비합니다. 증식 및 클래스 전환(class switching)을 평가하기 위해 기본 IgM 항체 동형(isotype)이 더 다양한 IgG, IgA 또는 IgE 동형으로 대체됩니다. 자성 세포 분리법을 사용하여 실험용 마우스로부터 시험관 내(in vitro) 비장 B 세포를 분리합니다.세포는 증식 상태를 관찰하기 위해 형광 염료인 CFSE로 염색하며, 이러한 증식은 박테리아 L-P-S-L-P-S 처리로 인해 자극됩니다. L-P-S-L-P-S 자극은 증식과 더불어 IgG3 동형 단백질로의 클래스 전환 또한 유도하며, 이는 유세포 분석법으로 관찰할 수 있습니다. 오늘은 순수한 비장 B 세포를 분리하고 활성화하는 기술을 보여드리겠습니다. 이 기술은 인비트로(in vitro)에서 클래스 전환 재조합과 증식을 관찰하는 데 사용할 수 있으며, activation induced citing in deaminase의 기능 및 조절을 포함하여 B 세포 면역 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데에도 활용될 수 있습니다.안락사시킨 마우스를 70% ethanol에 담그는 것으로 시작합니다. 면역 체계가 완전히 성숙하도록 마우스의 연령은 8~12주여야 합니다. 멸균 가위를 사용하여 복부 왼쪽 늑골하 구역의 피부와 근육을 절개합니다. 가위나 포셉을 사용하여 인접 조직으로부터 비장을 적출합니다.다음으로, PBS 내에서 이를 세 개의 큰 조각으로 자릅니다. 그런 다음 1 mL 주사기 플런저의 고무 끝을 사용하여 비장을 70 µm 세포 스트레이너를 통해 PBS로 부드럽게 으깹니다. 이때 갈아내는 동작이 아니라 밀어내는 동작을 사용해야 합니다.마쇄 과정에서 크기가 큰 증식 세포가 파괴될 수 있으므로, 세포를 350 G 이하의 속도로 5분 동안 원심 분리합니다. 그 후 펠렛을 PBS에 재현탁합니다.멸균된 5 mL 폴리스티렌 튜브 내의 재현탁된 세포를 헤모사이토미터를 사용하여 계수하십시오. 5% 정상 쥐 혈청이 포함된 PBS에서 mL당 1 × 10⁸개의 세포 현탁액을 준비하십시오. 각 튜브에는 최대 2 mL까지 첨가할 수 있습니다.다음으로, 세포 1 mL당 50 µL의 EP negative selection Mouse B-cell enrichment cocktail을 추가합니다. 그 후 튜브의 캡을 닫고 냉장고에 15분 동안 보관합니다.세포 1 mL당 100 µL의 EP biotin selection cocktail을 첨가합니다. 튜브의 뚜껑을 닫고 냉장고에 넣어 15분 동안 보관합니다. biotin selection cocktail과 함께 배양한 후, EP magnetic nanoparticles를 혼합하여 세포 1 mL당 100 µL씩 첨가합니다. 혼합물을 파이펫팅하고 튜브의 뚜껑을 닫은 후 냉장고에 5분 동안 보관합니다.PBS를 사용하여 용액의 부피를 2.5 milliliters로 맞춘 다음, cept 마그넷에 5분 동안 둡니다. 마그넷 내의 튜브를 뒤집어 새로운 폴리스티렌 튜브에 빠르게 붓습니다. 음성 선택된 세포들이 튜브 벽에 자기적으로 결합되므로 튜브를 흔들지 마십시오. 세포 현탁액의 순도를 더욱 높이려면, 세포가 담긴 새 튜브를 마그넷에 5분 동안 둔 다음 다시 새 튜브에 붓습니다.이 단계에서 전체적인 세포 회수율이 감소할 수 있습니다. B 세포의 순도는 B 세포 표면 마커에 대한 유세포 분석으로 평가할 수 있습니다. 농축 후, 세포의 95% 이상이 B220 양성이어야 합니다.멸균된 dimethyl sulf oxide에 희석된 5 mM CFSE 염료 스톡 솔루션을 사용하여, 최종 농도가 mL당 100만 개 세포가 되도록 0.1% BSA가 첨가된 따뜻한 PBS에 분리된 세포를 재부유합니다. 튜브 내의 세포 mL당 2 µL씩 첨가합니다. CFSE는 자극된 세포의 세포 분열을 모니터링하는 데 사용됩니다.이소형 전환(isotype switching)에 필수적인 과정입니다. 일차 B 세포의 염색에는 10 micromolar의 최종 농도가 최적입니다. 37 degrees Celsius에서 10분 동안 암소 보관하여 배양합니다.CFSE는 빛에 민감하므로 가능한 한 암소 상태로 보관해야 함에 유의하십시오. 배양 후, 세포에 동일한 부피의 bovine calf serum을 첨가하고 얼음 위에서 배양하여 염색을 중지시킵니다. 세포 세척을 위해 5분 동안 배양액으로 튜브를 채우는데, bovine calf serum의 점성을 상쇄하고 세포 펠렛이 형성될 수 있도록 최소 5배 부피에 해당하는 배양액을 첨가한 후 350 G에서 원심분리하십시오. 배양액으로 세포를 두 번 더 세척하면, 이제 세포를 자극할 준비가 된 것입니다.RPMI 1640에 10% fetal bovine serum과 50 micromolar Beta-mercaptoethanol을 첨가하여 in vitro B-cell 배양 배지를 준비합니다. 다음으로, LPS를 최종 농도 50 micrograms per milliliter가 되도록 첨가하여 자극 배지를 준비합니다. 평저형 96 well 조직 배양 플레이트의 각 well에 자극 배지 125 microliters씩을 분주합니다.LPS가 포함되지 않은 배양액에서 CFS E로 염색된 B 세포를 최종 농도가 3.2 × 10⁶ cells/mL가 되도록 준비합니다. 세포 현탁액 125 µL를 자극 배지가 들어 있는 웰에 첨가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 이제 각 웰에는 최종 LPS 농도가 25 µg/mL인 상태로 400,000개의 세포가 포함됩니다.이는 세포 증식 및 클래스 전환(class switching)의 최적 수준을 제공합니다. 필요에 따라 이 값들을 조정할 수 있으나, 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 72~96시간 동안 배양하십시오. 48시간 후, 현미경으로 클래스 전환을 관찰하면 증식 중인 거대 B 세포 군집이 뚜렷하게 보일 것입니다.세포를 배양기에서 꺼내 비특이적 항체 염색을 방지하기 위해 1 mL의 염색 완충액으로 2회 세척합니다. 350 G에서 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 그다음 100 µL의 염색 완충액(5% 일반 마우스 혈청 및 세포 10^6개당 1 µg의 FC block 포함)에 세포를 재현탁하고, 세척 없이 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 세포 10^6개당 1 µg의 형광 표지 anti-US IgG three 항체를 첨가하여 얼음 위에서 30분 동안 배양한 후, 세포를 2회 세척하고 200~300 µL의 염색 완충액에 재현탁합니다.이제 세포를 유세포 분석기로 평가할 준비가 되었습니다. CFSE는 아르곤 이온 레이저에 의해 492 nanometers에서 최적으로 들뜨며 517 nanometers에서 방출됩니다. IgG 3 항체의 들뜸 및 방출 스펙트럼은 결합된 형광 염료에 따라 달라집니다.자기 농축 후, 세포 현탁액은 구분이 불가능한 작은 원형 세포들이 균일한 집단을 이룬 것처럼 보여야 합니다. 48~72시간의 자극 후에는 비대해진 증식 세포들이 고립된 클러스터 형태로 명확하게 관찰될 것입니다. 증식하지 않는 세포의 상당 부분은 세포 사멸(apoptosis)이 진행됨에 따라 작고 과립형으로 나타날 것입니다.CSR은 일반적으로 대부분의 세포가 사멸하기 시작하기 전인 자극 후 72시간에서 96시간 사이에 가장 높은 수준으로 검출될 수 있습니다. 이 단계에서 세포는 여러 번의 세포 분열을 거쳐야 하며, 전환된 세포가 후기 딸세포 집단에서 나타나야 합니다. 이러한 프로토콜을 따른 후, rna, AI 매개 유전자 넉다운과 같은 다른 기술을 사용하여 특정 유전자가 ID의 기능 및 클래스 전환 재조합 과정에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다.

induction-assessment-class-switch-recombination-purified-murine-b

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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MicroRNAs 받 클래스 스위치 DNA 재조합 및 플라즈마 세포 차별화에 B 세포 유도에서 mRNAs의 게놈 넓은 분석의 HDAC 억제제 중재 변조

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배우세요 마우스 비장 B 세포 분리 및 활성화를 통한 클래스 스위치 재조합 분석 방법입니다. 이 기술은 면역학 연구에서 항체 동형 전환과 세포 증식을 연구하는 데 활용됩니다.

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