식물 조직의 총 RNA 추출물에서 특정 MicroRNA를 검출하고 정량화하기 위한 Northern Blot

MicroRNA(miRNA)는 작고 단일 가닥 비암호화 RNA입니다. miRNA는 다중 단백질 복합체에 통합되고 상보적인 표적 mRNA 염기서열에 추가로 결합하여 유전자 발현을 부정적으로 조절합니다.

식물 조직의 전체 RNA에서 특정 miRNA를 검출하려면 추적 염료와 RNA 변성제인 포름아미드를 포함하는 겔 로딩 염료를 추가합니다. 샘플을 가열하여 RNA를 변성시키고 전기영동 전에 2차 구조 형성을 방지합니다.

샘플과 표준 RNA 마커를 사전 조립된 변성 폴리아크릴아미드 겔의 웰에 로드합니다. 전기영동을 실행하여 RNA 단편의 크기 기반 분리를 용이하게 합니다.

겔을 전기블로팅 카세트의 미리 적신 여과지에 옮깁니다. 완충액에 적신 나일론 블로팅 멤브레인을 젤 위에 정렬합니다. 그런 다음 미리 젖은 여과지를 쌓습니다. 전기 블로팅을 수행합니다.

전류는 miRNA를 포함한 음전하를 띤 RNA가 겔에서 양전하를 띤 나일론 멤브레인 표면으로 이동하도록 합니다. 멤브레인을 자외선에 노출시키십시오. 이것은 RNA를 막에 가교하여 RNA 손실을 방지합니다.

배경 소음을 줄이기 위해 비특이적 결합 부위를 차지하는 차단제를 포함하는 혼성화 완충액에서 멤브레인을 배양합니다.

표적 miRNA에 상보적인 방사성 표지된 RNA 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가하여 특이적으로 결합합니다. 완충액으로 멤브레인을 세척하고 결합되지 않은 프로브를 제거합니다.

형광체 이미징 시스템을 사용하여 방사성 혼성화 신호 강도를 검출하고 정량화할 수 있습니다. 고분해능 신호는 식물 조직에서 특정 miRNA 발현을 나타냅니다.