식물 조직의 총 RNA 추출물에서 특정 MicroRNA를 검출하고 정량화하기 위한 Northern Blot

젤의 사전 실행을 중지하십시오.

샘플을 적재하기 전에 우물을 철저히 세척하여 우물 내부의 요소 침전물을 제거하십시오. 재현탁된 RNA 샘플을 98도에서 1분 동안 가열합니다. 모세관 팁을 사용하여 샘플을 웰에 뜨겁게 로드합니다. 기포가 유입되지 않도록 합니다.

모든 샘플의 로딩을 완료하고 뚜껑을 조립합니다. 80볼트에서 3시간 동안 또는 브로모페놀 블루가 완전히 켜질 때까지 젤을 실행합니다. 전송을 위해 양전하를 띤 나일론 멤브레인을 사용하십시오. 유리판의 치수에 맞게 자릅니다. 오른쪽 상단 모서리에 있는 멤브레인에 레이블을 지정합니다. 멤브레인을 멸균된 Milli-Q 물 표면에 부드럽게 놓습니다. 라벨 면이 수면을 향하도록 아래쪽으로 놓으십시오.

깨끗한 쟁반을 가지고 전기 전달을 위해 젤 샌드위치를 준비합니다. 카세트의 회색 면을 아래로 놓습니다. 1X TBE를 카세트 레벨보다 약간 높게 붓습니다. 섬유 패드를 1X TBE에 미리 적시고 짜서 기포를 제거합니다. 압지 두 장을 섬유 패드 크기로 자릅니다.

압지 한 장을 1X TBE에 미리 적셔 섬유 패드 위에 놓습니다. 종이 위에 플라스틱 피펫을 굴려 기포를 제거합니다. 하나의 1X TBE에 다른 압지 조각을 미리 적셔 카세트 위에 놓습니다. 기포를 제거하기 위해 롤오버합니다. 이제 샌드위치 설정이 전기 전송을 위한 준비가 되었습니다.

전기 영동이 완료되면 실행을 중지하고 장치에서 뚜껑을 제거합니다. 설정에서 실행 중인 카세트를 제거합니다. 실행 중인 카세트에서 유리판을 꺼냅니다.

어셈블리에서 젤을 조심스럽게 제거합니다. 첫 번째로 로드된 RNA 샘플이 오른쪽을 향하도록 압지 위에 놓습니다. 미리 담근 멤브레인을 1X TBE에 부드럽게 담그고 라벨 면이 아래를 향하도록 젤 위에 놓습니다. 멤브레인과 젤이 건조되지 않도록 하십시오. 부드럽게 굴려 기포를 제거합니다.

압지 한 장을 1X TBE에 담그고 멤브레인 위에 놓습니다. 기포를 제거하십시오. 압지를 한 장 더 놓고 기포를 제거합니다. 어셈블리 위에 섬유 패드를 놓아 샌드위치를 완성합니다. 카세트를 단단히 닫으십시오.

트랜스블롯 카세트를 모듈에 놓습니다. 탱크에 1X TBE, pH 8.2를 블로팅 표시까지 채웁니다. 장치의 뚜껑을 닫고 10도에서 밤새 4 볼트 또는 추운 방에서 전송하십시오. UV cross-linker를 준비한 상태로 유지하고 electro-transfer가 완료되기 직전에 1,200으로 설정합니다.

전송이 완료되면 모듈에서 카세트를 제거합니다. 젖은 멤브레인을 A4 용지에 놓고 표시된 면을 위쪽으로 놓습니다. 120밀리줄에서 254나노미터 자외선을 조사하여 RNA를 멤브레인에 가교결합합니다. 상기 가교 블롯은 4도로 보관하거나 혼성화에 사용할 수 있다.

검출해야 하는 작은 RNA를 완전히 보완하는 프로브를 설계하고, PNK 효소를 사용하여 프로브의 5 프라임 말단에 라벨을 부착하고, 그림과 같이 구성 요소를 결합합니다. 반응 혼합물을 37도에서 30분 동안 배양합니다.

30분 배양 후 G-25 컬럼을 사용하여 반응 혼합물에서 라벨링되지 않은 프로브를 분리합니다. 프로브의 라벨링을 개선하려면 사용하기 전에 G-25 컬럼을 준비하십시오. RNA 면이 위를 향하도록 블롯을 혼성화 병 안에 넣습니다. 사용하기 전에 혼성화 완충액을 세게 혼합하십시오. 혼성화 완충액 10ml를 추가하고 교잡 용기를 교대와 함께 35도로 유지되는 혼성화 오븐 안에 넣습니다.

20-30분 동안 사전 하이브리드화를 수행합니다. 사전 교잡 후 오븐에서 병을 꺼냅니다. 라벨링된 프로브를 혼성화 버퍼에 부드럽게 추가합니다. 기포가 생성되지 않았는지 확인하십시오. 오븐 내부에서 35도에서 12시간 동안 회전하면서 블롯을 배양합니다.

혼성화 후 병에서 혼성화 완충액을 제거합니다. 세척 버퍼 I을 사용하여 얼룩을 빠르게 세척합니다. 이 단계는 블롯에서 과도한 혼성화 용액을 제거하기 위해 수행됩니다. 또한, 세척 버퍼 I을 사용하여 35도에서 30분 동안 블롯을 배양합니다.35도에서 버퍼 II를 사용하여 30분 동안 다시 세척합니다.

얼룩을 씻어낸 후 혼성화 커버 내부에 넣고 여분의 버퍼를 제거하고 밀봉합니다. 카세트 안에 넣고 방사선이 없는 형광체 이미저 화면에 12시간 동안 노출시킵니다. Typhoon Biomolecular Imager를 사용하여 혼성화 신호를 감지하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다.