Name: 전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 배우세요 Drosophila 배아의 전체 마운트 신경계 시각화 방법을. 면역형광 현미경을 활용하여 배아 신경 구조를 관찰하고 발달 과정에서 유전자 돌연변이의 역할을 연구할 수 있습니다.

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SG는 버팔로의 뉴욕 주립 대학에서와 존 R. Oishei 재단 기금에 의해 지원됩니다.

1. 시약의 준비 <ol><li> 100mM 파이프, 2mM EGTA, 1 MM MgSO 4를 사용 PEMFA 버퍼를 준비합니다. 7.0 버퍼의 산도를 조정합니다. PEMFA 버퍼는 필터 소독과 4 ° C.에 저장됩니다 </li><li> 중 1ml를 추가하여 PBT를 준비 트리톤 X - 100 100ml 1X PBS (인산이 살린 버퍼) (산도 7.0). 4 스토어 ° C. </li><li> 1X PBS (산도 7.0)에 0.01 % NaAcide와 5% BSA를 (소 혈청 알부민) 준비합니다. </li><li> 0.7 % NaCl 및 0.03 % 탈이온수에서 트리톤 X - 100을 사용하여 생리 식염수를 준비합니다. </li><li> 한 부분은 37 % 포름 알데히드 4 개 부품 PEMFA 버퍼를 결합하여 정착액을 준비합니다. </li></ol> 2. 태아 수집 <ol><li> 한천 먹이 플레이트와 어댑터를 포함한 플라스틱 병 속에&gt; 100 파리를 배치하여 관심 Drosophila 변형에 케이지를 준비합니다. </li><li> 파리가 케이지에 acclimated하고 그들의 계란을 보유하지 않게, 접시마다 8-12시간을 변경, 72 시간 동안 실온에서 어둠 속에 파리의 새장을 둡니다. </li><li> 실험은 12 시간 동안 배아를 수집하십시오. 컨테이너에서 페트리 접시를 제거하고 교체합니다. 삭제 페트리 접시를 가지고 생리 식염수와 깨끗한 페인트 브러쉬를 사용하여 요리에서 배아를 씻으십시오. </li><li> 훌륭한 체에서 배아를 수집합니다. 초과 누룩을 제거하는 호수와 린스. </li><li> 주걱을 사용하면 부드럽게 배아를 선택하고 모자와 작은 유리관에서 그들을 놓으십시오. 생리 식염수의 1ml에 대해 추가합니다. </li></ol> 3. Chorion 및 Vitelline 점막의 제거 및 고정 <ol><li> 배아의 수집에 따라 50 % 헵탄 50 %의 정착액 결합하여 헵탄 - 수정 솔루션을 준비합니다. 솔루션은 상단과 하단에 정착액에 헵탄와 계층 것입니다. </li><li> 유리관에 5 분 동안 생리 식염수에서 그들을 잠복기로 배아를 씻으십시오. 파스퇴르 피펫을 사용하여 여분의 호수를 제거합니다. </li><li> 탈이온수와 배아를 씻어. </li><li> 3 분 50 % 표백제에서 그들을 잠복기로 배아를 Dechorionate. </li><li> 탈이온수로 철저하게 배아를 씻어. </li><li> 부드러운 흔들림과 헵탄 - 수정 솔루션 30 분 동안 그들을 잠복기로 배아를 수정. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하면 메탄올이 튜브에서 헵탄를 떠나있는 정착액 (하단 레이어)를 대체합니다. vitelline 막을 제거하기 위해 적극적으로 흔들어. devitellinized 배아는 튜브의 바닥에 싱크 것입니다. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 새 유리관에서 배아를 수집합니다. 태아에게 메탄올이있는 5 번 린스, 각 시간 5 분 동안 태아를 품어. </li></ol> 4. 항체 스테 이닝, 마운트, 그리고 시각화 <ol><li> 50% PBT 솔루션과 5 분 50 % 메탄올의 혼합물에서 배아를 Rehydrate. 그렇다면 5 분 백퍼센트 PBT 솔루션 rehydrate. </li><li> 4 1 시간 0.01 % NaAcide 솔루션 ° C.와 함께 5 % BSA에서 그들을 잠복기로 배아를 차단 </li><li> 배아 지금 항체 염색법에 대한 준비가되어 있습니다. 0.01 % NaAcide 솔루션 5 % BSA를 사용하여 적절한 농도로 diluting하여 기본 항체를 준비합니다. 우리는 시스테인 문자열 단백질 (CSP), 기공을 갖는 시냅스 단백질과 표면 glycoproteins와 라벨 모든 뉴런에 존재의 연결을 특정 - 탄수화물 잔기를 인식 방지 HRP 또는 말 무 퍼옥시데이즈 항체, 대한 항체를 사용합니다. </li><li> 4 밤새 배아 ° C 기본 항체 솔루션 인치를 품어 </li><li> 다음 날, 시간의 과정을 통해 PBT와 배아 10 번 씻으십시오. </li><li> 적절한 농도를 diluting하여 이차 항체 솔루션을 준비합니다. 우리는 1:200의 농도에 알렉사 차 항체를 사용합니다. </li><li> 4 두 시간 동안 태아를 품어 ° C 보조 항체 솔루션 인치 </li><li> 시간의 과정을 통해 태아에게 PBT 10 번 씻으십시오. </li><li> Vectashield 장착 매체 하룻밤 배아를 품어. </li><li> 유리 슬라이드에있는 배아를 탑재하고 매니큐어로 커버 슬립을 봉쇄. 형광 현미경을 사용하여 배아를 시각화. </li></ol> 5. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1a.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1b.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> HRP - FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1c.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 병합 그림 1 : CSP (적색)와 HRP (녹색)에 대한 항체를 사용하여 스테이지 16-17에서 배아 CNS를 보여주는 대표 이미지. 접합면의 별개의 얼룩을 확인합니다. <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2a.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2b.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> HRP - FITC "/&gt; 병합 그림 2 : CSP (적색)와 HRP (녹색)에 대한 항체를 사용하여 스테이지 16-17에서 배아 PNS를 보여주는 대표 이미지. 주변 뉴런의 반복 패턴을합니다.

<ol><li>Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+sensory+organs+by+mutations+of+the+cut+locus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster.</a> Cell. 51, 293-307 (1987).</li>
<li>Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+of+the+peripheral+nervous+system+in+Drosophila+embryos%3A+DNA+replication+patterns+and+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages.</a> Neuron. 3, 21-32 (1989).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Carroll, S. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+fushi+tarazu+protein+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis.</a> Cell. 43, 47-57 (1985).</li>
<li>Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+connections+between+imaginal+discs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle connections between imaginal discs in Drosophila.</a> Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Drosophila의 배아가의 연결을 개발하는 동안 세포와 분자 변화를 조사위한 강력한 시스템입니다. 이 프로토콜에서는 immunohistochemistry에 대한 전체 마운트 배아를 준비하는 방법을 증명하고있다. 우리는 캐롤과 스콧, 1985 년 설명된 프로토콜에서이 프로토콜을 적응있다. 이 프로토콜은 다른 항체의 연결을 테스트하는 적응 될 수 있지만, 항체의 최적화 할 수 있습니다. 또한, 배아 PNS와 CNS의 발달 결함 다른 돌연변이 라인에서 배아를 비교하여 쉽게 시각하실 수 있습니다. 우리는 성공적으로 모터 단백질 돌연변이 들고 태아의 PNS와 CNS를 시각화하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 높은 배율에서 우리는 또한 배아 PNS와 CNS 내에서 axonal 트랙을 평가했습니다.

<table><tbody><tr><td>37% formaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-25</td><td></td></tr><tr><td>CSP</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>323-095-021</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 마운팅 매질</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 drosophila 태아

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Drosophila의 배아가의 연결을 발전의 세포 및 분자 기초를 조사하는 매력적인 모델 시스템입니다. 여기의 연결을 단백질에 항체를 사용하여 Drosophila 배아 신경 시스템의 시각화를위한 절차를 설명합니다. 전체 배아 주변 신경 및 중추 신경 시스템이 잘 개별 세포 수준 (..; Bodmer 외, 1987;. Dambly - 쇼디에르 외, 1986 Bodmer 외, 1989)에서 특징 때문에, 이러한 시스템에 어떤 aberrations 수 쉽게 다른 단백질의 연결을하기 위해 항체를 사용하여 식별됩니다. 개발 배아는 배아는 시각화에 대한 적절한 발달 단계에 있는지 확인하기 위해 특정 시간에 수집하고 있습니다. 수집 후, 배 (胚)의 바깥쪽 레이어, chorion 막과 배아를 둘러싼 vitelline 봉투가 고정되기 전에 제거됩니다. 배아는 다음의 연결 항체와 incubated하고 찬란 레이블 차 항체를 사용하여 시각입니다. 단계에서 배아가 12-17 배아 신경 시스템에 액세스할 시각입니다. 12 단계 CNS의 배아 밴드 단축을 시작하고 단계 15 일까지 접합면의 확실한 패턴이 달성되었습니다. 단계 17으로 CNS 계약 및 PNS는 완전히 (캄포스 - 오르테가 외. 1985) 개발되고 있습니다. 따라서 PNS와 CNS의 패턴의 변화는 쉽게 이러한 발달 단계 동안 볼 수 있습니다.

우리는 개최 준비하는 절차를 설명<em&gt; Drosophila</em&gt; embryogenesis 동안 배아 신경 시스템의 시각화를위한 배아.

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

초파리 배아는 신경세포 발달의 세포 및 분자적 기초를 연구하기 위한 매력적인 모델 시스템입니다. 본 논문에서는 ...를 설명합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 신경계의 전체 마운트 시각화를 위해 oph 및 melanogaster 배아를 준비하는 것입니다. 이는 먼저 관심 있는 초파리 계통에서 배아를 수집함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 표백제로 외막(corium)을 제거하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 헵탄과 메탄올을 처리하여 빌린 막을 제거하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 배아에 항체를 처리하는 것입니다. 최종적으로 면역형광 현미경을 통해 초파리 배아 신경계의 구조를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 발달 중인 신경계에서 돌연변이가 어떤 역할을 하는지와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 배아를 바이알 밖으로 실수로 배출하여 어려움을 겪을 수 있습니다. P-E-M-F-A, 0.01% sodium azide가 포함된 5% BSA PBC 완충액 식염수 및 포름알데히드 고정액을 포함하여 필요한 시약을 준비함으로써 이 프로토콜을 시작하십시오.이산화탄소로 초파리를 마취시킨 후, 사과 주스 한천 먹이 배지가 포함된 어댑터가 장착된 플라스틱 병에 관심 있는 초파리 계통의 개체를 최소 100마리 옮겨 넣어 케이지를 준비합니다. 초파리가 들어 있는 케이지를 실온의 암소에 72시간 동안 둡니다. 초파리가 케이지에 적응하고 실험을 위해 산란을 지연시키지 않도록 사과 주스 한천 먹이 배지를 8~12시간마다 교체합니다.72시간의 적응 기간 후, 사과즙 한천 먹이 플레이트의 마지막 교체 시점으로부터 12시간 뒤에 배아를 수집하십시오. 산란 케이지에서 사과즙 한천 먹이 플레이트를 제거하고 생리 식염수로 교체하십시오. 사과즙 한천 먹이 플레이트를 헹궈내십시오.배아를 미세 체에 수집합니다. 깨끗한 페인트 브러시를 사용하여 플레이트에 붙어 있는 배아를 모두 떼어냅니다. 체에 담긴 배아를 식염수로 헹궈 과도한 효모를 제거합니다. 스패튤러를 사용하여 배아를 조심스럽게 집어 작은 유리 바이알에 넣습니다.식염수를 약 1 mL 추가합니다. 그다음 바이알의 캡을 닫고 5분 동안 배양하여 배아를 세척합니다. 이어서 배아를 수집합니다.50% 헵탄과 50% 고정액을 혼합하여 헵탄 고정 용액을 준비합니다. 이 용액은 상층에 헵탄이, 하층에 고정액이 층을 이루게 됩니다. 5분이 지난 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아가 들어 있는 유리 바이알에서 과잉 식염수를 제거합니다.배아가 들어

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Drosophila melanogaster의 애벌레가 애벌레 segmental 신경 이내 axonal 수송의 메커니즘을 조사하기 위해 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 이 절차를 사용하여 다양한 변이를 갖고 제 3 instar의 애벌레는 야생 타입 애벌레 비교할 수 있습니다.

3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 차 Instar Drosophila 애벌레 준비

여기 스테인드에 대한 마운트 프로토콜을...

의 입식 이미징 Drosophila 태아

출처: Jeong, S. Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 초파리 배아에서 축삭돌기의 시각화를 보여줍니다. 운동 뉴런의 면역 라벨링, 뉴런 구조를 드러내기 위한 정확한 해부, 미분 간섭 대비 현미경을 통해 축삭 돌기 패턴을 강조하는 상세한 뉴런 구조를 총체적으로 보여줍니다.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila (초파리에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴의 시각화)

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

우리는 해부, 고정, 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하는 초파리 유충과 성인 여성의 steroidogenic 장기의 면역 염색을위한 프로토콜을 설명합니다. steroidogenic 기관뿐만 아니라, 우리는 배아 줄기 세포로 steroidogenic 기관의 신경 분포뿐만 아니라 steroidogenic 표적 세포를 시각화.

과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

이 프로토콜은 이미징을 위해 유충 및 성체 초파리 시신경엽을 준비하는 세 가지 단계인 1) 뇌 절개, 2) 면역조직화학, 3) 장착을 설명합니다. 3단계에 중점을 두었는데, 이는 특정 시신경엽 구조를 시각화하기 위해 뚜렷한 장착 방향이 필요하기 때문입니다.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization(시신경엽 시각화를 위한 유충 및 성체 초파리 뇌의 해부, 면역조직화학 및 마운팅)

여기서, 우리는 후기 배아 초파리 남성 생식선을 생생하게 이미지화하는 데 필요한 해부 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 정상적인 조건 하에서 또는 트랜스제닉 또는 약리학적 조작 후에 동적 세포 과정의 관찰을 허용할 것이다.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

배우세요 Drosophila 배아의 전체 마운트 신경계 시각화 방법을. 면역형광 현미경을 활용하여 배아 신경 구조를 관찰하고 발달 과정에서 유전자 돌연변이의 역할을 연구할 수 있습니다.

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

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