전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

이 실험 절차의 전반적인 목적은 신경계의 전체 마운트 시각화를 위해 oph 및 melanogaster 배아를 준비하는 것입니다. 이는 먼저 관심 있는 초파리 계통에서 배아를 수집함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 표백제를 사용하여 외막(corium)을 제거하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 헵탄과 메탄올을 처리하여 빌린 막(vilin membrane)을 제거하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 배아에 항체를 처리하는 것입니다. 최종적으로 면역형광 현미경을 통해 초파리 배아 신경계의 구조를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 돌연변이가 발달 중인 신경계에서 어떤 역할을 하는지와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 바이알에서 배아를 실수로 파이펫으로 옮길 수 있어 어려움을 겪을 수 있습니다. P-E-M-F-A, 0.01% sodium azide 식염수가 포함된 buffer PBC 5%BSA 및 formaldehyde 고정액을 포함하여 필요한 시약을 준비함으로써 이 프로토콜을 시작하십시오.

이산화탄소로 초파리를 마취시킨 후, 사과 주스 한천 먹이 플레이트가 있는 어댑터가 장착된 플라스틱 병에 최소 100마리의 파리를 옮겨 관심 있는 초파리 계통을 위한 케이지를 준비합니다. 파리가 든 케이지를 실온의 어두운 곳에 72시간 동안 둡니다. 파리가 케이지에 적응하고 실험을 위해 알을 보유하지 않도록 8~12시간마다 사과 주스 한천 먹이 플레이트를 교체합니다.

72시간의 순화 기간 후, 사과즙 한천 먹이 플레이트의 마지막 교체 시점으로부터 12시간 후에 배아를 수집합니다. 산란 케이지에서 사과즙 한천 먹이 플레이트를 제거하고 생리식염수로 교체합니다. 사과즙 한천 먹이 플레이트를 헹굽니다.

배아를 고운 체에 수집합니다. 깨끗한 페인트 붓을 사용하여 플레이트에 붙어 있는 배아를 모두 떼어냅니다. 체에 담긴 배아를 식염수로 헹구어 과도한 효모를 제거한 후, 스패튤라를 사용하여 배아를 조심스럽게 집어 작은 유리 바이알에 넣습니다.

생리식염수를 약 1 mL 추가합니다. 그 다음 바이알의 캡을 닫고 5분 동안 배양하여 배아를 세척합니다. 이어서 배아를 수집합니다.

50% 헵탄(heptane)과 50% 고정액(fixative)을 혼합하여 헵탄 고정 용액을 준비합니다. 이 용액은 상층에 헵탄이, 하층에 고정액이 층을 이루게 됩니다. 5분 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아가 들어있는 유리 바이알에서 과잉 식염수를 제거합니다.

배아가 들어 있는 유리 바이알에 탈이온수를 약 1mL 가하여 배아를 헹굽니다. 배아를 1분 동안 그대로 둔 후, 물을 제거하고 50% 표백액을 넣습니다. 바이알을 손으로 몇 번 흔든 다음, 배아 표면이 코팅되도록 3분 동안 배양합니다.

처리된 배아는 바이알 바닥으로 가라앉습니다. 배아 COR은 표면에 뜹니다. 3분간의 배양 후 표백제와 COR을 제거하십시오.

염색 후, 배아가 담긴 유리 바이알에 탈이온수를 약 1mL 첨가하여 배아를 충분히 헹굽니다. 물을 제거하기 전 배아 상태로 1분 동안 둡니다. 이때 남은 COR들은 부유하므로 이를 제거해야 합니다. 배아에 헵탄 고정액을 첨가하고, 가볍게 흔들어주며 30분 동안 배양하여 고정합니다.

파스타 피펫을 사용하여 하층의 고정액을 제거하고, 튜브에 헵탄만 남깁니다. 그 후, 고정액이 있던 튜브 바닥에 메탄올을 다시 채우고 튜브 캡을 닫은 뒤 손으로 강하게 흔들어 난황막을 제거합니다. 이 단계가 끝나면 껍질이 제거된 배아들이 튜브 바닥으로 가라앉습니다.

파스퇴르 피펫을 사용하여 바이알에서 메탄올과 배아를 제거하고 탈이온화된 배아만 남깁니다. 그런 다음 메탄올로 배아를 5회 헹구며, 매 헹굼 단계 사이에 파스퇴르 피펫으로 메탄올을 제거합니다. 각 헹굼 단계마다 배아를 5분 동안 배양합니다.

배아를 50% PBT 용액과 50% methanol 혼합액에 5분 동안 담가 재수화합니다. 그 후, 배아를 100% PBT 용액으로 옮겨 5분 동안 재수화 과정을 계속합니다. 다음으로, 0.01% sodium azide가 포함된 5% BSA 용액에서 4°C로 1시간 동안 배아를 인큐베이션하여 블로킹합니다.

다음으로, 0.01% Sodium azide가 포함된 5% BSA 용액을 사용하여 1차 항체를 적절한 농도로 희석하여 배아 염색용 항체를 준비합니다. 여기에서 사용된 항체는 vesicular cysteine string protein에 대한 항체와 anti HRP 항체입니다. Anti HRP는 표면 당단백질에 존재하는 신경 특이적 탄수화물 잔기를 인식하여 모든 뉴런을 표지합니다.

배아를 1차 항체 용액에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 1시간에 걸쳐 PBT로 배아를 10회 세척합니다. 배아가 들어 있는 유리 바이알에 PBT 약 1 mL를 넣고, PBT를 제거하기 전까지 6분 동안 그대로 둡니다.

PBT 도포, 인큐베이션 및 PBT 제거 과정을 10회 반복합니다. 2차 항체 용액은 빛에 민감하므로 적절한 농도로 희석하여 암소에서 준비합니다. 본 실험에서는 1:200 농도의 Alexa 2차 항체를 사용합니다.

배아를 2차 항체 용액에 넣고 4°C에서 2시간 동안 배양합니다. 빛 노출을 피하기 위해 배아와 2차 항체 용액이 담긴 유리 바이알을 알루미늄 호일로 감쌉니다. 1시간에 걸쳐 PBT로 배아를 10회 세척합니다.

배아에 vector shield 마운팅 용액을 추가하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양하여 마운팅합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 마운팅 용액과 함께 배아를 흡입합니다. 배아와 용액을 유리 슬라이드 위에 도포합니다.

배아 위에 커버슬립을 덮고 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다. 형광 현미경을 사용하여 배아를 관찰합니다. 배아의 CNS는 stage 16에서 17 단계의 모습이 나타납니다.

Cystine string 단백질은 빨간색으로 표시되었습니다. HRP 뉴런은 녹색으로 표시되었습니다. 이 대표 이미지에서 교차연합(commissure)의 뚜렷한 염색 양상에 주목하십시오.

배아 PNS의 16~17단계 모습입니다. 여기서도 cystine string 단백질은 빨간색으로, 뉴런은 녹색으로 표시되었습니다. 말초 뉴런의 반복적인 패턴에 주목하십시오.

이 절차를 시도할 때, 배아가 바이알에서 실수로 제거되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 신경계의 전체 마운트 시각화를 위해 oph fla 배아를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.