RNA 함유 Oligonucleotides를 사용하여 변환하여 게놈 DNA에서 RNA / DNA 하이브리드의 생성

다음 실험의 전반적인 목표는 효모 세포를 올리고를 함유한 RNA로 변형시켜 살아있는 효모 세포의 염색체 수준에서 R-N-A-D-N-A 하이브리드를 생성하는 것입니다. 이는 올리고를 포함하는 단일 가닥 RNA를 분열하는 효모 세포에 도입함으로써 달성됩니다. 그런 다음 올리고는 효모 염색체에 위치한 돌연변이 마커 유전자의 상보적 영역과 무릎을 꿇고 올리고를 포함하는 RNA에 의해 형질전환된 세포가 선택적 배지에 플레이팅됨에 따라 R-N-A-D-N-A 하이브리드를 형성합니다.

이를 통해 올리고의 RNA 부분이 돌연변이 마커 유전자의 교정을 위한 주형 역할을 하는 세포의 성장을 가능하게 합니다. 다음으로, 올리고를 포함하는 RNA에 의한 유전자 교정 빈도를 확인하기 위해 선택적 배지에서 성장하는 효모 군집이 얻어지며, 이는 올리고의 RNA 관에서 효모 게놈의 돌연변이 마커 유전자로의 유전 정보 전달을 나타냅니다. 이는 제한, 분해 분석, 염기서열 분석 및 알칼리 책임 분석에서 분명합니다.

안녕하세요, 저는 조지아 공과 대학 생물학 대학의 프란체스카 박사 연구실의 HIN 설립자입니다. 오늘은 살아있는 효모 세포의 염색체 수준에서 R-N-A-D-N-A 하이브리드를 생성하는 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 게놈 DNA에 내장된 RNA의 존재가 세포에서 어떻게 허용되는지 연구하고 생체 내 R-N-A-D-N-A 하이브리드 안정성에 영향을 미치는 요인을 결정합니다.

시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 전에 올리고 튜브, 피펫, 와류 랙, 실험 영역 및 연구자가 RNA 오염 제거 용액으로 착용한 장갑을 포함하여 실험에 사용할 모든 재료를 닦습니다. 잠재적인 RNA 오염을 제거하려면 절차 전반에 걸쳐 RNA 자유수, 화학 시약, 튜브 및 피펫 팁을 사용하십시오.

효모 세포의 게놈 DNA로 유전 정보를 전달하기 위해 올리고를 포함하는 RNA를 얻습니다. 여기에 사용된 효모 균주는 2개의 기반 결실과 1개의 말도 안 되는 돌연변이를 가진 돌연변이 트립 5개의 유전자를 포함하고 있습니다. 이러한 효모 균주는 트립토판 위축성 돌연변이체이며 트립토판이 없는 배지에 콜로니를 형성하지 않습니다.

올리고를 함유하는 RNA는 결실 돌연변이를 교정하도록 설계된 두 개의 기반 DNA 삽입이 있는 65 MER입니다. 또한, 올리고는 트립 5 대립유전자의 넌센스 돌연변이를 교정하기 위해 1개의 리보뉴클레오티드를 가지며, 일단 얻어지고, 올리고를 포함하는 RNA를 서면 프로토콜에 기재된 바와 같이 250 마이크로몰 스톡 용액으로 준비합니다. 올리고를 함유한 RNA로 형질전환 16시간 전에 접종합니다.

5 밀리리터의 풍부한 효모 펩타이드 포도당 또는 YPD 액체 배지를 사용하여 5 개의 돌연변이 효모 세포를 트립하고 하룻밤 동안 섭씨 30도에서 세포를 성장시킵니다. 하룻밤 배양 후 1.5ml의 하룻밤 배양을 50ml의 YPD 액체 배지로 옮깁니다. 형질전환이 해동되기 직전 4시간 동안 섭씨 30도의 쉐이커에서 분당 225회 회전하며 세포를 배양합니다.

올리고와 해당 DNA를 포함하는 RNA는 얼음 위의 올리고만 있습니다. 해당 DNA 전용 올리고가 양성 대조군으로 사용됩니다. 올리고를 RNA 자유 튜브에 RNA 자유 물로 50 마이크로 몰로 희석합니다.

각 올리고를 70 마이크로 리터로 준비하여 약간의 과잉 변성으로 1 mol의 3 회 변형에 충분한 샘플을 허용하고, RNA 및 DNA 만 올리고를 섭씨 100도 열 블록에서 2 분 동안 수행하여 변성 직후 올리고의 2 차 구조를 제거합니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 변형될 때까지 그대로 두십시오 RNA가 없는 튜브에서 형질전환 직전에 용액 1과 용액 2를 준비합니다. 세포 배양액을 50 millilit RNA free tube로 옮기고 2분 동안 중력의 1, 562배에 해당하는 분당 3000회 회전으로 회전합니다.

supinate를 제거하고 50ml의 RNA 자유수로 세포를 세척합니다. 2분 동안 분당 3000회 회전하면서 셀을 다시 회전합니다. 이 과정을 5회 반복하여 배양 배지와 최종 스핀 후 존재할 수 있는 RN ai를 제거합니다.

supinate를 제거하고 5ml의 용액에 세포를 다시 현탁시킵니다. 1. 샘플을 2분 동안 분당 3000회 회전시키고, 상등액을 버리고 250마이크로리터의 용액 1을 세포에 추가합니다. 이 양의 세포는 7-8개의 변형에 충분합니다.

50마이크로리터의 세포 현탁액을 7개의 RNA가 없는 마이크로 원심분리 튜브 각각에 분취합니다. 다음으로, 올리고를 포함하는 50마이크로몰 RNA 중 20개를 3개의 튜브에 추가합니다. 20마이크로리터의 50마이크로몰 DNA는 3개의 튜브에 올리고만 있고 1개의 튜브에 음성 대조군을 위한 올리고가 없는 20마이크로리터의 멸균수.

그런 다음 7개의 변형 반응 각각에 대해 300마이크로리터의 용액 2를 추가합니다. 성분을 혼합하기 위하여 표본을 격렬하게 소용돌이치십시오. 형질전환 반응을 섭씨 30도에서 30분 동안 배양 후 셰이커에서 배양합니다.

샘플을 섭씨 42도에서 15분 동안 열 충격을 가합니다. 그런 다음 4 분 동안 2, 236 배 중력에 해당하는 분당 5, 000 회전으로 셀을 스핀 다운합니다. SUP 제제를 제거하고 3개의 튜브 중 많은 부분에 대해 100마이크로리터의 멸균수에 세포를 재현탁합니다.

이 세포 현탁액의 분취액을 취하고 각 분취액을 멸균수로 100, 000 배로 희석하십시오. 플레이트 당 약 15 개의 멸균 유리 구슬을 추가하고 3 개의 YPD 플레이트에 100, 000 겹의 희석 된 세포 중 100 마이크로 리터를 플레이트합니다. 트립토판이 없는 완전한 합성 매체의 페트리 접시 하나에 각 형질 전환 반응으로 인한 재현탁 세포 100마이크로리터를 플레이트하고 플레이트를 균일하게 흔듭니다.

그런 다음 구슬을 제거합니다. 섭씨 30도의 YPD 플레이트에서 세포를 2일 동안 배양하고 섭씨 30도에서 트립토판이 없는 합성 완전 고체 배지에 도금된 세포를 4-5일 동안 배양합니다. 선택적 배지와 YPD 배지에서 성장한 콜로니의 수를 계산하고 비교하여 올리고를 포함하는 RNA의 유전자 교정 빈도를 계산하고, 올리고만 있는 RNA와 올리고가 없는 대조군의 유전자 교정 빈도를 계산합니다.

세포에 올리고가 추가되지 않을 때 선택적 배지에서 모든 콜로니 형성이 예상되지 않으며, 무작위로 선택된 여러 형질전환된 콜로니를 YPD 배지에 줄무늬를 만들어 단일 콜로니 분리물을 얻습니다. 군체 성장을 위해 섭씨 30도에서 이틀 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 여러 개의 단일 군체를 선택하고 YPD 및 선택적 배지에 패치를 만듭니다.

올리고로 형질전환된 세포에 대해 1일 배양 성장 후 트립토판이 없는 합성 완전 고체 배지가 관찰되지만, 트립토판이 없는 선택적 합성 완전 고체 배지에서 올리고 대조군이 없는 균주에 대해서는 관찰되지 않습니다. 다음으로, 콜로니 PCR을 시작하기 위해 콜로니 PCR을 사용하여 올리고를 포함하는 RNA가 타겟하는 영역을 증폭하는 한 쌍의 프라이머를 설계합니다. 개별 패치에서 채취한 세포를 1단위의 리아아제를 함유한 50마이크로리터의 물에 재현탁탁하고, 샘플을 실온에서 10분 동안 배양한 후, 섭씨 100도의 가열 블록에서 5분 동안 배양하여 세포를 파괴하고 게놈 DNA를 용액으로 방출합니다.

PCR 튜브에서 PCR 반응을 준비하고, 설정된 각 튜브에 10마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하고 서면 프로토콜에 설명된 대로 증폭 반응을 수행합니다. 결과 샘플을 1% arose gel에서 실행하여 PCR 산물을 관찰합니다. 본 실험에서 올리고를 함유하는 RNA에 의해 전달된 유전정보는 효모 유전체 타겟 영역에 새로운 VAN 91 1 제한 부위를 생성하기 때문에 VAN 91 1 제한 효소로 PCR 산물을 분해하여 정보의 올바른 전달을 확인할 수 있습니다.

6마이크로리터의 PCR 산물 완충액 BSA 0.5마이크로리터, 제한 효소 0.5마이크로리터 및 멸균수(15마이크로리터)를 포함하도록 분해 반응을 설정합니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 2%arose gel의 동일한 행에서 분해된 샘플과 함께 undigest sample을 실행하여 oligo를 포함하는 RNA의 RNA tract에 의해 전달되는 유전자 변형을 관찰합니다.

PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제하고 DNA 염기서열분석을 위해 준비합니다. 제품을 증폭하는 데 사용된 것과 동일한 프라이머로 염기서열분석을 위해 샘플을 제출합니다. 마지막으로, 선택한 참조 염기서열과 여러 염기서열을 정렬할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 DNA 염기서열 분석 결과를 분석하여 올리고를 포함하는 RNA의 1몰 또는 DNA만 올리고를 1.5ml 튜브에 넣는 동안 각 반응에 대해 올리고를 포함하는 RNA의 알칼리 처리를 수행합니다.

그런 다음 가수분해를 위해 1몰 수산화나트륨 4마이크로리터를 추가하거나 음성 대조를 위해 4마이크로리터의 물을 추가합니다. 배양 후 1시간 동안 섭씨 65도의 수조에서 샘플을 배양합니다. 반응을 얼음으로 옮깁니다.

음성 제어를 위해 1.2 몰 염산 2 마이크로 리터, 1 몰 트리스 염산염 4 마이크로 리터 및 4 마이크로 리터의 물로 가수 분해 반응을 중화합니다. 6 마이크로 리터의 물과 4 마이크로 리터의 1 몰 트리스 하이드로 클로라이드를 추가합니다. 변형이 수행될 때까지 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.

방금 설명한 바와 같이, 올리고가 없는 형질전환된 효모 세포는 트립토판 팬이 없는 합성 완전 고체 배지에 어떠한 콜로니도 형성하지 않습니다. 반대로, 세포가 올리고를 함유한 RNA의 1올레로 형질전환된 후 트리토판이 없는 합성 완전 고체 배지에서 성장한 세포. 이제 식민지를 보여줍니다.

효모 콜로니는 또한 세포가 상응하는 DNA의 1나노몰로 형질전환된 후, 트리토판 없이 완전한 합성 고체 배지에서 성장하며, 올리고를 함유하는 RNA에서 효모 염색체 DNA로의 유전 정보 전달의 검출은 VAN 91 1 PCR 산물의 제한 소화에 의해 명백하며, 여행의 PCR 산물을 보여준 바와 같이 표적 게놈 영역을 증폭합니다. 여행의 게놈 DNA에서 증폭된 5개의 유전자 자리. 5 개의 돌연변이 균주를 볼 수 있습니다.

또한 DNA 전용 올리고에 의해 표적으로 된 트립 플러스 콜로니에서 유래한 게놈 DNA에서 증폭된 PCR 산물도 표시됩니다. 올리고를 포함하는 RNA에 의해 표적으로 된 트립 플러스 콜로니(trip plus colonies)에서 유래한 게놈 DNA로부터 증폭된 PCR 산물도 겔에서 실행하였다. 동일한 PCR 산물의 van 91 1 제한 분해 결과는 177 염기쌍 및 101 염기쌍 중 van 91 1에 의해 278 염기쌍 증폭 PCR 밴드 및 분해 산물 밴드를 나타냅니다.

DNA 염기서열분석은 여기에서 올리고를 포함하는 RNA에 의한 유전자 변형을 보여줍니다. 올리고를 포함하는 RNA에 의해 표적화된 게놈 영역의 DNA 전기표가 표시됩니다. DNA 염기서열의 g는 oligo go를 포함하는 RNA의 RG에서 파생됩니다.

또한, 박스형으로는, 트립의 5개 영역과 DNA에 의해 표적으로 된 형질전환체, 올리고만을 함유하는 DNA와 올리고를 함유하는 RNA의 CG 기저 서열의 삽입이 합의 서열에서 일치하고, 트립의 그것과 비교된다. 올리고에 의해 표적으로 삼기 전에 5개의 돌연변이 세포. 바닥에 올리고를 포함하는 복구 RNA는 2개의 염기 DNA 삽입과 1개의 염기 RNA 치환을 가지고 있습니다.

노란색 음영이 있는 파란색 상자로 표시된 영역은 올리고를 포함하는 RNA와 DNA 전용 올리고가 테스트된 모든 샘플에서 삭제 돌연변이와 넌센스 돌연변이를 정확하게 보정했음을 보여주며, 점선은 올리고 염기서열을 포함하는 RNA의 위치를 표시합니다. 알칼리 처리는 올리고를 함유한 RNA에 의한 유전자 변형을 방지하며, 올리고를 함유한 RNA에 의한 형질전환 빈도와 올리고만을 DNA만으로 표현하였다. 에어로바 rep는 각 올리고에 대한 세 개의 독립 변환에 대한 평균의 표준 오차를 나타냅니다.

DNA only oligo는 수산화나트륨 처리를 하지 않은 경우와 처리한 경우 유사한 변형 빈도를 나타냅니다. 반대로, 올리고를 포함하는 RNA에 의한 형질전환 빈도는 수산화나트륨으로 처리한 후 0으로 떨어집니다. 따라서, 올리고를 함유하는 RNA를 사용한 제제는 DNA만 올리고로 오염되지 않는다.

따라서, 관찰된 형질전환 빈도는 올리고를 포함하는 RNA에 특이적입니다. 염색체 수준에서 R-N-A-D-N-A 하이브리드를 형성하는 방법과 RNA에서 효모 세포의 게놈 DNA로 유전 정보를 검토하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 올리고를 포함하는 RNA의 품질이 우수하고 RNA가 없는 조건에서 작동해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.