RNA 함유 Oligonucleotides를 사용하여 변환하여 게놈 DNA에서 RNA / DNA 하이브리드의 생성

다음 실험의 전반적인 목표는 RNA 포함 올리고뉴클레오타이드를 효모 세포에 형질전환시켜 살아있는 효모 세포의 염색체 수준에서 RNA-DNA 하이브리드를 생성하는 것입니다. 이는 분열 중인 효모 세포에 단일 가닥 RNA 포함 올리고뉴클레오타이드를 도입함으로써 달성됩니다. 그러면 올리고뉴클레오타이드는 효모 염색체에 위치한 돌연변이 표지 유전자의 상보적 영역과 결합하여 RNA-DNA 하이브리드를 형성합니다. 두 번째 단계로, RNA 포함 올리고뉴클레오타이드로 형질전환된 세포를 선택 배지에 도말합니다.

이를 통해 올리고뉴클레오타이드의 RNA 부분이 돌연변이 표지 유전자의 교정을 위한 템플릿으로 작용하여 세포가 성장할 수 있게 됩니다. 다음으로, RNA 포함 올리고뉴클레오타이드에 의한 유전자 교정 빈도를 확인하기 위해 선택 배지에서 성장한 효모 콜로니의 수를 산정하며, 그 결과 올리고뉴클레오타이드의 RNA 가닥에서 효모 게놈의 돌연변이 표지 유전자로 유전 정보가 전달되었음이 밝혀집니다. 이는 제한 효소 절단 분석, 서열 분석 및 알칼리 민감성 분석(alkaline liability assay)을 통해 입증됩니다.

안녕하세요, 조지아 공과대학교 생물학과의 Francesca 박사 연구실인 HIN 설립자입니다. 오늘은 살아있는 효모 세포 내의 염색체 수준에서 RNA-DNA 하이브리드를 생성하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 세포가 게놈 DNA에 삽입된 RNA의 존재를 어떻게 허용하는지 연구하고, 인비보(in vivo)에서 RNA-DNA 하이브리드의 안정성에 영향을 미치는 요인이 무엇인지 결정하기 위해 이 절차를 사용합니다.

그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 전에 올리고 튜브, 피펫, 볼텍스 랙, 실험 구역, 연구자가 착용한 장갑을 포함하여 실험에 사용될 모든 재료를 RNA 제거 용액으로 닦아내십시오. 잠재적인 RNA 오염을 방지하기 위해, 전체 과정 동안 RNA-free water, 화학 시약, 튜브 및 피펫 팁을 사용하십시오.

효모 세포의 게놈 DNA로 유전 정보를 전달하기 위해 RNA 함유 올리고뉴클레오타이드를 준비합니다. 여기서 사용된 효모 균주는 2개 염기 결실과 1개 넌센스 돌연변이가 있는 trip five 유전자 변이체를 포함하고 있습니다. 이러한 효모 균주는 트립토판 결핍 돌연변이체이며, 트립토판이 없는 배지에서는 콜로니를 형성하지 않습니다.

RNA 함유 올리고뉴클레오타이드는 결실 돌연변이를 교정하도록 설계된 2개 염기 DNA 삽입물을 포함하는 65 MER입니다. 또한, 이 올리고뉴클레오타이드는 획득된 trip five 대립유전자의 넌센스 돌연변이를 교정하기 위한 리보뉴클레오타이드 하나를 포함하고 있습니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 RNA 함유 올리고뉴클레오타이드를 250 µM 스톡 용액으로 준비하십시오. RNA 함유 올리고뉴클레오타이드를 이용한 형질전환 16시간 전에 접종하십시오.

trip five 돌연변이 효모 세포가 포함된 5 mL의 rich yeast peptide dextrose 또는 YPD 액체 배지를 준비하고, 30 °C에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 배양액 1.5 mL를 50 mL의 YPD 액체 배지로 옮깁니다. 형질전환 해동 직전에 30 °C 진탕 배양기에서 225 rpm으로 4시간 동안 세포를 배양합니다.

RNA 함유 올리고뉴클레오타이드와 그에 대응하는 DNA 전용 올리고뉴클레오타이드를 얼음 위에 둡니다. DNA 전용 올리고뉴클레오타이드는 양성 대조군으로 사용됩니다. RNase-free 튜브에 RNase-free water를 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 50 µM 농도로 희석합니다.

1 mol의 올리고를 사용하여 3회의 형질전환을 수행하고 여유분을 확보할 수 있도록 각 올리고를 70 µL씩 준비합니다. 올리고의 2차 구조를 제거하기 위해 RNA 포함 올리고와 DNA 전용 올리고를 100 °C 가열 블록에서 2분간 변성시킵니다. 변성 직후 튜브를 얼음에 배치하고 형질전환 시까지 보관합니다. 형질전환 직전에 RNase-free 튜브에 용액 1과 용액 2를 준비합니다. 세포 배양액을 50 mL RNase-free 튜브로 옮긴 후 3,000 rpm(1,562 ×g)에서 2분간 원심분리합니다.

상층액을 제거하고 50 mL의 RNase-free water로 세포를 세척합니다. 세포를 3000 rpm에서 2분 동안 다시 원심 분리합니다. 배양액과 잔류할 수 있는 RNase를 완전히 제거하기 위해 이 과정을 5회 반복하며, 마지막 원심 분리 후 상층액을 제거합니다.

상층액을 제거하고 세포를 5 mL의 용액에 다시 부유시킵니다. 샘플을 3000 rpm으로 2분 동안 원심분리하고, 상층액을 버린 후 세포에 용액 1을 250 µL 추가합니다. 이 정도의 세포 양이면 7~8회의 형질전환을 수행하기에 충분합니다.

세포 현탁액 50 µL를 RNA-free 마이크로 원심분리 튜브 7개에 각각 분주합니다. 다음으로, 튜브 3개에는 50 µM RNA 함유 oligo 20 µL를, 다른 튜브 3개에는 50 µM DNA 전용 oligo 20 µL를, 그리고 음성 대조군으로 사용할 나머지 튜브 1개에는 oligo가 포함되지 않은 멸균수 20 µL를 첨가합니다.

그 다음, 7개의 형질전환 반응 각각에 용액 2를 300 µL씩 첨가합니다. 성분들이 섞이도록 시료를 강하게 볼텍싱합니다. 배양 후, 쉐이커를 사용하여 형질전환 반응물을 30 °C에서 30분 동안 배양합니다.

샘플을 42 °C에서 15분 동안 열충격 처리합니다. 그다음 5,000 rpm(2,236 ×g)으로 4분 동안 세포를 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고 3개의 튜브 각각에 100 µL의 멸균수를 넣어 세포를 재현탁합니다.

이 세포 현탁액의 분취액을 취하여 각각의 분취액을 멸균수로 100,000배 희석합니다. 플레이트당 약 15개의 멸균 유리 구슬을 넣고, 100,000배 희석된 세포 100 microliters를 3개의 YPD 플레이트에 도말합니다. 각 형질전환 반응에서 재현탁된 세포 100 microliters를 트립토판이 없는 합성 완전 고체 배지가 담긴 페트리 접시 하나에 도말하고 플레이트를 고르게 흔들어 줍니다.

그런 다음 비즈를 제거합니다. YPD 플레이트의 세포를 30 °C에서 2일 동안 배양하고, 트립토판이 없는 합성 완전 고체 배지에 도말한 세포를 30 °C에서 4~5일 동안 배양합니다. 선택 배지와 YPD 배지에서 성장한 콜로니 수를 측정 및 비교하여, RNA 함유 올리고, DNA 전용 올리고 및 올리고 미첨가 대조군에 대한 유전자 교정 빈도를 계산합니다.

올리고뉴클레오티드를 세포에 첨가하지 않은 경우, 선택 배지에서 콜로니가 형성되지 않아야 합니다. 무작위로 선택한 형질전환 콜로니 여러 개를 YPD 배지에 스트리킹하여 단일 콜로니 분리주를 얻습니다. 콜로니 성장을 위해 세포를 30 °C에서 2일 동안 배양합니다. 배양 후, 단일 콜로니 여러 개를 선택하여 YPD 배지와 선택 배지에 패치 배양을 수행합니다.

하루 동안 배양한 후, 올리고뉴클레오타이드가 도입된 세포는 트립토판이 결핍된 합성 완전 고체 배지에서 성장이 관찰되지만, 선택성 트립토판 결핍 합성 완전 고체 배지에서 올리고뉴클레오타이드를 처리하지 않은 대조군 균주는 성장이 관찰되지 않습니다. 다음으로, 콜로니 PCR을 시작하기 위해 RNA 포함 올리고뉴클레오타이드가 표적으로 하는 영역을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 설계합니다. 개별 패치에서 채취한 세포를 1 unit의 liase가 포함된 50 µL의 물에 재현탁하고, 샘플을 상온에서 10분 동안 배양한 후 100 °C의 히팅 블록에서 5분 동안 배양하여 세포를 파쇄하고 게놈 DNA를 용액으로 방출시킵니다.

PCR 튜브에 PCR 반응액을 준비하고, 각 튜브에 세포 현탁액 10 µL를 첨가한 후 서면 프로토콜에 설명된 대로 증폭 반응을 수행합니다. 결과 샘플을 1% agarose 젤에서 전기영동하여 PCR 산물을 관찰하십시오. 본 실험에서 oligo를 포함하는 RNA에 의해 전달된 유전 정보는 효모 게놈 표적 부위에 새로운 VAN 91 1 제한 효소 인식 부위를 생성하므로, PCR 산물을 van 91 1 제한 효소로 절단하여 정보가 정확하게 전달되었는지 확인할 수 있습니다.

PCR 프로덕트 버퍼 6 µL, BSA 0.5 µL, 제한 효소와 멸균수를 포함하여 총 부피가 15 µL가 되도록 소화 반응을 설정하십시오. 샘플을 37 °C에서 1시간 동안 배양하십시오. RNA 함유 올리고의 RNA 가닥에 의해 전달된 유전적 변형을 관찰하기 위해, 소화되지 않은 샘플과 소화된 샘플을 2% agarose 겔의 동일한 행에 함께 전기영동하십시오.

PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제하고 DNA 시퀀싱을 위해 준비합니다. 생성물을 증폭하는 데 사용한 것과 동일한 프라이머를 사용하여 샘플의 시퀀싱을 의뢰하십시오. 마지막으로, 선택한 참조 서열과 여러 서열을 정렬할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 DNA 시퀀싱 결과를 분석하며, 각 반응당 1 mol의 RNA 함유 올리고 또는 DNA 전용 올리고를 1.5 milliliter 튜브에 넣어 RNA 함유 올리고에 대한 알칼리 처리를 수행합니다.

그 다음 가수분해를 위해 1 M 수산화나트륨 4 µL를 추가하거나, 음성 대조군을 위해 물 4 µL를 추가합니다. 배양 후 시료를 65 °C 워터배스에서 1시간 동안 배양합니다. 반응물을 얼음에 옮깁니다.

2 µL의 1.2 M 염화수소, 4 µL의 1 M tris hydrochloride 및 음성 대조군을 위한 4 µL의 물을 사용하여 가수분해 반응을 중화합니다. 6 µL의 물과 4 µL의 1 M tris hydrochloride를 추가합니다. 형질전환을 수행할 때까지 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.

앞서 설명한 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드를 형질전환하지 않은 효모 세포는 트립토판이 결핍된 합성 완전 고체 배지에서 콜로니를 형성하지 않습니다. 반대로, RNA 포함 올리고뉴클레오타이드 하나를 형질전환한 후 트립토판이 결핍된 합성 완전 고체 배지에서 배양한 세포는 콜로니를 형성합니다.

세포를 1 nmol의 대응하는 DNA 전용 대조군 올리고뉴클레오타이드로 형질전환시킨 후, 트립토판이 없는 합성 완결 고체 배지에서 효모 콜로니가 성장합니다. RNA 함유 올리고뉴클레오타이드로부터 효모 염색체 DNA로의 유전 정보 전달은, 제시된 바와 같이 표적 게놈 부위를 증폭한 PCR 생성물의 VAN 91 1 제한효소 절단을 통해 확인할 수 있습니다. trip. Five 변이 균주의 게놈 DNA로부터 증폭된 trip. Five 로커스의 PCR 생성물을 확인할 수 있습니다.

DNA 전용 올리고(oligo)를 대상으로 한 trip plus 콜로니 유래 게놈 DNA로부터 증폭된 PCR 산물 또한 나타나 있습니다. RNA 함유 올리고를 대상으로 한 trip plus 콜로니 유래 게놈 DNA로부터 증폭된 PCR 산물 또한 겔 상에서 전기영동 되었습니다. 동일한 PCR 산물에 대해 van 91 1 제한효소 절단을 수행한 결과, 278 base pair의 증폭된 PCR 밴드와 van 91 1에 의한 177 base pair 및 101 base pair의 절단 산물 밴드가 확인되었습니다.

DNA 시퀀싱을 통해 RNA 포함 올리고에 의한 유전자 교정이 확인되었습니다. RNA 포함 올리고가 표적으로 하는 게놈 영역의 DNA 전기영동도(electropherogram)가 나타나 있습니다. DNA 서열의 g는 RNA 포함 올리고의 RG에서 유래한 것입니다.

또한 상자 안에는 DNA 전용 올리고 및 RNA 포함 올리고에 의해 타겟팅된 trip plus 형질전환체의 trip five 영역 CG 염기 서열 삽입 결과가 표시되어 있으며, 이는 합의 서열과 일치하며 올리고 타겟팅 전의 trip five 돌연변이 세포의 서열과 비교되었습니다. 하단의 수선 RNA 포함 올리고에는 2개 염기의 DNA 삽입과 1개 염기의 RNA 치환이 있습니다.

파란색 상자와 노란색 음영으로 표시된 영역은 RNA 포함 올리고뉴클레오타이드와 DNA 전용 올리고뉴클레오타이드 모두 테스트한 모든 샘플에서 결실 돌연변이와 넌센스 돌연변이를 정확하게 교정했음을 보여주며, 점선은 RNA 포함 올리고뉴클레오타이드 서열의 위치를 나타냅니다. 알칼리 처리는 RNA 포함 올리고뉴클레오타이드에 의한 유전자 교정을 방지하며, RNA 포함 올리고뉴클레오타이드와 DNA 전용 올리고뉴클레오타이드의 형질전환 빈도가 표시되어 있습니다. 오차 막대는 각 올리고뉴클레오타이드에 대해 세 번의 독립적인 형질전환을 수행한 평균의 표준 오차를 나타냅니다.

DNA 전용 올리고는 수산화나트륨 처리 여부와 관계없이 유사한 형질전환 빈도를 나타냅니다. 반대로, RNA 함유 올리고에 의한 형질전환 빈도는 수산화나트륨 처리 후 0으로 떨어집니다. 따라서 RNA 함유 올리고 제제는 DNA 전용 올리고에 의해 오염되지 않았음을 알 수 있습니다.

따라서 관찰된 형질전환 빈도는 RNA 함유 올리고뉴클레오타이드에 특이적입니다. 지금까지 염색체 수준에서 RNA-DNA 하이브리드를 형성하고, 효모 세포 내에서 RNA로부터 게놈 DNA로의 유전 정보 전이를 검토하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 RNA 함유 올리고뉴클레오타이드의 품질이 우수해야 하며, RNase-free 조건에서 작업하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에서 좋은 결과 얻으시길 바랍니다.