Name: 교양 차 마우스 배아 섬유아 세포의 신호 분자의 아데노 바이러스 - 매개 유전자 제거 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 학습하세요 마우스 배아 섬유아 세포에서 아데노바이러스를 이용한 Cre 재조합효소 전달 및 floxed Rac1 대립유전자 절제 방법을. 이 기법은 액틴 역학에서 Rac1의 기능 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 기본 Rac1 flox / flox 마우스 배아 섬유아 세포의 자신의 선물 토론토, 온타리오 마운트시나이 병원에있는 닥터 Rizaldy 스콧 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구 (CIHR, 청소 2009-93526)와 자연 과학 및 캐나다 공학 연구위원회 (NSERC, RG 327372-06)의 캐나다 연구소에서 뉴저지에 보조금을 운영하여 지원했다. SH와 MW는 CGSMA 각각 CIHR과 NSERC에서 CGS - M 보너스에 의해 지원됩니다. 스티브 홀리와 멜라니 윌스 마찬가지로이 문서에 기여.

해동 세포 <ol><li> 액체 질소에서 냉동 배아 섬유아 세포 마우스 (MEFs)을 (개인 배아 차 문화에서 이전에 생성한) 구합니다. </li><li> 37 병을 immersing로 녹여 세포 컨텐츠가 완전히 해동되기 전까지는 소용돌이와 함께 ° C 물. </li><li> 10cm의 세포 배양 접시 10 % 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보완되었습니다 DMEM의 9mL를 추가합니다. </li><li> 판 드롭 현명한 해동 세포 현탁액을 추가, 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 하룻밤 세포 및 장소 플레이트를 해산하기 위해 부드럽게 접시 바위. 세포 DMSO (냉동 과정에서)으로 구분하는 경우 세포 접시 (약 4 시간 게시물 도금)을 준수 후, 초기 미디어 신선한 매체로 대체될 수 있습니다. 또한 해동 후 세포의 합류를 참고하면 동결 세포의 숫자에 따라, 동결 후 세포의 회복 속도, 그리고 세포의 성장 속도. </li></ol> Passaging 세포 <ol start="5"><li> 세포 confluency 본질적으로 100 % (예 : 다음날)로 성장하면, 미디어를 기음과 멸균 PBS의 5mL와 세포를 씻으십시오. </li><li> PBS를 제거하고 세포가 접시에서 분리 수 있도록 약 5 분 동안 인큐베이터에서 10mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 장소 플레이트를 포함하는 트립신의 1mL를 추가합니다. </li><li> 세포가 분리되면, 대단히 짧은 시간을 해산 미디어 9mL를 포함하는 새 접시에 드롭 현명이 정지 1mL을 추가하고 37 ° C 배양기 하룻밤에이 곳으로 trypsinized 세포 미디어 9mL를 추가, 피펫 2-3 회 . 미디어의 FBS의 존재 또는 트립신을 inactivate되며, 세포는 트립신을 희석 먼저 씻어 수 있습니다. </li></ol> 커버 전표에 세포를 계산하고 도금 <ol start="8"><li> 인큐베이터에서 세포를 제거, 이번에는 대신 9mL의 trypsinized 세포에 다시 5 6mL 미디어를 추가할 제외 씻어 및 이전과 trypsinize. </li><li> 피펫 세포는 철저하게 하나의 세포 현탁액에 완전한 분리를 보장하고, 별도의 microfuge 튜브에 trypan 블루 15μL와 결합 15μL 제거합니다. </li><li> 몇 시간을 아래와 pipetting하여 세포 / trypan 파랑 정지를 혼용하고 hemocytometer에 15μL 추가할 수 있습니다. </li><li> 현미경, 죽은 세포 파란색 나타납니다. hemocytometer에서 4X4 격자 중 하나에 (생활) 무색 / 취소 세포의 수를 계산합니다. 다른 세 4X4의 격자 (표시된 A, B, C 및 D)에서이 계산을 반복하고 정지 μL 당 세포의 수를 계산하려면 다음 공식을 사용 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="방정식 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식 1"></li><li> 프로토콜 최적화를 통해, 우리는 실험의 결론에서 시각화에 적합한 세포 밀도 30,000 전지 결과를 도금 것으로 나타났습니다. </li><li> 30000 세포에 필요한 세포 현탁액의 볼륨을 계산하려면 다음 공식을 사용 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="방정식 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식 2"></li><li> 지금 여섯 잘 요리의 각 우물에 멸균 유리 커버 슬립을 배치하고 각 물론 미디어의 2mL를 추가하고, 다음 세포 현탁액 30000 세포에 필요한 볼륨에서 각 우물에 드롭 현명 추가할 수 있습니다. 우리가 나중에 지점에 형광 현미경을 사용하여 세포를 시각화되므로 유리 커버 풀렸는데이 실험에 사용되는 것에주의하라; 모든 애플 리케이션은 반드시 현미경을 필요로하고, 따라서 전표가 필요하지 않을 수 있습니다 다룹니다. </li></ol> 바이러스 전달 <ol start="15"><li> 몇 시간 또는 하루 (세포 커버 풀렸는데을 준수하는지 확인하는 데 충분한 시간) 후, 미디어를 제거하고 혈청없는 DMEM의 1mL와 세포를 씻으십시오. </li><li> 바이러스의뿐만 아니라 각 잘하는 혈청이없는 미디어를 1mL를 추가합니다. 본 실험에서는, adeno - Cre 호텔 바이러스 벡터 Biolabs에서 상업적으로 얻은 것입니다. </li><li> 이전 프로토콜 최적화 500 감염의 다중성이 (뫄) 세포 생존 능력에 거의 혹은 전혀 영향과 기본 MEFs으로 고효율 유전자 전달을 제공하는 것으로 나타났습니다. 뫄은 다음과 같이 계산 수 있습니다 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="방정식 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식 3"> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="방정식 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식 4"></li><li> 감염된 것으로 각 물론 직접 바이러스의 계산된 볼륨을 추가 부드럽게 하루 37 ° C 배양기에 바이러스 및 장소 세포를 해산하기 위해 접시 바위. </li><li> 다음날 아침, 제거 바이러스가 들어있는 세포에서 미디어과 1mL 멸균 PBS로 세포를 세척하고 다음 각 잘하기 위해 정기적으로 미디어의 2mL 추가할 수 있습니다. </li><li> 이 실험에서 exemplified Rac1 세포의 경우, 형태학의 변화는 약 72시간 게시물 전달의 세포에서 발생했습니다. </li></ol> 대표 결과 세포는 시각화했다D 굴지 염료 phalloidin (이미징 목적만을 위해)와 얼룩과 겔프 대학에서 고급 분석 센터에서 Leica TCS SP5 - multiphoton 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 몇 군데. 그림 1은 바이러스에 노출되지 동일한 세포에 비해 adeno - Cre 호텔 바이러스에 노출되었던 Rac1 flox / flox 세포의 계약과 길쭉한 형태를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 같은 소스 (오른쪽)에서 감염되지 않은 세포에 비해 adeno - Cre 호텔 바이러스 (왼쪽)에 감염된 Rac1 flox / flox 세포 사이의 비교.

<ol><li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li>
<li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li>
<li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li>
<li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li>
<li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li>
<li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li>
</ol>

동물 실험 동물 관리에있는 캐나다 협의회가 정한 지침과 규정에 따라 수행되었다.

함께 비디오는 재조합 바이러스가 Cre 호텔 recombinase를 사용하여 체외에서 소비세 특정 유전자하는 데 사용할 수있는 방법을 exemplifies. 이 프로토콜의 개발은 그러나 번지 가치가 어떤 특정 지점을 밝히지 않았다. <ul><li> adenoviruses 작업을 할 때 적절한 안전 절차를 항상 고용해야합니다. 바이러스와 함께 작업하면서 실험 복과 장갑은 항상 착용해야합니다. 미디어 플라스틱 도자기는 적어도 30 분 동안 10 % 표백제와 함께 치료해야하며, 플라스틱 도자기는 그 이후 autoclaved해야합니다. </li><li> 피하은 반복 동결 - 해동이 바이러스 titer 영향을 따라서 전달의 효율성을 줄일 수로 바이러스 주식. 바이러스 주식의 작은 볼륨이 처음 별도의 튜브로 aliquoted해야합니다. </li><li> 50-500까지 MOIs는 방법을 개발하는 동안 테스트되었습니다 효율적인 전달 속도는 세포 생존 능력에 부정적인 영향없이, 대부분의 경우에서 관찰되었다. </li><li> Adeno - GFP는 신속하게 전달 효율성을 화면으로 방법을 개발하는 동안 사용되었다. 이 컨트롤 (또는 빈 벡터)는 세포 변화 발생하지 않습니다 혼자 바이러스 감염을 보장하기 위해 실험 기간 동안 실시한다. 마찬가지로, 당신의 세포에 대한 관심의 floxed 유전자를 절개하는 모든 세포 변화 (형태 또는 생존에 즉 변화)에 따라서하지 않는 경우, 그때 adeno - GFP와 동일한 셀 유형을 감염하면 해당 바이러스 전달이 입증하는 데 사용할 수있는 중요한 컨트롤입니다 발생. </li></ul> 문화 캐스케이즈 신호의 심사 넘어, adeno - Cre 호텔 접근법은 또한 조건 실험 동물 3,4에서 유전자를 제거하고, 유기체 6 안에서 세포의 특정 인구 라벨 생체내에 채용되었습니다. 아데노 바이러스 시스템은 또한 호스트 세포에 Cre 호텔 recombinase 이외의 다른 유전자를 도입하기 위해 적용할 수 있습니다. 이 배달 벡터를 사용하는 두 가지 주요 장점은 높은 전달 및 유전자 전달 효율, 및 호스트 DNA와 통합의 부족입니다. 그러나, 소설 재조합 adenoviruses의 세대 집중적인 노동 수 있습니다. 프로토콜 여기서 설명하는 것은 이전에 개발 adeno - Cre 호텔 바이러스를 이용하여 adenoviral 시스템의 전원을 장비하고, 커플링 관심, Rac1 우리의 floxed allele과 함께. 실험 아웃이 조건부 노크를 통해, 우리는 MEFs가 floxed Rac1의 allele를 들고의 adeno - Cre 호텔 바이러스를 사용하여 전달 실제로 Rac1 - 결함 세포 2,5의 세포 형태 특성의 변화로 이어지는 Rac1의 절단을 일으킬 않는 것으로 확인되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Ad-CMV-Cre 바이러스</td><td>Vector Biolabs</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>DME 고농도 포도당 배지 500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td></td></tr><tr><td>FBS 캐나다산 500mL</td><td>VWR international</td><td>CAA15-701</td><td></td></tr><tr><td>PEN-STREP 1X 용액 100mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td></td></tr></tbody></table>

교양 차 마우스 배아 섬유아 세포의 신호 분자의 아데노 바이러스 - 매개 유전자 제거

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

유전자 다양한 세포 신호 폭포의 특정 구성 요소를 제거하는 능력은 현대적인 신호 전달 분석에 필수적인 도구가되었습니다. 이 조건 삭제를 달성하기 위해 하나의 특정 방법은 Cre 호텔 - loxP 시스템의 사용을 통해이다. 이 방법은 Cre 호텔의 recombinase 단백질에 대한 구체적인 인식 시퀀스 아르 loxP 사이트와 관심의 유전자를 측면이 포함됩니다. Cre 호텔 - 중재 재조합 loxP 사이트에서 이벤트 및 개입 유전자 3 후속 절단이 효소 결과 소위 floxed (loxP 사이트 둘러싸인) DNA의 노출. 여러 가지 방법은 관심의 사이트에 Cre 호텔 recombinase를 관리할 수 존재합니다. 이 비디오에서는, 우리는 floxed Rac1 allele 1 포함 배아에서 얻은 기본 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 감염하는 Cre 호텔 recombinase 유전자를 포함하는 아데노 바이러스의 사용을 보여줍니다. 우리의 실험 Rac1 MEFs 선택을위한 우리의 근거는 명확 형태학의 변경 사항이 굴지 cytoskeleton 2,5의 변경으로 인해 Rac1의 삭제,시 볼 수 있습니다. 바이러스 전달 및 Cre 호텔 식을 다음과 72시간은 세포가 굴지 염료 phalloidin를 사용하여 스테인드 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 몇 군데 있었다. 이것은 adeno - Cre 호텔 바이러스에 노출되었던 MEFs가 감염되지 않은 세포에 비해 이전 보고서 2,5와 일치하는 계약을 체결하고 형태의 길쭉한 나타난 것을 관찰했다. Cre 호텔 recombinase 전달의 아데노 바이러스 방법은 adeno - Cre 호텔 바이러스가 쉽게 사용할 수로 유익하고, 세포의 거의 100 %에 Cre 호텔을 통해 유전자 삭제는 최적화된 adenoviral 감염 얻을 수 있습니다.

이 비디오에서 우리는 floxed Rac1 allele를 갖고 기본 마우스 배아 섬유아 세포를 감염시킬 Cre 호텔 recombinase 유전자를 갖고 아데노 바이러스를 사용합니다.

다양한 세포 신호 전달 폭포(cell signalling cascades)의 특정 구성 요소를 유전적으로 제거할 수 있는 능력은 현대 신호 전달 연구에서 필수적인 도구가 되어 왔습니다...

현대 유전학 분석은 세포, 기관 또는 생물체 전체에서 특정 유전자를 표적으로 제거할 수 있게 하는 기술에 크게 의존하고 있습니다. 이러한 녹아웃 실험은 세포 내 맥락에서 해당 유전자의 기능을 밝히는 데 도움이 됩니다. 녹아웃으로 인해 나타나는 분자적, 형태적 및 생리학적 표현형은 모두 삭제된 서열에 의해 인코딩되는 유전자 산물의 역할에 대한 단서를 제공합니다.마우스와 같은 모델 생물에서 조건부 유전자 결손을 구현하는 일반적인 방법은 관심 유전자 또는 엑손의 양옆에 Cre 재조합효소(Cre Recombinase)의 인식 서열로 작용하는 loxP 부위를 배치하는 것입니다. 이후 Cre에 의해 소위 플로킹된(flocked) 대립유전자의 비가역적 절단이 촉매되어 게놈에서 해당 서열이 제거됩니다. 생체 내(in vivo)에서 수행되는 방식과 기성 세포를 직접 다루는 방식을 포함하여, 시스템에 Cre 재조합효소를 도입하는 여러 가지 서로 다른 방법이 존재합니다.본 특정 응용 분야에서는, flox 대립유전자를 보유한 형질전환 생쥐로부터 분리 및 배양된 섬유아세포에 Cre를 전달하기 위해 아데노바이러스를 사용하겠습니다. 이 방법은 외래유전자 전달 효율이 거의 100%에 달합니다. 바이러스가 세포에 투여되면 내포 작용 소포 내로 함입되어 핵막으로 운반되며, 여기서 목적 외래유전자를 포함한 바이러스 DNA가 핵공 복합체를 통해 핵 내부로 침투할 수 있습니다.그 후 세포 기전이 주입된 유전자를 전사하여 그 단백질 생성물이 세포에 작용하게 할 수 있습니다. 이 경우, 바이러스로 인코딩된 Cre Recombinase 효소가 호스트 세포 게놈에서 floxed 대립유전자를 절제합니다. 저희는 캐나다 온타리오주 겔프에 위치한 겔프 대학교의 Jones Lab 소속입니다.저희 연구실에서는 신호 전달의 개념과 다양한 신호 전달 폭포(signal transduction cascades)에서 특정 구성 요소를 제거했을 때 어떤 일이 발생하는지에 관심을 두고 있습니다. 오늘은 액틴 조직화와 관련된 폭포에 대해 살펴보겠습니다. 신호 전달은 정보를 전달하고 액틴 재조직화와 같은 표현형 변화를 유도하는 일련의 생화학적 구성 요소들에 의해 수행됩니다.우리가 관심을 갖는 단백질은 RAC1으로, 세포 접착, 이동 및 형태를 포함한 액틴 역학을 매개하는 데 중요한 소형 GTPase입니다. 본 연구에서는 CRE LAX P 시스템을 사용하여 이 유전자를 제거하고 세포 내에서의 역할을 확인할 것입니다. 앞서, 한쪽 RAC1 대립유전자가 floxed된 수정 후 12일 된 배아 생쥐로부터 섬유아세포를 분리하였습니다.이 세포들을 액체 질소에 넣어 장기 보관하였으며, 배아 하나를 대표하는 세포 한 바이알을 해동하는 것으로 시작하겠습니다. 세포 배양 실험을 수행할 때는 멸균 환경을 유지하는 것이 중요합니다. 이를 위해 승인된 클린벤치의 노출된 표면을 닦아내고, 벤치 내부로 들어가는 모든 시약 병과 실험 장비를 70% ethanol로 분무 소독해야 합니다.클린벤치 준비가 완료되면, 바이알을 37 °C 온수 비커에 담가 내용물이 액체가 될 때까지 세포를 해동합니다. 다음으로, 바이알을 70% ethanol로 멸균한 후 세포 현탁액을 첨가합니다. 10 cm 플레이트에 담긴 9 mL의 DMEM, high glucose 배지(10% fetal bovine serum 및 1% penicillin이 첨가됨)에 한 방울씩 떨어뜨립니다.Streptomycin 처리 후 플레이트를 가볍게 흔들어 세포를 분산시키고, 적절한 정보를 기입하여 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에 넣습니다. 세포는 일반적으로 24시간 이내에 100% 합류도(confluency)에 도달합니다. 이 시점에서 세포를 새로운 플레이트로 계대 배양할 수 있습니다.이를 위해, 먼저 기존 배지를 흡입하여 제거합니다. 멸균된 PBS 5 mL를 첨가하여 세포를 헹군 다음, 이 또한 제거합니다. 이제 10 mM EDTA가 포함된 트립신 1 mL를 첨가합니다.세포가 기질에서 떨어져 나갈 수 있도록 플레이트를 37°C 인큐베이터에 약 5분 동안 둡니다. 다시 클린벤치로 옮겨 트립신 처리된 플레이트에 배지 9 mL를 다시 넣어 세포를 10배 희석합니다. 파이펫으로 액체를 여러 번 위아래로 섞어 세포 덩어리를 풀어준 다음, 현탁액 1 mL를 취해 새로운 10 cm 플레이트에 담긴 신선한 배지 9 mL에 한 방울씩 떨어뜨려 추가합니다. 다시 한번 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포를 분산시킨 후 37°C 인큐베이터에 넣습니다.세포가 confluence 상태에 도달하면, 다음 단계는 현미경으로 관찰할 수 있도록 유리 커버슬립 위에 세포를 파종하는 것입니다. 세포에 트립신을 첨가하고 37 °C 인큐베이터에 넣는 단계까지 패키징에 사용된 것과 동일한 기술을 사용하여 세포를 준비하십시오. 세포가 플레이트에서 떨어지는 동안, 웰당 하나의 멸균된 커버슬립을 사용하여 유리 커버슬립이 포함된 6-웰 플레이트를 준비하십시오.세포가 플레이트에서 분리되면, 트립신 처리된 세포에 5~6 mL의 배지를 다시 첨가합니다. 실험의 다음 단계에서는 효율적인 바이러스 감염을 위해 적절한 수의 세포를 분주할 수 있도록 세포 수를 측정합니다. 세포 수를 측정하려면 15 µL의 샘플을 동일한 양의 트라이판 블루(trypan blue)와 혼합한 후, 피펫으로 위아래로 섞어주고 이 용액 15 µL를 혈구계수기(hemocytometer)에 첨가합니다.사멸된 세포는 푸른색으로 나타납니다. 이 전처리를 통해 4x4 그리드 내의 살아있는 세포 또는 무색 세포만을 측정하여 마이크로리터당 세포 수를 계산하십시오. 먼저 A부터 D까지 네 개의 서로 다른 그리드에서 세포 수를 세어 평균값을 구합니다. 그런 다음, 트라이판 블루(trypan blue)에 의한 희석을 고려하여 이 값에 2를 곱하십시오.그리드가 1 µL의 10분의 1을 유지하므로, 수치를 µL당 세포 수로 나타내려면 10을 곱하십시오. 다음으로, 앞서 계산한 세포 농도로 원하는 세포 수를 나누어 필요한 부피를 결정하십시오. 계산된 부피의 세포 현탁액을 6-웰 디쉬의 각 웰에 한 방울씩 첨가하십시오.이 세포들을 37°C 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 세포에 바이러스를 접종합니다. Vector B labs에서 입수한 den creek virus는 소분하여 -80°C에 보관하였습니다.이 바이러스를 회수하여 층류 후드로 가져옵니다. 배양기에서 6-웰 플레이트를 꺼내 후드로 옮깁니다. 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL의 무혈청 DMEM으로 세포를 세척합니다.이제 바이러스 첨가를 위해 각 웰에 serum free media 1 mL를 추가합니다. 바이러스 접종 시, 감염다중도(multiplicity of infection) 또는 MOI를 500으로 설정하여 사용합니다. 이전에 다양한 MOI를 사용하여 프로토콜 최적화를 수행한 결과, MOI 500에서 세포 생존율에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않으면서 매우 효율적인 감염률을 보임을 확인했습니다.MOI를 계산하려면 다음 식을 사용하십시오. 먼저 필요한 바이러스 수를 계산해야 하며, 이는 목표 MOI(이 경우 500)에 웰당 세포 수(30,000)를 곱하여 구할 수 있습니다. 사용할 바이러스 스톡의 부피를 결정하려면, 계산된 바이러스 수에 1000을 곱한 뒤 이를 바이러스의 초기 농도로 나눕니다. 이 사례에서는 감염시킬 각 웰에 1.5 µL의 바이러스 스톡을 첨가하게 됩니다.플레이트를 부드럽게 흔들어 바이러스를 분산시킨 후, 37 °C 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 세포에서 바이러스 배지를 제거하고 PBS로 세척한 뒤, 일반 배지 2 mL를 세포에 첨가합니다. 본 실험에서는 약 72시간 후에 세포에서 표현형 변화가 나타나는 것을 확인하였습니다.Actin دین으로 염색된 세포는 Guelph 대학교의 Advanced Analysis Center에 있는 Leica T-C-S-S-P five 다광자 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 이미징되었습니다. 이를 통해 감염된 세포와 비감염 세포 간의 형태학적 변화가 확인되었습니다. RAC1이 결핍된 세포는 감염되지 않은 넓고 편평한 세포에 비해 길고 가늘게 나타납니다.본 영상에서는 ADOC crease 시스템이 신호 전달 연구 외에도 세포에 유전자를 효율적으로 전달할 수 있는 강력한 방법임을 보여드렸습니다. 또한, 이 방법은 실험 동물의 유전자를 녹아웃하거나 생체 내 특정 세포군을 표지하는 데에도 사용할 수 있습니다. 아데노바이러스 시스템은 원칙적으로 Cre 외의 다른 유전자를 도입하는 데에도 활용 가능합니다.이 전달 방법을 사용함으로써 얻을 수 있는 장점으로는 높은 감염 효율, 효율성 및 숙주 세포 DNA와의 통합 부재 등이 있습니다. 하지만 일반적인 아데노바이러스를 생성하는 과정은 노동 집약적일 수 있습니다. 따라서 본 프로토콜에서는 이전에 개발된 ocre 바이러스와 flocked RAC one mes를 이용해 아데노바이러스 시스템의 성능을 활용하며, 이러한 조건부 넉아웃을 통해 다음과 같은 사실을 입증하였습니다.따라서 형태는 실제로 RAC와 같은 소형 GTP에 부분적으로 의존합니다. 결론적으로, 저희 Jones Lab은 영상을 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 향후 모든 연구에 행운이 함께하기를 바랍니다.

adenovirus-mediated-genetic-removal-signaling-molecules-cultured

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 lentiviral 하나의 후각 감각 신경 세포의 축삭의 유전자 조작과 시각화를위한 기술 및 터미널 arborization을...

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

우리는 모델 herpesvirus, 감마 herpesvirus 68 (γHV68)의 lytic 복제에 호스트 신호 분자의 핵심 역할을 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유전자 변형 마우스 긴장과 γHV68 lytic 복제 배아 섬유 아세포를 활용, 프로토콜 phenotypic 특성화 및 바이러스 lytic 복제에서 바이러스 호스트 상호 작용의 분자 심문을 모두 할 수 있습니다.

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

시상 하부의 기능 및 의료 중요성에도...

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

우리는 인간 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)와 엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 밀접하게 관련되는 모델 헤르페스 바이러스, 뮤린 감마 허피스 바이러스 68 (γ HV68)로 감염된 마우스에서 항 바이러스 사이토 카인 생성을 측정하기 위해 프로토콜을 설명한다. 유전자 변형 마우스 종자와 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)를 활용하여, 우리는 항 바이러스 사이토 카인 생산 생체 내 및 생체 모두를 평가. 렌티 바이러스 전달하여 녹아웃 배아 섬유 아세포에서 선천성 면역 구성 요소의 표현을 "재구성", 우리는 더 특정 선천성 면역 분자를 정확하게 지적하고 차등 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 조절하는 중요한 신호 이벤트를 해부하다.

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

여기, 우리는 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 하는 TGF-β/Smad3 신호 활동의 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜을 제시. 이 시스템 실시간 transcriptional 활동을 추적 하 고 두 단일 세포에 생체 외에서 그리고 살아있는 동물에 적용 될 수 있다모델.

라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

여기 선물이 있는 어떤 단백질 수 수 조건부로 비활성화 역 그것의 지배적인 부정적인 돌연변이 버전 overexpressing에 의해 지배 부정적인 유도할 수 있는 시스템을 개발 하는 프로토콜.

유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (DN) 단백질 억제

여기에서, 우리는 유전자 조작된 마우스 모델 유래 종양 에서 생체내에서 배아 치사되는 유전자 녹아웃을 수행하기 위한 프로토콜을 제시하고, 이어서 녹아웃이 종양 성장, 증식, 생존, 이동, 침윤 및 시험 관내 및 생체내에서 전사체에 미치는 영향을 평가한다.

악성 말초 신경 시스 종양 세포에서 Floxed 대립 유전자의 Ex vivo 절제에 의한 종양 발생에서 유전자 기능 정의

이 프로토콜은 관심있는 유전자에 결실을 품고 있는 마우스 비뇨생식기 오가노이드의 생성 및 특성화의 과정을 기술한다. 상기 방법은 마우스 비뇨생식기 세포 수확, CMV 프로모터로 Cre 발현을 유도하는 아데노바이러스를 이용한 생체외 형질도입, 및 시험관내 및 생체외 특성화를 포함한다.

Ex Vivo 마우스 자궁 세포에서 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실의 오가노이드 모델

이 프로토콜은 AAV8 전달 small hairpin RNA의 intrasplenic injection이 어떻게 문맥 주사와 동일한 유전자 knockdown 효율을 간에서 달성하는지 설명하며, 이는 수술 전후 및 수술 후 사망률과 합병증이 훨씬 낮은 더 간단한 절차를 나타냅니다.

아데노 관련 바이러스 혈청형 8(AAV8)로 전달되는 작은 헤어핀 RNA의 비장내 주입을 통한 간의 효율적인 유전자 녹다운

학습하세요 마우스 배아 섬유아 세포에서 아데노바이러스를 이용한 Cre 재조합효소 전달 및 floxed Rac1 대립유전자 절제 방법을. 이 기법은 액틴 역학에서 Rac1의 기능 연구에 활용됩니다.

교양 차 마우스 배아 섬유아 세포의 신호 분자의 아데노 바이러스 - 매개 유전자 제거

더 많은 동영상 탐색