회전 형 바틀 문화 시스템을 사용 로던트 전체 엠브료 문화의 방법
2010년 8월 28일
전체 배아 문화 기술 문화 마우스 및 쥐 배아 우리에게 수 예 생체내 상태. 이 비디오 프로토콜에서는, 우리는 회전 형 병 문화 시스템을 사용 E12.5 후 쥐의 배아 전체가 문화의 표준 절차를 보여줍니다.
발생생물학에서는 실험을 위해 다양한 동물이 사용됩니다. 닭 배아의 부화 배양 기술은 1950년대에 확립되었으며, 현대적인 유전적 조작 기술이 확립되기 이전부터 발전해 왔습니다. 배아는 조작이 가능하고 현미경으로 관찰할 수 있기 때문에, 전배아 배양은 유전자를 도입하거나 형질전환시켜 특정 부위를 직접적으로 표적화하는 데 매우 유용한 도구입니다.
착상 후 발달 과정에서 마오리안 배아의 역동적인 발달 과정을 연구하고자 할 때, 마오리안 배아의 성장은 기능적인 태반에 결정적으로 의존하며, 이는 배양 기간을 제한하는 요소가 됩니다. 일반적으로 쥐(rat)의 경우 배아 발생 8.5일에서 14.5일 사이, 생쥐(mouse)의 경우 E 6.5에서 12.5일 사이의 기간 동안 배아를 배양할 수 있습니다.
연구실에서는 회전 배양 시스템을 사용하여 쥐와 생쥐의 배아를 배양합니다. 이 배양 시스템은 쥐와 생쥐의 배아가 후기 임신 단계에 있을 때, 즉 쥐의 경우 E 11.5 이후, 생쥐의 경우 E 9.5 이후의 배양에 가장 널리 쓰이며 적합합니다.
본 영상에서는 E 12.5 RU 배아를 이용한 헝그리 배양(hungry culture)의 표준 프로토콜을 소개하고자 합니다. 이 조건에서 배아는 이틀 동안 배양될 수 있으며, 이는 호른 농업(hor agriculture)에서의 다양한 효과적인 조작을 검토하기에 충분한 시간입니다. 성공을 위한 두 가지 핵심 단계가 있습니다.
첫째, 배아, 특히 막대 혈관(rod vessels)이 손상되지 않도록 박리 절차를 정확하게 수행해야 합니다. 둘째, 절차는 가능한 한 신속하게 진행되어야 하며, 이는 특히 연령이 높은 배아의 경우에 더욱 중요합니다.
예를 들어, E 10.5 마우스 배아의 경우 30분 이내에 이송해야 합니다. 우리는 pax6 돌연변이 배아에 전체 배아 배양 기술을 적용했습니다. 예를 들어, 소수의 세포를 염료로 표지하거나 야생형 및 돌연변이 배경의 배아에 표지된 세포를 이식함으로써 돌연변이체 내 신경세포의 이동 패턴을 분석했습니다.
또한, 전기 충격을 이용한 전기천공법을 통해 배양된 생쥐 및 붉은 배아로 유전자를 전달하는 방법을 확립하였습니다. 이를 통해 외래 유전자 구성물, 우성 부정형(dominant negative forms) 및 siRNA를 발달 중인 뇌 영역에 간단히 도입할 수 있습니다. 따라서 기능 상실(loss of function) 및 기능 획득(gain function) 실험을 통해 유전자 기능을 용이하게 분석할 수 있습니다.
우리는 또한 오가노이드 배양 또는 슬라이스 배양, 혹은 배양법을 통해 GFP 또는 RFP가 표지된 세포의 행동을 조사합니다. 따라서 다른 기술들과 결합하여 Lio 배양을 이용한 다양한 실험을 수행할 수 있습니다.
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개요
이 비디오 프로토콜은 회전식 병 배양 시스템을 사용하여 E12.5 이후 쥐 배아의 전배아 배양 기술을 시연합니다. 이 방법은 임신 중기의 중요한 단계 동안 ex vivo 배양을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 발달생물학
- 발생학
- Ex vivo 배양 기술
배경
- 전배아 배양 기술은 1950년대부터 확립되었습니다.
- 이 기술을 통해 유전학적 연구를 위한 배아 조작이 가능합니다.
- 배아를 특정 발달 단계 동안 배양할 수 있습니다.
- 성장은 배아의 기능적 존재 여부에 따라 달라집니다.
연구 목적
- 착상 후 배아의 역동적인 발달 과정을 연구하기 위함입니다.
- 전체 배아 배양을 위한 표준화된 절차를 제공하기 위함입니다.
- 발생 생물학 연구를 촉진하기 위함입니다.
사용된 방법
- 전배아 배양 기술
- 회전식 병 배양 시스템
- 쥐 배아의 ex vivo 조건
- 배아기 8.5일부터 14.5일까지의 배양 기간
주요 결과
- E12.5 이후 쥐 배아의 성공적인 배양.
- 배아 조작을 위한 표준 절차의 시연.
- 배아의 핵심 성장기에 대한 통찰.
- 향후 연구를 위한 신뢰할 수 있는 방법의 수립.
결론
- 전배아 배양 기술은 발생 생물학에서 매우 유용한 도구입니다.
- 이 기술을 통해 통제된 조건에서 배아의 발달 과정을 연구할 수 있습니다.
- 표준화된 방법은 연구의 재현성을 높여줍니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
회전식 전배아 배양(whole embryo culture, WEC) 시스템은 임신 중기라는 결정적인 단계 동안 설치류 배아를 직접 조작하고 관찰할 수 있게 하여, 초기 발견 단계에서의 기전적 리스크 제거를 지원합니다. 이 ex vivo 플랫폼은 정밀한 유전적 및 세포적 개입을 가능하게 하여, in vivo 연구 이전에 기능적 타겟 검증과 경로 조사를 용이하게 합니다. 이 시스템의 재현성과 적응성은 발달 및 질병 모델링 분야의 중개 연구와 포트폴리오 선별에 있어 매우 가치 있는 자산이 됩니다.
바이오제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 포유류 배아에서 기능적 타겟 검증을 위한 직접적인 유전적 또는 세포적 조작을 가능하게 합니다.
- 제어된 ex vivo 시스템에서 기능 상실 및 획득 연구를 가능하게 함으로써 기전적 리스크 감소를 지원합니다.
- 주요 발달 변곡점에서의 경로 명확화 및 가설 검증을 용이하게 합니다.
- 후보 중재제가 배아 발달에 미치는 영향을 평가하기 위한 플랫폼을 제공합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 표현형 스크리닝 또는 메커니즘 분석을 위해 검증되고 조작 가능한 배아 시스템을 준비합니다.
- 유전적 또는 화학적 섭동 이후의 발달 결과에 대해 재현 가능하고 정량적인 평가를 가능하게 합니다.
- 유전자형 또는 중재법 간의 비교 연구를 위한 분석 표준화 및 확장성을 지원합니다.
- 생리학적으로 관련성이 있는 환경에서 화합물 또는 유전자 기능의 신뢰할 수 있는 평가를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 선천성 질환 또는 유전자 기능 모델링을 위해 질병 관련 발달 단계와 일치합니다.
- 온전한 배아 내에서 기전 연구를 가능하게 함으로써 발견부터 전임상 검증까지의 연속성을 제공합니다.
- 파이프라인 초기 단계에서 발달상의 결함을 명확히 함으로써 위험 조정된 추진 결정을 지원합니다.
- 제어 및 조작 가능한 시스템에서 바이오마커 발견과 검증을 용이하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
회전식 WEC 시스템은 가설 기반의 조작과 배아 발달의 정량적 분석을 가능하게 함으로써 초기 발견 단계와 전임상 연구 사이의 가교 역할을 합니다. 인비트로(in vitro) 분석과 인비보(in vivo) 모델의 중간 단계에 위치한 이 시스템은 기전 연구 및 타겟 리스크 제거를 위한 독보적인 플랫폼을 제공합니다.
- 발견 생물학: 직접적인 유전적 또는 세포적 개입을 통해 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 정량적 표현형 판독을 위해 분석 준비가 완료된 재현 가능한 배아 시스템을 제공합니다.
- 분석: 비교 분석을 위해 발달, 이동 또는 분자적 결과의 측정을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 초기 기전 발견을 전임상 질병 모델링 및 바이오마커 검증과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 여러 발견 프로그램에서 반복적으로 사용할 수 있는 표준화되고 적응 가능한 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 타겟 검증에서의 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 발달 연구를 위해 표준화되고 재현 가능하며 확장 가능한 ex vivo 워크플로우를 제공합니다.
- 전략적 가치: 생물학적 리스크를 조기에 명확히 하여 go/no-go 결정 및 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 발굴 단계 자산의 리스크 조정 우선순위 설정 및 추진을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 배아학, 미세해부 및 ex vivo 조작 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 특수 회전형 병 배양 장비와 현미경 인프라가 필요합니다.
- 재현성과 데이터 비교 가능성을 위해 팀 간의 엄격한 표준화가 요구됩니다.
- 서로 다른 설치류 계통이나 발달 단계에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.
- 배양 기간은 태반 기능에 대한 배아의 의존성으로 인해 제한되며, 이는 분석 가능 시간대를 제약합니다.
바이오제약 FAQ
Chapters in this video
0:00
The Method of Rodent Whole Embryo Culture Using the Rotator-type Culture System
2:06
Setting up Whole Embryo Culture System
3:53
Removal of Embryos from the Uterus
2:52
Preparation of Culture Medium
4:52
Dissection of Rat Embryos
7:27
Results and Discussion
0:07
Introduction
