Name: Biomechanical 및 Mechanobiological 연구 랫 타일 힘줄의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-30T17:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: 학습하세요 생체역학 및 역학생물학 연구를 위한 랫 타일 힘줄 준비 방법을. 추출, 단면적 측정, 세척, 생물반응기 적재 과정을 통해 조직 활력과 무균성을 유지하는 최적화된 실험 절차를 확인하세요.

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이 문서는 M. 씨흐에 학부 학생 연구 보너스로 G.의 부모와 FRSQ하는 장학금으로 NSERC 부여 # 299280, IRSST에 의해 지원되었다. 우리는 비디오 기록 조작을 수행하기위한 Yoan 르뮤 - Laneville 감사합니다.

전에 어떤 조작에, 당신이 실시하는 실험을하고 처분의기구에 따라 사용되는 힘줄의 그룹을 식별해야합니다. 우리의 목적을 위해, 복부 힘줄은 단면적을 측정하여 생물 반응기 챔버에 그들을 맞는 경우 조작하기 때문에 쉽게 그들이 작은되기 때문에 선정되었다. 모든 악기가 autoclaved 또는 70 % 에탄올로 소독되는주의하시기 바랍니다. 또한, 70 % 에탄올을 포함하는 스프레이 병은 각 작업 전에 경험 장갑을 소독하기 위해 각 작업 역 옆에 배치됩니다. 1 부 : 추출 절제술 후, 꼬리는 신중하게 조직 손상을 방지하기 위해 사지에 의해 조작할 수 있습니다. 또한, 세포 생존을 보존하기 위해 모든 조작은 차가운 생리 식염수에 실시하고 있습니다. 1A) 자료 : <ul><li> 차가운 생리 식염수 (D - PBS) </li><li> 얼음 조각 </li><li> 표면 보호 </li><li> 보드를 절단 </li><li> 개별 조작 플레이트 </li><li> 2 500 ML 요리 </li><li> 이 2L 유리 요리 </li><li> 접착제 테이프 </li><li> 1 족집게 </li><li> 1 포셉 </li><li> 1 족집게는 서 </li><li> 외과 가위 1 쌍 </li><li> 1 메스 </li><li> 외과 가위 1 쌍 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 오리 엔테이션 식별 개별 조작 ( "근위"를 "P") </li></ul> 1B) 워크 스테이션 : <ol><li> 표면 보호를 펴고 위에 도마를 놓습니다. </li><li> 얼음 조각과 함께 중간 각이 큰 유리 접시를 입력하고 종이에 그들을 놓으십시오. </li><li> 조작 판의 모서리에 테이프 조각을 막대기와 근위 끝을 나타내는 문자로 식별합니다. </li><li> 차가운 생리 식염수와 함께 중간에 두 개의 작은 유리 요리와 조작 판의 홈을 입력합니다. 얼음이 들어있는 대형 유리 접시에 놓으십시오. </li><li> 표면 보호의 모든 멸균 악기를 구성합니다. </li><li> 생리 식염수가 들어있는 유리 접시 중 하나에 꼬리를 전송합니다. </li></ol> 1C) 노는 : <ol><li> 등의 측면에서 복부 측면을 구별하는 꼬리의 근위 끝에 해부학을 준수. 복부 측면은 힘줄의 큰 번호와 부드럽게 혈액의 작은 방울을 생산하기 위해 꼬리를 당기고하여 확인할 수 혈관 있습니다. </li><li> 당신이 복부 힘줄을 (또는 지느러미 힘줄이​​ 필요하면 복부 쪽 함께) 추출하려는 경우 수술 가위를 사용하여 꼬리 지느러미의 측면을 따라 피부를 잘라. </li><li> 근위 끝에 절개를 열고 조심스럽게 꼬리 끝부분을 조작하여 포셉 또는 손가락을 사용하여 피부를 제거합니다. </li><li> 생리 식염수에 혈액과 머리를 씻어 신선한 솔루션을 포함하는 나머지 유리 접시에 시료를 전송합니다. 장갑을 변경합니다. 가벼운 현미경 아래에서 볼 횡단하는 섹션은 여섯 힘줄이 그룹을 보여줍니다. 각 그룹에서 하나의 힘줄은 각 척추골의 꼬리 끝에 연결된, 그래서 우리는자를 따​​라 새로운 힘줄을 폭로하기 위해 척추 디스크에 상처입니다. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 가벼운 현미경 아래에서 볼 쥐의 꼬리 횡단하는 섹션을 참조하십시오. </li><li> 수술 가위로 짧게 연골 2-3 척추를 통해 말초 끝부분을 잘라 버릴거야. 메스 후 즉시 솔루션에 대체를 사용하여 부드러운 조직을 잘라 도마에 꼬리를 놓습니다. </li><li> 족집게를 사용하여 말초 꼬리 끝에서 하나 힘줄이 밖으로 당기십시오. </li><li> 양쪽 끝에 부드러운하라, 개별 조작 판에 힘줄이 장소. 더 이상의 힘줄이 밖으로 조롱 수 없습니다 때까지 마지막 두 단계를 반복하고 새로운 조직이 노출해야 할 때마다 한 번 척추뼈 짧은 컷. </li></ol> 2 부 : 단면적 측정 7 조직이 기계적 특성이나 자극을 겪습 때, 그 기계적 성질은 스트레스에 힘줄 내부의 힘을 정규화에 의해 설명되어 있습니다. 이것은 우리가 단면적을 평가하는 이유입니다. 2A) 자료 : <ul><li> 광학 미크롬터 </li><li> Stereomicroscope </li><li> 디지털 카메라 </li><li> 가장자리 인식 및 프로필 재건 알고리즘 5,6 </li><li> 차가운 생리 식염수 (D - PBS) </li><li> 1 20 - 200μL 마이크로 볼륨 피펫 </li><li> 광 마이크로 미터 조정 1 헥스 키 </li><li> 이 족집게 / files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg "고도 ="그림 3 "/&gt; 그림 3. 옵틱 미크롬터 </li></ul> 2B) 워크 스테이션 : <ol><li> 소프트웨어 (디지털 카메라 및 알고리즘)을 엽니다. </li><li> 장치에있는 힘줄이 로드할 충분한 공간이 있도록 광학 마이크로 미터를 놓습니다. </li><li> 악기와 손 가까이에 압축을 푼 힘​​줄을 포함하는 유리 그릇을 구성합니다. </li></ol> 2C) 노는 : <ol><li> 두 앵커 시스템이 변할 때까지 차가운 생리 식염수로 측정 구획을 입력합니다. </li><li> 족집게로 끝을 잡고하여 짐칸에 힘줄이 전송합니다. </li><li> 마이크로 피펫을 통해 볼륨 흡입을 사용하여 실리콘 튜브로 한 번에 하나의 끝단을 가져옵니다. 끝이 축 체포 초과하기 전까지 대기음. </li><li> 튜브를 압축하고 stereomicroscope 아래에있는기구를 설치하는 샤프트 체포를 조이십시오. </li><li> 주름이 더 이상 지각할 수 없을 때까지 조직을 관찰하면서 105X 확대에 힘줄을 스트레칭. 추가 0.40 %의 스트레치. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 전에 105x 확대하고 스트레칭 후 텐든 프로젝션. </li><li> 위치를 조정하고 180 ° 회전 위에 힘줄의 깨끗한 이미지를 유지하는 데 중점을 둡니다. </li><li> 긴장, 초점이나 위치를 수정하지 않고 모든 10 ° 회전에서 사진을 가져가라. 회전을 수행에만 로터리 축을를 사용합니다. 의 콘 모양으로 인해, 다음 단계는 힘줄 따라 서로 다른 지점에서 반복될 수 있습니다. </li><li> 당신은 등록한 데이터베이스를 분석하기 위해 가장자리의 인식 및 프로필 재건 알고리즘을 활성화합니다. </li><li> 축 체포 느슨해진 및 마이크로 볼륨 피펫을 사용하여 실리콘 튜브에 공기를 불어로 힘줄이 무료입니다. </li><li> 다시 종료하여 처리, 조작 판에 힘줄이 다시 삽입. </li><li> 얻은 프로필 재건과 단면적의 가치의 모양을 확인합니다. </li></ol> 파트 3 : Rinsing 이전 조작 중 발생했을 수 오염을 제거하려면, 조직은 biosafety 캐비닛 아래에 씻어서 있습니다. 3A) 자료 : <ul><li> 차가운 생리 식염수 (D - PBS) </li><li> 여러 홈 조작 플레이트 </li><li> 개별 조작 플레이트 </li><li> 접착제 테이프 </li><li> 이 족집게 </li><li> 1 족집게는 서 </li></ul> 3B) 워크 스테이션 : <ol><li> 사전에 biosafety 캐비닛 15 분 팬의 전원을 켜고 70 %의 에탄올과 내부 표면을 청소하십시오. </li><li> biosafety 캐비닛 내부의 모든 악기를 가져와. </li><li> 근위 끝을 확인하기 위해 각 플레이트의 모서리에 테이프의 조각 스틱. </li><li> 멸균 생리 식염수와 함께 홈을 입력합니다. </li></ol> 3C) 노는 : <ol><li> 캐비닛에서 추출한 힘줄이있는 조작 판을 소개합니다. </li><li> 족집게를 사용하여, 각 엔드에 부드러운 이해와의 판에서 힘줄을 제거하십시오. </li><li> 젖어도하고 부드럽게 가장 가까운부터 그리고 멀리 홈으로 진행, 여러 홈 조작 판의 각 구역의 생리 식염수에 힘줄이 저어. </li><li> 마지막으로, 잠수함 개별 조작 판에있는 힘줄. </li></ol> 4 부 : 생물 반응기 챔버로 로딩 추가 오염을 피하기 위해 다음과 같은 조작도 biosafety 캐비닛에 실시하고 있습니다. 4A) 자료 : <ul><li> 생물 반응기 챔버 4 </li><li> 무균 앵커 </li><li> 1 무균 배양 접시 </li><li> 콜드 세포 교양 중간 (DMEM) </li><li> Cyanoacrylate </li><li> 이 족집게 </li><li> 핀셋은 서 </li><li> 0.5 - 10μl 마이크로 피펫 볼륨 </li><li> 1 눈금자 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 생물 반응기 챔버 </li></ul> 4B) 워크 스테이션 : <ol><li> 이전 단계도 biosafety 캐비닛에 실현 이래 불필요한 도구 제거는 더 많은 작업 공간을 제공할 것입니다. </li><li> 캐비닛 안에 다른 모든 악기를 가져와. </li></ol> 4C) 노는 : <ol><li> 힘줄 말단을 통해 중심과 조직을 상처의 스풀과 스풀 주위 조작 판에 닻을 놓으십시오. </li><li> 닻을 구르고 조직이 앵커에 연결된 숙박 있도록 동안 느슨한 말단 들어요. 이후 어 회전 중지합니다. </li><li> 같은 수행다른 쪽 끝을과 단계를 반복합니다. </li><li> 그들의 센터 1 사이의 6cm가있을 때까지 동등 이상의 두 앵커를 롤. </li><li> 솔루션에 젖어하고 고정 섹션의 기계적 성질 2-3 향상을 간략하게 건조 수 있도록 힘줄이 느슨하게. </li><li> 페트리 접시에 붓고 cyanoacrylate 및 마이크로 피펫으로 볼륨 2.5μL를 그립니다. </li><li> 생리 식염수에 접착제를 포기하지 않고 상처 접속 조직 cyanoacrylate의 드롭을 적용합니다. 이 방울은 각 앵커에 적용 때까지 반복합니다. </li><li> 힘줄이 아직 완전히 포장되어로 완전히 건조 접착제 5 분 동안 기다리십시오. </li><li> 이 기간 동안 생리 식염수와 챔버 구획을 작성하십시오. </li><li> 손상을 방지하기 위해 생리 식염수 모든 조직을 Rehydrate. </li><li> 단지 앵커를 조작함으로써, 생물 반응기 챔버에 힘줄이 전송 및 전송 중에 누출 및 오염을 방지하기 위해 그것을 닫습니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 : 프로토콜의 결과가 제대로 수행되면, 우리의 조직​​ 엄격한 격리와 준비 절차는 조직 불임, 생존과 무결성을 유지하는 것이 가능하게 보여준다. 먼저, 간단하고 반복적인 추출 방법을 사용하여, 우리는 그것이 추출 후 깨달은 H &amp; E 오염된 부분의 미세한 분석하여 관찰 할 수있는 콜라겐 네트워크를 손상하지 않고 꼬리 힘줄을 추출할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 추출 후 텐든 콜라겐 네트워크 (H &amp; E 물들일 5μm 세로 섹션). 십 일 실시 불임 검사 위해 우리는 다음 교양 힘줄. 매일 우리 한천에 도금 사용 문화 솔루션과 24 시간 동안 그것을 incubated. 어떤 박테리아 성장이 관찰되지 이래, 우리는 우리 노는 오염 발생하지 않는 결론을 내렸다. 프로필 재건 알고리즘과 광 마이크로 미터로, 우리는 오류 7 2 %의 마진 내에서 단면적을 계산하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7. RTT의 프로필 재건. 마지막으로, 우리는 rinsing 단계 이후 12 일 문화 기간 이후 포유류의 세포에 대한 죽은 / LIVE 생존 / 세포 독성 키트를 사용하여 가능성을 평가. 녹색 형광 라이브 세포의 대다수가 분명하고 있기 때문에, 우리는 격리 절차는 살아있는 조직을 보존 성공적으로되었는지 확인할 수 있습니다. 동일한 시험은 생물 반응기 챔버에 힘줄이 부착 후 두 시간 수행되었다. 우리는 앵커의 탈수와 접착제가 모두 앵커 사이의 조직에 전염되지했다고 확인했습니다. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="그림 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 8"> 그림 8. 앵커에서 조직 생존 (녹색 = 라이브 세포, 빨강 = 죽은 세포)

<ol><li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zool.+Lond%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li>
<li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22D%C3%A9shydratation+de+matrices+collag%C3%A9niques+reconstruites+in+vitro%3A+effets+sur+les+propri%C3%A9t%C3%A9s+m%C3%A9caniques+et+histologiques+%5B%5D%22">Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]</a>. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).</li>
<li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li>
<li>Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
<li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &amp, Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li>
<li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li>
<li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &amp, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이러한 실험 절차를 적용하여, 우리는 조직의 종류에 체외 연구에서 다양한 수행할 수 있습니다. 예를 들어 마찬가지로, 조직 변성에 대한 연구는 십일 동안 RTTs에 밑을 자극의 응용 프로그램에 의해 실시되었다. 매일, 우리는 비파괴 응력 완화 시험에서 조직 기계적 특성을 평가했다. 끝에, 우리는 RTT 스트레스 변화를 관찰하기 때문에 기계적 성질의 진행을 분석할 수 있었다. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig9.jpg" alt="그림 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 9"> 그림 9. RTT의 응력 변화 평가 트러프 휴식 테스트 (매일 1-10).

<table><tbody><tr><td>D-PBS </td><td>시약</td><td>Wisent Inc.</td><td>311-410-CL</td><td>식염수</td></tr><tr><td>Glucose </td><td>시약</td><td>Wisent Inc.</td><td>609-037-EL</td><td>식염수&lt;br/&gt;1g/L</td></tr><tr><td>Antibiotics-antimycotics </td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>식염수&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td>배양액</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>시약</td><td>Wisent Inc.</td><td>600-105-CG</td><td>배양액&lt;br/&gt;3.7g/L</td></tr><tr><td>FBS</td><td>시약</td><td>Wisent Inc.</td><td>090150</td><td>배양액&lt;br/&gt;10%</td></tr><tr><td>Antibiotics-antimycotics</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>배양액&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>Optic Micrometer</td><td>도구</td><td>주문제작</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulation plate</td><td>도구</td><td>주문제작</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor chamber</td><td>도구</td><td>주문제작</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biomechanical 및 mechanobiological 연구 랫 타일 힘줄의 준비

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

쥐 꼬리 힘줄 (RTTs)은 힘줄 생리학과 tendinopathy의 분야에서 체외 연구에서 실험에 사용되는 일반적인 생물 학적 모델입니다. 그 조직과 함께 일하는 것은 그들이 매우 연약하기 때문에 도전하고, 지금까지 자신의 격리에 대한 엄격한 세부 프로토콜이 없었다합니다. 이러한 도전에 직면하여, 우리는 RTTs 및 제어 조직 생존, 불임과 정직의 조작을 용이하게하는 방법과 악기를 개발했습니다. 이 문서 biomechanical 및 mechanobiological 연구 RTTs를 준비하는 데 사용되는 실험 절차를 설명합니다. 추출, 단면적 측정이 rinsing 및 생물 반응기 챔버로 로딩 : 우리 작품은 네 가지 주요 단계로 나뉘어져 있습니다. 그들이 쉽게 복제 수 있도록 각 단계에서 모든 절차, 자료 및 조작이 상세하게 제공됩니다. 또한 개발, 특정 악기 소개하는 부분이있다 : RTTs를 분리하는 데 사용되는 조작 판은 단면적 측정 및 고정 시스템 동안 조직을 위치 광학 마이크로 미터는 생물 반응기에 RTTs를 첨부합니다. 마지막으로, 우리는 방법의 유효성을 검사하기 위해 여러 검사 후 얻은 결과를 설명합니다. 생존, 불임 및 무결성 평가는 우리와 같은 절차가 쥐의 꼬리 힘줄과 같은 연약한 조직의 조작에 대해 충분히 엄격한 것을 보여줍니다.

이 문서 biomechanical 및 mechanobiological 연구 쥐의 꼬리 힘줄을 준비하는 데 사용되는 실험 절차를 설명합니다. 준비의 주요 단계 몇 가지 기능은 rinsing 및 생물 반응기 챔버로 로딩, 추출, 단면적 측정으로 시작, 시연하고 있습니다.

Biomechanical 및 Mechanobiological 연구 랫 타일 힘줄의 준비

쥐 꼬리 힘줄(RTTs)은 힘줄 생리학 및 힘줄 병증 분야의 실험실 내(in vitro) 연구에서 흔히 사용되는 생물학적 모델입니다. ...

지금부터 보실 영상에서는 생체역학 및 기계생물학적 연구를 위해 쥐 꼬리 힘줄을 분리하고 준비하는 실험 절차를 다룹니다. 이 논문의 목적은 준비 과정에서 조직의 생존력, 무균 상태 및 무결성을 유지하기 위해 개발하고 최적화한 방법과 기구들을 입증하는 것입니다. 추출을 시작으로 단면적 측정, 세척, 그리고 마지막으로 바이오리액터 챔버로의 장착에 이르기까지 준비 과정의 주요 단계와 관련된 여러 특징에 대해 논의하겠습니다.시작하겠습니다. 세포 생존력을 유지하기 위해 추출은 준비 과정의 첫 번째 단계입니다. 모든 조작은 차가운 seline 용액에서 수행합니다.쥐를 희생시킨 후, 꼬리를 절단하여 70% ethanol로 헹구고 세포 및 용액이 담긴 접시에 옮겨 얼음 위에 둡니다. 힘줄 추출을 용이하게 하려면 피부를 제거해야 합니다. 이때 복측 힘줄을 사용한다는 점에 유의하십시오.크기가 더 작고 장비로 조작하기 더 쉽기 때문에, 꼬리의 등쪽을 따라 절개합니다. 그런 다음 근위단에서 해부학적 구조를 관찰하여 꼬리의 방향이 올바른지 확인합니다. 보시는 바와 같이, 배쪽에는 더 많은 수의 힘줄이 나타나며, 혈액 방울을 통해 혈관의 존재를 확인할 수 있습니다.꼬리를 부드럽게 쥐고, 근위단부터 외과용 가위를 사용하여 절개를 실시합니다. 이때 꼬리의 양 끝부분을 잡아 조작하도록 주의합니다.절개가 완료되면, 손가락이나 핀셋을 사용하여 근위단부터 피부를 제거합니다. 이때 다시 한번 꼬리의 끝부분만을 잡고 조작하도록 주의합니다. 그 후, 털과 혈액을 제거하기 위해 꼬리를 용액에 넣어 헹굽니다.그 후 검체를 신선한 용액이 담긴 접시로 옮겨 얼음 위에 보관합니다. 이 시점에서 실험자는 장갑을 교체한 후 힘줄을 노출시킵니다. 꼬리의 말단 부위를 척추 2~3개 길이만큼 짧게 절제합니다.척추뼈는 건 다발 사이에 보이는 묶음 형태이며, 꼬리를 따라 손가락으로 훑을 때 촉진할 수 있습니다. 척추뼈를 따라 절단한 횡단면의 광학 현미경 관찰 이미지입니다. 각 그룹의 건이 척추뼈에 부착되어 있으며, 복측 조직만을 사용하고 있기 때문에 총 6개의 서로 다른 건 그룹이 있음을 알 수 있습니다.각 절개 시 하부 그룹에서 두 개, 외측 그룹에서 두 개의 힘줄을 포함하여 총 네 개의 힘줄을 당겨 제거합니다. 절제를 위해 수술용 가위로 추간판을 자르고, 절단판 위에서 메스로 연조직을 처리할 수 있습니다. 이 시점에서 더 큰 힘줄 다발의 존재를 통해 복측을 식별할 수 있습니다.방향 확인이 완료되면, 포셉을 사용하여 원위단에서 힘줄을 조심스럽게 추출합니다. 더 이상 분리할 조직이 없을 때, 이전에 보여드린 것과 같이 척추 어깨 부분에서 꼬리 부분을 절제합니다. 추출 후 조직을 즉시 용액에 담그고, 양 끝단을 잡고 세포 용액이 담긴 조작 플레이트로 힘줄을 옮긴 뒤 테이프를 사용하여 근위단을 표시합니다. H&amp;E 염색된 종단면의 현미경 분석 결과, 이 간단하고 반복적인 방법을 통해 추출된 조직 조각이 잘 정렬되고 조밀하게 구성된 콜라겐 네트워크를 가지고 있음을 알 수 있습니다.조작 후 조직이 기계적 자극을 받을 때, 우리는 내부의 힘을 응력으로 정규화하여 기계적 특성을 기술합니다. 따라서 조직의 단면적을 평가해야 합니다. 이를 위해 디지털 카메라가 장착된 실체 현미경을 사용하여 단면 프로파일을 재구성합니다.이 방법을 사용하면 적설 하중이나 응력이 조직에 직접 가해지지 않으므로 조직의 무결성이 유지됩니다. 디지털 카메라는 180도 시야각으로 투영된 시편의 사진을 촬영합니다. 참조 프레임 내에서 비전 어시스턴트 알고리즘이 시편의 상단 및 하단 가장자리를 국소화합니다.그 다음 MATLAB 소프트웨어를 이용한 알고리즘으로 프로파일 재구성을 수행합니다. 조직을 초점 영역 내에 유지하기 위해 광학 마이크로미터를 설계하였습니다. 이 영역을 벗어나면 투영 영상이 흐릿해지며, 다시 초점을 맞출 경우 국부 참조 프레임이 이동하기 때문입니다.마이크로미터에는 조직의 탈수를 방지하기 위한 측정 챔버가 포함되어 있습니다. 회전 스테이지가 포함된 두 개의 포지셔닝 시스템은 시료의 회전을 가능하게 하며, 샤프트 색상에 밀착되어 압축된 실리콘 튜브로 제작된 두 개의 고정 장치가 있습니다. 먼저, 실리콘 튜브 입구가 잠길 때까지 측정 챔버에 차가운 세포 용액을 채웁니다.그 다음, 포셉을 사용하여 스페이스맨의 말단부만 잡고 측정 구획으로 옮깁니다. 마이크로 볼륨 피펫을 사용하여 건 말단부를 실리콘 튜브 안으로 흡입하여 끌어당깁니다. 이후 끝부분이 샤프트 색상 너머로 확장될 때까지 흡입을 수행합니다.양쪽 모두 완료되면, 넥 키(neck key)를 사용하여 튜브를 압착함으로써 샤프트 컬러를 조입니다. 건(tendon)이 고정되었으므로, 장치를 스테레오 현미경 컵 아래에 설치합니다. 이제 컴퓨터 화면을 통해 105배 배율로 건을 직접 관찰할 수 있습니다.일관성을 위해, 주름이 더 이상 보이지 않을 때까지 힘줄을 늘린 후 0.4%의 추가 변형을 가합니다. 시편을 0도에서 170도까지 촬영하므로, 전체 둘레에 걸쳐 선명한 영상을 얻기 위해서는 초기 위치 설정 및 초점 조정이 필요합니다. 실제로, 각 뷰 사이에서 시편 회전각을 10도씩 증가시키며 총 18장의 사진을 촬영합니다.이 방법을 통해 조직을 손상시키지 않고 쥐 꼬리 힘줄의 단면적을 추정할 수 있습니다. 최종적으로 0.5에서 2%의 오차 범위 내에서 프로필 재구성이 이루어집니다. 측정 후에는 이전 조작 과정에서 발생했을 수 있는 오염을 방지하기 위해 조직을 세척합니다.신선한 고정액이 담긴 멸균 조작 플레이트를 캐비닛 안에 배치하며, 하나는 세척 과정에 사용하고 다른 하나는 세척된 건을 받는 용도로 사용합니다. 실험자는 생물안전 작업대(biosafety Cabinet)에 추출된 건을 넣기 전, 70% ethanol로 장갑을 세척합니다. 건의 양 끝단만 잡고 웰에서 웰로 조심스럽게 옮깁니다.마지막으로, 멸균된 세포 용액이 포함된 개별 조작 플레이트로 옮깁니다. 프로토콜 검증을 위해 생존율 및 멸균 테스트를 수행하였습니다. 먼저, 포유류 세포용 live dead viability cytotoxicity kit를 사용하여 세포 생존율을 평가하였습니다.12일간 배양한 후, 대다수의 녹색 형광 살아있는 세포들이 관찰되어 분리 과정이 살아있는 조직을 보존하는 데 성공적이었음을 확인하였습니다. 이후 사용된 배양물의 오염 여부를 확인하기 위한 검사를 수행하였습니다. 배지를 한천 배지에 도말하여 10일 동안 배양한 결과, 박테리아 성장이 관찰되지 않았습니다.본 연구에서는 조작 과정이 무균 상태임을 확인하였습니다. 쥐 꼬리나 힘줄과 같은 작은 시료의 경우, 조직 탈수와 접착제를 활용하는 고정 시스템의 장점을 이용하며, 접착제가 조직 내부로 침투합니다. 이는 모든 하위 단위에서 고정되며, 탈수 과정은 기계적 성질을 향상시켜 추가적인 오염을 방지합니다.모든 로딩 과정은 모든 기구와 챔버 구성 요소가 멸균된 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 수행됩니다. 로딩 작업을 위해 바이오리액터 챔버를 포지셔닝 지그에 고정합니다. 건 앵커(tendon anchors)를 수용할 수 있도록 두 개의 이동식 암을 설정합니다.오염을 방지하기 위해 덮개로 챔버를 닫습니다. 먼저, 조작 플레이트의 양 끝단에 앵커를 배치합니다. 앵커의 스풀을 홈의 세로축 중심과 건(tendon) 위에 맞춥니다.그런 다음 힘줄을 하나의 앵커에 감아 올립니다. 조직의 본체는 용액에 담긴 상태를 유지하며, 앵커를 약 4분의 3바퀴 정도 회전시킵니다. 느슨한 끝부분을 잡음으로써 조직이 앵커에 잘 부착되도록 합니다.동일한 절차를 다른 말단 부위에 반복합니다. 양측 모두 고정되면, 두 말단 사이의 거리가 6 cm가 될 때까지 앵커를 동일하게 말거나 풉니다. 건의 손상된 부위에 2.5 µL의 ocreate를 두 방울 떨어뜨립니다.접착을 위해 주의를 기울입니다. 접착제가 세포 용액에 들어가는 것을 방지하기 위해, 접착제가 완전히 마르도록 최소 5분이 필요합니다. 프로토콜을 검증하기 위해, 접착제와 앵커 포인트의 탈수가 조직 생존력에 미치는 영향을 확인하는 테스트를 수행했습니다.2시간 후, 말단 상태가 조직 외부로 확산되지 않았음을 확인하였습니다. 실제로, 앵커 포인트에서 발견된 적색 형광 사멸 세포와 조직 본체의 대부분을 차지하는 녹색 생존 세포의 경계를 나타내는 명확한 색상 한계선이 관찰됩니다. 그동안 바이오리액터 챔버는 신선한 배양 배지로 채워집니다.건의 일부 상처 부위가 마르면, 세포 용액으로 다시 수화시킵니다. 그 후 핀셋을 사용하여 고정된 조직을 챔버로 옮깁니다. 추가 오염을 방지하기 위해 커버를 닫습니다.챔버가 바이오리액터에 설치되면 포지셔닝 지그를 제거합니다. 지금까지 생체역학 및 기계적 생물학 연구를 위해 쥐 꼬리 힘줄을 준비하는 방법을 시연하였습니다. 이러한 절차를 적용함으로써, 이 조직들에 대해 매우 다양한 인비트로(in vitro) 연구를 수행할 수 있습니다.예를 들어, 10일 동안 자극을 가하여 조직 퇴화에 관한 연구를 수행하였습니다. 매일 조직의 상태, 기계적 특성 및 비파괴적 응력 완화 시험을 평가하였습니다. 결과적으로 응력 변화를 관찰할 수 있었습니다.우리는 엄격한 분리 및 준비 절차를 통해 조직의 생존력과 기능을 유지할 수 있음을 입증하였습니다. 시청해주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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