Name: 실험 면역 Hypophysitis의 유도를위한 마우스 뇌하수체 Immunogen의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 학습하세요 실험 자가면역 뇌하수체염 유도를 위한 마우스 뇌하수체 단백질 추출법입니다. 균질화, 원심분리, BCA 정량 및 전기영동으로 품질을 평가하는 재현 가능한 방법론을 제공합니다.

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이 작품은 PC에 NIH 부여 DK080351에 의해 지원되었다.

실험 프로토콜 이 실험 프로토콜의 첫 번째 단계는 마우스 뇌하수체의 땀샘의 다수를 수집하는 것입니다. 두 번째 단계는 단백질 추출물을 준비하기 위해 분비를 균질하는 것입니다. 세 번째 단계는 기름 혼합 이러한 단백질을 유상으로 만들다하는 것입니다. 1 단계 : 마우스 뇌하수체 분비의 수집과 저장 마우스 뇌하수체는 시신경 chiasm하여 삼차 신경 및 anteriorly로 옆으로 둘러싸인 쐐기 꼴의 뼈 셀라라는 turcica의 우울증에서 두개골 바닥에 앉아있다. 선은 큰 앞쪽에 엽과 작은 후부와 중간 엽 (叶)으로 구성하고, 평균 1.9 MG에 무게입니다. 뇌하수체 분비는 동물 보호 시설에 의해 euthanized 될 운명 혼합 변종, 성별 및 연령의 마우스에서 수집됩니다. 뇌하수체를 분리하려면, 마우스, 해부 두개골 위의 피부를 euthanized, 그리고 두개골의 뼈를 가위로 잘라 열려 있습니다. 두뇌는 다음 주변 두라 메이터으로부터 격리하는 뇌하수체를 노출 채취한 쐐기 꼴의 뼈 밖으로 훔쳐와 드라이 아이스에 플라스틱 튜브에 저장됩니다. 일반적으로 우리는 하나의 단백질 준비, 9 시간 만에 한 사람에 의해 수집된 수있는 번호는 300 마우스 뇌하수체 분비를 사용합니다. 일단 수집이 완료되면, 뇌하수체 분비가 들어있는 튜브 ° C 준비 때까지 다음 단계 -80에 저장됩니다. 2 단계. 마우스 뇌하수체 단백질의 추출 <ol><li> 15 ML 팰컨 튜브 (카탈로그 없음 352,059)을하는 균질화 버퍼를 추가 수집 매 100 뇌하수체 분비에 대한 버퍼 250 μL를 사용하여 얼음 욕조에 보관. 셀 (0.2 M)와 physiologic PH (7.4)의 세포질 내부 생리학 존재하는 것과 유사한 이온 강도의 버퍼를 사용합니다. 우리는 칼륨이 테아제 억제제 칵테일 (시그마 - 알드리치, 카탈로그 노 P8340 - 1ML)을 보충 (0.161 M, pH를 7.4) 호수 버퍼 사용합니다. </li><li> 바로 균질 전에 버퍼에 뇌하수체 분비를 추가하고, 다음 팔콘 튜브 하단의 Polytron 균 질기의 발전기 (5 mm 직경)를 놓으십시오. 얼음 목욕에서 유지하면서 부드럽게 위아래로 팰컨 튜브를 이동, 30 초 동안 최대 rpm으로 균질. 그런 다음, 1 분 얼음 homogenate를 놓습니다. 균질를 반복하고 냉각 두 번 더 단계를 반복합니다. 이 부드러운 균질의 세포를 휴식하고 핵을 방해하지 않고 cytosolic 단백질을 출시한다. </li><li> 핵, 손상되지 않은 조직 및 불용성 물질 (예 : 결합 조직 및 변성 단백질 단지 등) 제거하려면 4 10 분 ° C. 낮은 속도 (1,000g)에서 homogenate를 원심 분리기 </li><li> , 새로운 팰컨 튜브에 (지금 PNS, 포스트 - 원자력 뜨는라고도 함)를 전송 뜨는 펠렛은 그대로두고 돌보는하고, 얼음에 PNS를 저장합니다. </li><li> 균질화 버퍼의 원래 볼륨 (수집된 모든 100 뇌하수체 분비에 대한 버퍼 250 μL)에서 펠렛을 Resuspend, 상기 균질 위와 같이 원심 분리기, 다음 첫 번째와 두 번째 PNS를 결합. </li><li> -80에서 microcentrifuge 튜브 및 저장소로 나누어지는가 두 풀링 PNS 샘플 ° C 다음 단계에 대한 준비까지. 이 단백질 준비는 -80에서 저장할 수 있습니다 ° C 있지만 점차 그 힘을 looses, 그래서 우리가 준비로부터 6 개월 이내에 그것을 사용하는 것이 좋습니다. 겔 전기 영동으로 단백질 수율 및 농도 BCA 분석에 의해 (NO 피어스 카탈로그. 23,225), 그리고 단백질의 품질을 결정하는 작은 나누어지는을 사용합니다. 일반적으로, 우리는 40 MG / ML 주변 농도에서 균질화 버퍼의 1.5 ML 300 마우스 pituitaries에서 단백질의 약 60 MG를 구하십시오. </li></ol> 3 단계. 예방 접종에 대한 감광 유제의 준비 <ol><li> 빠르게 실험에 필요한 냉동 단백질 aliquots을 녹여 20 MG / ML에 단백질 농도를 조정합니다. 이 단백질 추출물 5 MG / Mycobacterium 결핵 (백톤 디킨슨, 231,141)를 죽이고 열을 ML을 포함하는 완전한 프로 인드의 도움이되는 (CFA, 시그마 F - 5881)로 1시 1분을 유화 것입니다. 각 마우스 에멀전 100 μL에 뇌하수체 추출의 1 밀리그램을 받게됩니다. </li><li> 여기에 주어진 예제는 각 마우스가 뇌하수체 단백질의 1 MG를 포함하는 유제 100 μL로 주입됩니다 10 마우스를 immunizing입니다. 준비하는 동안 재료의 손실의 두 가지 별도의 마우스를 허용하므로 뇌하수체 단백질 12 MG를 사용합니다. 20 MG / ML 뇌하수체 단백질 추출물의 바램이 600 μL은 2.5 ML 해밀턴 gastight의 주사기를 사용하여 위에서 설명합니다. 흔들림으로 CFA를 Resuspend, 다른 2.5 ML 해밀턴 주사기로 CFA 600 μL를 열망. 첨부와 CFA 가득한 주사기에 22 게이지 마이크로 emulsifying 바늘을 확보. 천천히 바늘이 CFA으로 가득합니다 이러한 CFA의 주사기의 플런저를 밀어 후 첨부의 다른 쪽 끝을 확보뇌하수체 추출 가득 주사기에 바늘. </li><li> 천천히 단지 소량이 혼합되어 같은 acqueous 뇌하수체 추출물로 오일 구성 요소를 밀어 CFA의 주사기의 플런저를 전진. 다음 CFA의 주사기에 뇌하수체 추출 주사기의 플런저를 뒤로 밀어. 점차적으로 혼합 물질의 양을 증가이 작업을 반복합니다. 두 주사기의 전체 내용이 혼합 때까지 계속합니다. 당신은 물 - 인 - 오일 에멀젼을 나타내는 약간 흰하고 고르게 분산 솔루션을 얻을 것입니다. </li><li> 유제가 형성되면, 유제가 완전히 혼합되도록 적어도 500 번 백업 및 앞뒤 움직임을 반복합니다. 최종 혼합 사이클 후 1시 1분 물 - 인 - 오일 에멀젼 사용 준비가되어 10 MG / ML의 뇌하수체 단백질 농도가 포함되어 있습니다. 유제가로 동반자 조브 문서에서 자세한 내용, subcutaneously anesthetized SJL 마우스로 당일에 주입됩니다. </li></ol>

<ol><li>Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).</li>
<li>Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-lymphocyte-associated+antigen-4+blockage+can+induce+autoimmune+hypophysitis+in+patients+with+metastatic+melanoma+and+renal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer.</a> J Immunother. 28, 593-598 (2005).</li>
<li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).</li>
<li>Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypophysitis+and+Hashimoto%27s+disease+in+a+woman%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman.</a> J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

면역 hypophysitis와 함께 첫 번째 환자는 1962 4보고했다는 사실에도 불구하고, 병원성 뇌하수체 autoantigens 5를 식별하기 위해 남아있다. 동물 모델은 환자 치료에 번역 아르 생체의 발견을 은닉이 autoantigens을 파악하는 것은 매우 유용할 수 있습니다. 이 문서는 실험 동물에서 면역 hypophysitis를 유도에 적합 형태로 뇌하수체 단백질을 준비 간단한 절차를 시연했다.

<table><tbody><tr><td>15-ml Falcon 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>균질화 완충액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 억제제 칵테일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron 균질기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA 분석</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Complete Freund&amp;rsquo;s Adjuvant (CFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-5881</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BD Biosciences</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mL Hamilton 가스 밀폐형 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22-gauge 미세 유화 바늘</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

실험 면역 hypophysitis의 유도를위한 마우스 뇌하수체 immunogen의 준비

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

면역 hypophysitis가 발생하거나 autoimmunity 1과 함께 뇌하수체의 만성 염증이다. 그것은 전통적으로 희귀한 질병으로 간주 되었으나보고 최근 몇 년 동안 현저하게 증가하고 있습니다. Hypophysitis는 사실, 이러한 CTLA - 4 2, PD - 1 수용체와 같은 T lymphocytes에 표현 억제 수용체를 차단하는 항체로 치료 암 환자의 &#39;부작용&#39;로 쓰시하지 개발하고 있습니다. 면역 hypophysitis는 도움이되는 3 혼합 뇌하수체 단백질과 쥐를 주사하여 실험적으로 유도된 수 있습니다. 이 동영상이 문서에서 우리는 마우스 뇌하수체 분비 및 SJL 생쥐의 면역 hypophysitis를 유도에 적합한 형태로 그들을 준비하는에서 단백질을 추출하는 방법을 보여줍니다.

면역 hypophysitis는 마우스 뇌하수체의 단백질 추출물을 주사로 쥐 복제하​​실 수 있습니다.

실험 면역 Hypophysitis의 유도를위한 마우스 뇌하수체 Immunogen의 준비

자가면역성 뇌하수체염은 자가면역에 의해 유발되거나 동반되는 뇌하수체의 만성 염증입니다1. 이는 전통적으로 ...

자가면역성 뇌하수체염은 뇌하수선의 비대와 하나 이상의 뇌하수체 호르몬 결핍을 특징으로 합니다. 원인이 되는 자가항원은 아직 밝혀지지 않았습니다. 본 프로토콜에서는 이 질환을 연구하는 데 사용할 마우스 뇌하수선 단백질의 준비 방법을 설명합니다.먼저 안락사시킨 마우스로부터 뇌하수체를 분리합니다. 그 다음, 세포를 기계적으로 파쇄하여 세포질 단백질을 방출시키기 위해 뇌하수체를 균질화합니다. 균질물을 저속 원심분리로 정제한 후, 비색법인 BCA assay로 양을 측정하고 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 질을 평가합니다.마지막으로, 수성 단백질 균질액을 오일성 면역증강제와 혼합합니다. 그 후 이 혼합물을 마우스에 주입하여 자가면역성 뇌하수체염과 유사한 마우스 모델을 생성합니다. 동반 영상에 표시된 바와 같이, 실험 동물에서 뇌하수체염을 유도하기 위한 네 가지 기술이 설명되어 있습니다.본 논문에서 제시하는 뇌하수체 단백질 혼합 인플루엔자 보조제 주입 기술은 1960년대로 거슬러 올라가는 가장 오래된 방법입니다. 다른 접근 방식으로는 1992년 루벨라 바이러스 유래 수용성 당단백질 주입, 2002년 뇌하수체로의 아데노바이러스 정위 주입, 그리고 2010년 한 쥐 계통의 뇌하수체를 다른 쥐 계통의 신장 캡슐 아래에 이식하는 방법 등이 있었습니다. Florence의 보조제 접근 방식의 주요 장점은 오늘날 덜 침습적이고, 더 일관적이며, 무엇보다 인간의 질환과 매우 유사한 질병을 유도하는 데 더 정확하다는 점입니다.1960년대부터 보고되어 왔음에도 불구하고, 외래 보조제 기법은 뇌하수체염 유도에 있어 낮은 효율을 보였습니다. 박사 과정 연구를 시작했을 때, 기존에 발표된 외래 보조제 프로토콜을 사용해서는 뇌하수체염의 발생률과 중증도를 낮게밖에 얻을 수 없었습니다. 하지만 EM 유제에 포함된 pitu 단백질의 양을 10배로 늘린다는 아이디어를 적용했을 때 상황은 상당히 개선되었습니다.이 방법은 자가면역성 뇌하수체염의 병인에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 자가항원이 아직 밝혀지지 않은 다른 자가면역 질환을 연구하는 데에도 활용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 수작업 기술과 시간, 정성이 요구되는 마지막 단계인 마진(margin) 준비 과정에서 주로 어려움을 겪습니다. 따라서 적절한 에멀전이 어떻게 준비되어야 하는지를 이해하기 위해서는 시각적인 시연이 매우 중요합니다.이 기술의 함의는 자가면

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 어떻게 조직 병리학하여 심각도를 평가하기 위해 SJL 마우스 및 면역 hypophysitis를 유도하는 방법을 보여줍니다.

SJL 마우스의 실험적 면역 Hypophysitis의 유도

이 비디오는 쥐 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유도하기 위해 항원 보조 에멀젼을 생성하는 효율적인 균질화 기술을 보여줍니다. 에멀젼은 물 상태에 자가항원인 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)을 함유하고 있으며, 불활성화된 병원성 박테리아로 구성된 연속적인 오일 상태로 둘러싸여 있습니다. 에멀젼은 장기적인 면역 반응을 위해 항원의 지속적인 방출을 보장합니다.

자가면역 뇌척수염을 유발하기 위한 항원 보조 에멀젼 제조

이 비디오는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질과 불활성화된 결핵균의 조합을 주입하여 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 모델을 통해 연구원들은 질병 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 테스트할 수 있습니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

신경 줄기 / 전구 세포 (NPC가)의 이식은 재생 신경의 큰 약속을 보유하고 있습니다. 의 NPC의 전신 배달은 뇌와 중추 신경계의 실험 만성 염증성 손상에 의해 영향을 설치류 및 영장류의 척수에 줄기 세포를 제공하는 효과적인 침략 낮은 및 치료 매우 효과적인 프로토콜로 설정되어 있습니다.

만성 EAE와 마우스의 신경 줄기 / 전구 세포의 전신 주입

이 보고서에서 우리는 조사자가 안내 포도막염의 마우스 모델을 생성 할 수있는 프로토콜을 제시합니다. 더 일반적으로 실험적 자가면역 포도막염(EAU)이라고 하는 이 확립된 모델은 인간 질병의 여러 측면을 포착합니다. 여기에서는 여러 판독값을 사용하여 질병 진행을 유도하고 모니터링하는 방법을 설명합니다.

실험적 자가면역 포도막염: 안구내 염증성 마우스 모델

본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 다양한 평가 지표

하시모토 갑상선염의 여러 유형의 동물 모델이 확립되었으며, NOD 마우스의 자발성 자가면역 갑상선염도 확립되었습니다. H-2h4 마우스는 HT 유도를 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 모델입니다. 이 기사에서는 이 접근 방식을 설명하고 SAT 쥐 모델을 더 잘 이해하기 위해 병리학적 과정을 평가합니다.

마우스 자발성 자가면역 갑상선염 모델 생성

다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하기 위해, 마우스를 자가항원 및 완전한 프로인트 보조제를 함유하는 유중수 에멀젼으로 면역화시킨다. 이러한 에멀젼의 제조를 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 에멀젼 제조를 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 프로토콜이 여기에 제시된다.

실험적 자가면역 뇌척수염 유도를 위한 항원/보조 에멀젼을 제조하기 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 방법

실험적 자가면역 뇌척수염은 다발성 경화증에서 가장 널리 사용되는 쥐 모델 중 하나입니다. 현재 프로토콜에서는 남녀 모두의 C57BL/6J 마우스에 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드를 면역하여 주로 꼬리와 팔다리의 상행 마비를 초래합니다. 여기서는 EAE 유도 및 평가 프로토콜에 대해 논의합니다.

두 성별의 다발성 경화증 모델링: MOG35-55-유도 실험적 자가면역 뇌척수염

학습하세요 실험 자가면역 뇌하수체염 유도를 위한 마우스 뇌하수체 단백질 추출법입니다. 균질화, 원심분리, BCA 정량 및 전기영동으로 품질을 평가하는 재현 가능한 방법론을 제공합니다.

실험 면역 Hypophysitis의 유도를위한 마우스 뇌하수체 Immunogen의 준비

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