실험 면역 Hypophysitis의 유도를위한 마우스 뇌하수체 Immunogen의 준비

자가면역 뇌하수체염은 뇌하수체가 커지고 하나 이상의 뇌하수체 호르몬이 결핍되는 것이 특징입니다. 원인이 되는 자가항원은 아직 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 이 질병을 연구하는 데 사용하기 위해 마우스 뇌하수체 단백질을 준비하기 위한 프로토콜이 시연됩니다.

첫째, 뇌하수체는 안락사된 쥐에서 분리됩니다. 그런 다음 뇌하수체를 균질화하여 기계적으로 세포를 파괴하고 세포질 단백질을 방출합니다. 균질한 것은 저속 원심분리에 의해 명백하게 하고 colormetric, BCA 분석실험에 의해 양에 대해 평가되고 poly 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 품질을 평가합니다.

마지막으로, 수성 단백질 균질산염을 유성 보조제와 혼합합니다. 그런 다음 이 혼합물을 마우스에 주입하여 자가면역 체리저하염을 닮은 마우스 모델을 만듭니다. 동반 비디오에서 볼 수 있듯이 실험 동물에서 하수체염을 유발하기 위해 4가지 기술이 설명되었습니다.

이 기사에서 제시한 기술, 즉 뇌하수체 단백질 믹스 인플루엔자 보조제를 주입하는 기술은 1960년대로 거슬러 올라가는 가장 오래된 기술입니다. 다른 접근법으로는 1992년 풍진 바이러스의 용해성 당단백질을 주입하는 방법, 2002년 아데노바이러스를 뇌하수체에 직접 주입하는 방법, 2010년에 한 쥐 균주에서 다른 쥐 균주의 신장 캡슐 아래에 뇌하수체를 이식하는 방법 등이 있습니다. 피렌체의 보조 요법의 가장 큰 장점은 요즘에는 덜 침습적이고, 더 일관되며, 무엇보다도 인간과 매우 유사한 질병을 유발하는 데 더 정확하다는 것입니다.

1960년대부터 보고되었지만, 외국의 보조제(adjuvant) 기법은 뇌하수체염(hypophysitis)의 유도에 대해 저조한 성능을 발휘했다. 제가 박사 과정을 시작했을 때, 저는 발표된 외국 보조제 프로토콜(adjuvant protocol)을 사용하여 경미한 저체염 사례와 중증도만 얻을 수 있었습니다. EM 감정에 포함된 피투 단백질의 양을 10배로 증가시킨다는 생각이 들었을 때 상황이 크게 개선됩니다.

이 방법은 자가면역 수행저하증의 발병 기전에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 자가항원이 확인되지 않은 다른 자가면역 질환을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 수동 기술, 시간 및 헌신이 필요하기 때문에 마지막 단계인 마진 준비에 주로 어려움을 겪을 것입니다. 따라서 적절한 에멀젼을 준비하는 방법을 이해하는 데 시각적 시연이 중요합니다.

이 기술의 의미는 자동 면역 분야를 넘어섭니다. 면역을 위해 항원을 준비하는 방법을 아는 것은 단클론 항체 생산 또는 새로운 백신 테스트에도 사용할 수 있습니다. 이 기술을 시연하는 것은 내 실험실의 S Zoo 영웅 Ura와 Mayland al gato가 될 것입니다.

쥐 뇌하수체는 테리카(terica)라고 하는 접형골(sphenoid bone)의 함몰된 두개골 기저부에 위치한 원통형 모양의 분비샘입니다. 샘은 삼차 신경에 의해 측면으로, 앞쪽으로는 시신경 chiasm에 의해 경계를 이룹니다. 그것은 더 큰 전엽과 더 작은 중간 및 후방 엽으로 구성됩니다.

뇌하수체를 분리하려면 가위를 사용하여 안락사된 쥐의 목을 베고 두개골의 뒤쪽에서 앞쪽으로 평행하게 자릅니다. 뇌를 들어 올려 뒤로 뒤집으면 이등변 삼각형의 맥락에서 원통으로 보이는 뇌하수체가 드러납니다. 뇌하수체를 기저로, 삼차 신경을 측면으로, 시신경 chiasm을 꼭짓점으로 사용합니다.

닫힌 집게의 끝으로 분비샘을 돌면 주변의 수막을 부러뜨릴 수 있습니다. 그런 다음 가는 집게를 사용하여 투르카의 세포에서 뇌하수체를 잡고 드라이아이스 위의 플라스틱 튜브에 넣습니다. 한 가지 준비를 위해 300개의 마우스 뇌하수체를 수집합니다.

이 컬렉션에는 약 9 시간이 소요됩니다. 채취가 완료되면 뇌하수체가 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관한다. 15ml Falcon 튜브를 얼음 욕조에 넣습니다.

튜브에 250마이크로리터의 균질화 완충액을 추가합니다. 균질화 직전에 채취한 뇌하수체 100개마다 마우스 뇌하수체를 완충액에 추가합니다. 다음으로, 마우스 뇌하수체와 완충액이 들어있는 Falcon 튜브의 바닥에 직경 5mm 생성기 인 poly tron 균질화기의 끝을 놓고 30 초 동안 최대 속도로 균질화합니다.

튜브를 얼음 위에 유지하면서 부드럽게 위아래로 움직입니다. 그런 다음 균질산염을 얼음 위에 1분 동안 놓습니다. 균질화 및 냉각 단계를 두 번 더 반복합니다.

이 부드러운 균질화는 핵 원심분리기를 파괴하지 않고 세포를 파괴하고 단백질을 방출해야 합니다. 저속으로 균질화, 섭씨 4도에서 10분 동안 약 1000G를 침전물, 핵, 끊어지지 않은 조직 및 결합 조직 및 변성 단백질 복합체와 같은 불용성 물질로 침전합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.

현재 PNS(Post Nuclear Sate)라고 하는 SNA를 새로운 Falcon 튜브 매장으로 이전합니다. 얼음 위의 PNS는 이전과 동일한 부피의 균질화 완충액을 사용하여 펠릿을 후퇴시키고 이전과 같이 균질화 및 원심분리기를 합니다. 두 개의 PNS 샘플을 풀링한 후 용액을 수많은 마이크로 원심분리 튜브에 eloqua합니다.

마이크로 원심분리기 튜브는 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이 단백질 제제는 섭씨 영하 80도에서 안정적이지만 점차 효능을 잃습니다. 따라서 제제 후 6개월 이내에 사용하는 것이 좋습니다.

biy acid assay에 의한 단백질 수율 및 농도를 측정하기 위해 PNS의 작은 부분 표본 하나를 유지합니다. 그런 다음 평균 총 무게가 약 570mg인 300개의 마우스 뇌하수체에서 겔 전기영동으로 단백질 품질을 결정합니다. 조직 10mg당 60mg의 뇌하수체 단백질 또는 1mg의 단백질을 얻을

단백질 농도는 일반적으로 밀리리터당 약 40mg입니다. 여기에 제공된 예는 10마리의 마우스를 면역하는 것입니다. 각 마우스에 뇌하수체 단백질 100mg을 함유한 1마이크로리터의 에멀젼을 주입할 계획이며, 준비하는 동안 재료 손실에 대해 2개의 추가 마우스를 허용하고 여기에서 12mg의 단백질 에멀젼을 준비합니다.

먼저 냉동 단백질 분취액을 손에서 따뜻하게 하여 빠르게 해동합니다. PBS를 사용하여 단백질 농도를 밀리리터당 20mg으로 조정합니다. 다음으로, 12mg에 해당하는 뇌하수체 단백질 추출물 600마이크로리터를 2.5ml Gas Tite Hamilton 주사기에 다시 부유시키고, 1밀리리터당 5mg의 열이 사멸된 결핵균을 함유한 완전한 FRONS 보조제 또는 CFA를 수동으로 흔들어 넣습니다.

그런 다음 600마이크로리터의 CFA를 다른 2.5밀리리터 해밀턴 주사기에 주입합니다. CFA로 채워진 주사기에 22게이지 마이크로 유화 바늘을 부착하고 고정합니다. 바늘에 CFA가 채워지도록 플런저를 천천히 밉니다.

그런 다음 바늘의 다른 쪽 끝을 뇌하수체 단백질 추출물로 채워진 다른 주사기에 부착하고 고정합니다. 주사기 내부에 기포가 갇히지 않도록 하십시오. CFA 주사기의 플런저를 천천히 전진시켜 오일 성분을 뇌하수체 수성 추출물에 밀어 넣어 소량만 혼합되도록 합니다.

그런 다음 뇌하수체 추출물 주사기의 플런저를 CFA 주사기로 밀어 넣습니다. 이 작업을 반복하여 전체 내용물이 혼합될 때까지 혼합된 재료의 양을 점차적으로 늘립니다. 이 희끄무레하고 고르게 분포된 물질은 물과 오일 에멀젼을 나타냅니다.

에멀젼이 형성되면 최종 사이클 후 전체 앞뒤 사이클을 최소 500회 반복하면 주사기에는 뇌하수체 단백질 농도가 이제 밀리리터당 10밀리그램인 일대일 물과 오일 에멀젼이 포함됩니다. 에멀젼은 물 비커에 한 방울 떨어뜨려 에멀젼의 품질을 테스트하는 데 사용할 준비가되었습니다. 에멀젼이 올바르게 준비되면 방울이 표면에서 조밀하고 단단히 유지됩니다.

에멀젼의 품질이 좋지 않으면 더 작은 방울로 퍼지고 쪼개집니다. 에멀젼은 실험적 자가면역 하수체염을 유도하기 위해 SJL 마우스에 제제 당일에 주입됩니다. 이 프로토콜은 수반되는 수직의 jo에 자세히 설명되어 있습니다.

일단 피두선(pitu gland)을 채취하고 기술을 익히면, 한 시간 안에 단백질 교육을 수행할 수 있으며, 얼음 위에서 빠르게 작업하는 것을 기억할 수 있습니다. 이 단계에서, 침수를 준비하는 동안, 약 1 시간이 소요됩니다. 개발 후 초기 혼합 단계에서 천천히 참을성 있게 작업하는 것을 잊지 마십시오.

이 기술은 자가면역 분야의 연구자들이 자가반응성 림프구가 표적 기관을 인식하고 침투하는 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스 뇌하수체에서 단백질 추출물을 준비하는 방법과 이를 크론병 추출물과 혼합하여 면역원으로 사용할 준비가 된 에멀젼을 준비하는 방법에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 비활성화되고 건조한 미생물 결핵이 포함된 주사기와 완전한 독감 가장자리 주사기로 작업하는 것은 실수로 구멍을 뚫을 경우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

따라서 이 절차를 수행하는 동안 항상 G 글로우를 사용하고 바늘을 적절하게 폐기하십시오.