원생 동물문 테미트 굿 반대 리간드 - lytic 펩티드의 Protozoacidal 활동 테스트 체외에서 (원생 동물문 문화) 및 생체내에 (테미트 Hindgut에 Microinjection)

본 절차의 전체적인 목표는 합성된 리간드가 Formosan subterranean termite(마이코테르메스)의 장 내에 있는 셀룰로오스 분해 원생동물에 특이적으로 결합함을 입증하고, 용해성 펩타이드와 결합된 리간드가 혐기성 원생동물 배양을 통한 in vitro 실험 및 termite 후장 주입을 통한 in vivo 실험에서 이러한 원생동물을 사멸시킴을 보여주는 것입니다. 이를 위해 먼저 혐기성 조건에서 worker termite의 장 내 원생동물을 추출합니다. 다음 단계는 형광 결합 리간드가 termite 장 내 원생동물에 결합하는지를 in vitro에서 확인하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 리간드 결합 용해 펩타이드가 시험관 내(in vitro)에서 흰개미 장내 원생동물을 사멸시키는 것을 보여주는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 형광 결합 리간드와 리간드 결합 용해 펩타이드를 흰개미 후장에 주입하여 체내(in vivo)에서 결합과 장내 원생동물의 파괴를 확인하는 것입니다. 원생동물 배양액의 흰개미 후장 주입과 형광 현미경 관찰을 통해, 용해 펩타이드에 결합된 리간드가 시험관 내 및 체내에서 흰개미 장내 원생동물에 결합하여 효율적으로 사멸시킨다는 것을 보여줍니다.

리간드를 용해성 펩타이드에 결합시키면 용해성 펩타이드만 사용했을 때보다 원생동물에 대한 독성이 증가하였습니다. 리간드가 박테리아 세포막에 결합하지 않았기 때문에 E. coli와 같은 비표적 생물에 대한 독성은 감소했지만, 원생동물의 소실은 2주 이내에 흰개미의 사망으로 이어집니다. 지하 흰개미의 장 내 공생 원생동물을 사멸시키기 위해 LIG 용해성 펩타이드를 사용하는 본 발표자의 기술은 흰개미 방제를 위한 대안적 기술을 개발하려는 노력의 일환입니다.

장내 공생균이 없으면 화학 물질에 대한 의존도가 낮아져 흰개미는 죽게 됩니다. 우리는 리간드가 원생동물에 결합하고 리간드 용해 펩타이드가 원생동물을 사멸시킨다는 것을 입증하기 위해 흰개미 장에서 원생동물을 추출합니다. 원생동물 내부의 나무 입자는 자가형광을 나타냅니다. 따라서 형광 리간드로 처리한 원생동물의 결과와 처리하지 않은 원생동물의 결과를 비교하는 것이 중요합니다.

위양성을 방지하기 위해 펩타이드를 후장에 직접 주입합니다. 펩타이드를 흰개미에게 먹일 경우, 중장에 있는 프로테아제와 전장에서 이를 소화시키기 때문입니다. New England Bio Labs의 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 원충에 결합하는 19개의 헵타펩타이드 서열을 식별했습니다. 그중 Trypanosoma brucei 막에서 알려진 추정 당단백질과 유사성을 보이는 펩타이드 서열을 가진 리간드 하나를 선택했습니다.

펩타이드 합성 후, 펩타이드 접합체의 용해 특성을 평가하기 위해 E-D-A-N-S novatech 레진을 이용한 고체상 펩타이드 합성을 통해 합성된 펩타이드를 C 말단 형광 프로브에 결합시켰습니다. 이 과정에서는 실험 하루 전 LSU 단백질 시설에서 미리 합성된 합성 리간드와 용해 펩타이드 접합체를 사용합니다. 사용되는 모든 재료를 sigma coat로 코팅하여 원생동물이나 펩타이드가 표면에 흡착되는 것을 방지하십시오.

균일하게 층을 도포하고 다음 날 사용하기 전까지 하룻밤 동안 건조하십시오. 글로브 박스 내에 팬 박스를 준비하여 제습제와 D형 촉매 스택 팩을 통해 실온에서 공기를 지속적으로 순환시켜 1시간 이상 습도와 산소 수치를 낮추십시오. 20분에서 30분 동안 질소를 지속적으로 글로브 박스에 채우고, 필요할 때마다 추가 질소를 사용하여 혐기성 조건을 유지하십시오.

다음으로, Traeger U 배지를 준비하고 pH를 7로 조정합니다. 글로브 박스 내의 잔류 산소를 제거하기 위해 2.5% hydrogen, 5% carbon dioxide, 92.5% nitrogen 혼합 가스가 연결된 튜브와 200 µL 팁을 사용하여 멸균된 배지를 글로브 박스 내에서 필터링하며 1시간 동안 처리합니다. 재료가 준비되면, 핀셋을 사용하여 페트리 접시에서 흰개미 일개미를 꺼내 70% ethanol이 채워진 비커에 몸 전체를 담그고, 핀셋으로 흰개미를 잡은 상태에서 약 10초 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 표면 오염물을 제거하기 위해 일개미를 ethanol에서 꺼내 깨끗한 Kim wipe 위에서 약 20초 동안 건조시킵니다.

글로브 박스 내에서, 흰개미 장 수집을 위한 Trager U 배지 100 µL가 도포된 실로화된 현미경 슬라이드와 원생동물 수집을 위한 Trager U 배지 900 µL가 담긴 튜브를 준비합니다. 그다음 해부 현미경과 멸균된 미세 팁 핀셋 한 쌍을 사용하여 일개미의 복부를 고정하고, 다른 핀셋으로 복부 끝을 잡아 장을 45도 각도로 부드럽게 위 또는 아래로 끌어올립니다. 이때 중장과 후장을 포함한 장 전체를 한 조각으로 네 개 수집하도록 합니다. 수집한 흰개미 장을 현미경 슬라이드 위의 Trager U 배지 100 µL 한 방울에 놓습니다.

다음으로 슬라이드에서, 멸균된 미세 해부용 프로브 한 쌍으로 후장을 찔러 원생동물을 방출시키고, 200 µL 피펫을 사용하여 장 내용을 900 µL의 Traeger 용액이 들어 있는 1 mL 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 장벽 파편이 침전될 때까지 5초 동안 기다린 후, 상층액 900 µL를 새 튜브로 옮깁니다. 원생동물 배양액 10 µL를 시그마 코팅된 현미경 슬라이드로 옮깁니다.

슬라이드를 준비하여 현미경 200배 배율에서 원생동물의 상태를 확인합니다. 원생동물을 입수한 직후, 공급업체가 권장하는 배양 배지에서 호기성 원생동물, tetra piriformis, amoeba, ug, gleaner, paramecium의 대조군 배양액과 e coli의 하룻밤 배양액을 준비합니다. 고정된 흰개미 장 원생동물 및 기타 원생동물 대조군과 e coli를 10% formaldehyde와 함께 4 °C에서 12시간 동안 고정합니다. 그 후 원생동물 용액을 30 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다.

상층액을 버리고 고정된 원생동물이 포함된 펠릿을 1 mL의 Trager U media로 2회 세척합니다. 펠릿을 1 mL의 Traeger Edia에 현탁시킨 후, 물에 용해되어 최종 농도가 50 µM이 되도록 조절한 형광 염료 E-D-A-N-S가 결합된 합성 리간드 용액 100 µL와 함께 고정된 미생물을 1~2시간 동안 배양합니다. 리간드로 처리한 미생물과 처리하지 않은 대조군을 형광 현미경의 400배 배율에서 관찰하며, 최대 흡수 파장은 341 nm, 청색 영역의 방출 파장은 471 nm로 설정합니다.

리간드가 접합된 용해성 펩타이드(litic peptide)의 특성을 평가하기 위해, 섹션 3에 제시된 방법으로 준비된 원충 배양액 198 µL를 0.5 mL 에펜도르프 튜브(eppendorf tubes) 6개에 각각 분주합니다. 흰개미 장내 원충 배양액 분주량의 절반에 100 µM 농도의 리간드 용해성 펩타이드 솔루션 2 µL를 첨가합니다. 최종 농도가 1 µM이 되도록, 나머지 절반의 분주량에는 대조군으로서 멸균수 2 µL를 첨가합니다.

1시간 후, 각 원생동물 배양액 10 µL를 슬라이드로 옮깁니다. 리간드가 결합된 용해 펩타이드(litic peptide)를 처리한 원생동물의 생존율을 대조군과 비교하여 200배 배율의 현미경으로 관찰합니다. 2단계 가열 수준의 NGI PC 10 마이크로피펫 풀러를 사용하여 니들을 뽑아냅니다. 팁 크기를 20~30 µm로 맞추기 위해, 현미경으로 측정하여 팁 크기를 확인합니다.

마이크로미터를 사용하여 니들 하나에 물에 현탁된 50 µM 형광 표지 리간드를 약 30 µL 채웁니다. 대조군으로 사용하기 위해 부착된 시린지를 사용하여 다른 니들에 물을 채웁니다. 마이크로 피펫을 홀더와 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다. 니들을 두 번째 마이크로 매니퓰레이터의 주입 시스템 홀더에 부착합니다.

초기 주입 매개변수를 펄스 길이 약 1초, 주입 압력 10~12 PSI로 설정합니다. 그다음 니들을 마이크로 피펫 안으로 천천히 진입시킨 후, 풋 페달을 사용하여 용액을 주입합니다. 마이크로 피펫을 제거하고 주입된 용액의 길이를 기록합니다.

버니어 캘리퍼스를 사용하여 마이크로 피펫의 기지 파라미터로부터 주입량을 계산하고, 0.3 µL의 용액을 배출하도록 압력과 펄스 길이를 조정하십시오. 다음으로, 주입을 위해 각 처리군당 20마리의 흰개미를 준비하십시오. 먼저 부드러운 포셉으로 복부 끝을 짜서 직장에 남아 있는 배설물을 제거합니다.

그 다음, 흰개미 일개미들을 얼음 위에 5분 동안 두어 냉각시킴으로써 움직이지 못하게 합니다. 100 µL 피펫 팁을 잘라 흰개미 일개미를 담을 수 있는 수신기를 만듭니다. 메스 날을 사용하여 팁을 10~12 mm 길이로 자른 후, 흰개미의 크기에 맞춰 사용하고 이를 바이알에 넣습니다.

나사 캡을 사용하여 리시버를 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다. 일개미를 페트리 접시 위에 등 쪽이 위로 오게 놓은 다음, 질소 흡입 펌프를 사용하여 일개미의 머리부터 리시버 안으로 흡입하여 일개미의 끝부분이 리시버 밖으로 돌출되게 합니다. 일개미를 리시버에 고정한 상태에서 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 채워진 바늘을 조심스럽게 전진시켜 일개미의 항문에 삽입합니다. 형광 표지된 리간드 또는 대조군용 물 0.3 µL를 주입합니다.

리간드 또는 증류수를 주입한 일개미를 젖은 여과지가 깔린 개별 페트리 접시에 넣고, 26 °C, 상대 습도 78% 조건에서 하룻밤 동안 유지합니다. 24시간 후, 주입된 흰개미의 장을 적출하고 이전에 설명한 방법대로 원생동물을 수집합니다. 형광 현미경을 사용하여 주입된 흰개미의 원생동물 내 리간드 결합을 관찰함으로써, 살아있는 흰개미 내에서 리간드 결합 용해 펩타이드의 용해 특성을 평가합니다.

이전 주입 단계와 동일하게 주입 재료, 장비 및 흰개미를 준비하고, 20마리의 흰개미 일개미 후장에 500 µM 리간드 용해 펩타이드 용액 또는 대조군으로서 물 0.3 µL를 주입합니다. 24시간 후, 여러 일개미의 장을 적출하여 200배 배율의 현미경으로 장 내용물을 관찰하고, 처리된 흰개미 장 내의 모든 원생동물이 사멸했음을 확인합니다. 처리군 및 대조군으로 남은 흰개미들은 습윤 여과지가 깔린 페트리 접시에 보관하며 매일 사망률을 관찰합니다. 형광 프로브가 결합된 리간드가 세 종류의 원생동물인 p grassi, h heart mani 및 sla 모두에 결합함을 확인합니다.

네 마리의 Mosson 지하 흰개미 후장(hind gut)에서, 검출 가능한 밀도로 리간드 결합이 세포 전체 표면에서 발생하며, 특히 축 상의 미세소관 층과 핵이 있는 원생동물의 앞부분 영역에 집중되어 있음을 확인하였습니다. 또한, 테스트한 모든 자유 생활 호기성 원생동물 종에서도 형광이 검출되었으며, 이는 리간드가 원생동물의 일반적인 구조에 결합함을 시사합니다. E. coli에서는 리간드 결합이 관찰되지 않은 반면, 1 µM의 리간드 용해 펩타이드는 Omo 및 지하 흰개미 일개미의 장에서 유래한 세 종류의 원생동물과 유리 생활 T. piriformis를 in vitro에서 10분 이내에 모두 사멸시켰으며, 대조군은 생존 상태를 유지하였습니다.

이 이미지는 리간드 결합 용균 펩타이드로 처리한 흰개미 장내 원생동물의 세포막 무결성이 점진적으로 소실되는 모습을 보여줍니다. 리간드 결합 용균 펩타이드 처리군과 물 처리군 사이에는 e coli 콜로니 수의 차이가 관찰되지 않았으나, 리간드가 없는 용균 펩타이드는 e coli 콜로니 수를 상당히 감소시켰습니다. 이는 용균 펩타이드에 리간드를 부착함으로써 비표적 미생물을 용해로부터 어느 정도 보호할 수 있음을 시사합니다. 500 µM 리간드 결합 용균 펩타이드 0.3 µL를 주입했을 때, 24시간 이내에 집흰개미와 지하흰개미의 장내 원생동물 3종이 모두 사멸했으며, 리간드 결합 용균 펩타이드를 주입한 흰개미는 10일 후에 사멸했습니다.

husen and Colia 2009에서 보여준 바와 같이, 리간드가 접합되지 않은 용해성 펩타이드를 주입했을 때보다 원생동물과 흰개미가 3배 더 빠르게 사멸하였으며, 이는 최적의 배양 조건 하에서 리간드가 용해성 펩타이드의 원생동물 세포 사멸 효율을 증가시킴을 시사합니다. Omo. subterranean 흰개미의 장에서 추출한 세 가지 원생동물 종은 최소 3일 동안 생존하며 건강한 상태를 유지해야 합니다.

하지만 배지에 산소 잔류물이 남아 있으면 원생동물의 이동이 즉시 중단됩니다. 잘못된 배지를 사용하여 세포 내 삼투압이 너무 높아지면 원생동물의 세포막이 팽창하여 원생동물이 파열됩니다. 반대로 세포 내 삼투압이 너무 낮아지거나 세포막이 손상되면 원생동물은 쭈그러들고 수축합니다. 원생동물을 고정하면 형광 결합 리간드가 원생동물에 결합하는 것을 더 쉽게 검출할 수 있습니다.

원충이 자유롭게 움직일 때는 형광을 검출하고 이를 나무 입자의 자가형광과 구별하는 것이 어렵습니다. 이 기술을 숙달하면 보조자의 도움을 받아 시간당 약 30마리의 흰개미에 주입할 수 있습니다. 리간드 콜리티크 펩타이드는 지하 흰개미 장 내의 프로토좀 공생체를 사멸시켜 흰개미를 방제하기 위해 개발되었으나, 인간에게 많은 질병을 일으키는 슬래시 마니아, 포노마, 테, 오디움과 같은 프로토좀 기생충에 대응하는 약물을 개발하는 데에도 유용할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 흰개미 장에서 추출한 원생동물을 배양하고 유지하는 방법, 형광 현미경을 통해 리간드의 원생동물 특이적 결합을 확인하는 방법, 리간드 콜리티크 펩타이드의 원생동물 자살 작용을 in vitro에서 증명하는 방법, 그리고 마지막으로 in vivo 확인을 위해 흰개미 장에 펩타이드를 주입하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.