Name: 원생 동물문 테미트 굿 반대 리간드 - lytic 펩티드의 Protozoacidal 활동 테스트 체외에서 (원생 동물문 문화) 및 생체내에 (테미트 Hindgut에 Microinjection) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-29T17:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 36 s
Description: 배우세요 리간드-리틱 펩타이드 결합체를 이용해 흰개미 장내 원생동물을 체외 및 생체내에서 사멸시키는 방법을. 형광 현미경과 미세주입 기술로 결합 확인 및 살균 효과를 검증합니다.

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우리는 박사 앨리슨 리차드, 형광 리간드 합성, 생명 공학 연구에 대한 Interdisciplinaray 센터, 리간드 - lytic 펩타이드 합성을위한 UF, 그리고 형광 현미경에 대한 액세스를 제공 Socolovsky 현미경 시설에 대한 LSU의 펩타이드 시설의 전 이사 감사드립니다. 기금은 국방부의 SERDP 탐험 개발 프로그램 (SEED), 에너지 및 환경 보호국의학과, 바이오 AgCenter 학제간 팀 프로그램과 루이지애나의 상태에 의해 제공되었다.

실험 1 : 흰개미 굿의 추출은 혐기성 조건 하에서 원생 동물문 <ol><li> 지속적으로 습도 및 산소 레벨을 제어하고 고르지 온도를 제거하기 위해 건조 및 종류 D 촉매가 Stak - 팍스를 통해 공기를 순환하는 글러브 박스에 팬 상자 (코이 연구소)를 사용하십시오. 20-30 분 질소의 지속적인 흐름으로 장갑 상자를 채웁니다. 1 H.위한 산소 센서 (C - 제곱 (주))와 산소 수준을 모니터링 필요할 경우 혐기성 조건을 달성하고 유지하기 위해 질소를 사용합니다. </li><li> 트레거 U 미디어 (트레거 1934)을 준비하고 7.0 산도를 조정합니다. 2.5 % 수소, 5 % 이산화탄소와 산소의 잔류물을 제거하는 1 H에 대해 92.5 %의 질소의 혼합물로 장갑 상자에서 필터 살균 미디어를 뿌리다. </li><li> 의 흡착을 방지하기 위해 Sigmacote를 사용하여 실험에 사용되는 현미경 슬라이드, microcentrifuge 튜브, pipettes, 유리 등 모든 자료를 Silanize 원생 동물문 또는 표면에 펩티드 (Sigmacote, 시그마, # SL - 2, http://www.sigmaaldrich.com/ 등 / medialib / 워드 프로세서 / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf). </li><li> 원생 동물문 흰개미 굿은 엄격하게 혐기성 생물이기 때문에 그들은 산소에 노출되어서는 안됩니다. 따라서 다음 단계는 글러브 박스 (1.1 참조)에서 혐기성 조건 하에서 수행됩니다. 포셉 잠수함 70 %의 에탄올과 약 10 s에 대한 부드럽게 소용돌이 표면 오염 물질을 제거에 흰개미 노동자의 전신으로. </li><li> 에탄올에서 노동자를 제거하고 약 20 S.위한 깨끗한 Kimwipe에 건조 수 작업자 복부를 잡고 부드럽게 45도 각도 위쪽으로 또는 아래쪽으로 창자를 당길 포셉 또 한 쌍의와 복부의 팁을 잡기 위해 멸균 미세 밀고 집게를 사용하십시오. 창자가 직선 각도로 너무 많은 힘을 함께 가져온 경우 따로 깰 가능성이 높습니다. 현미경 슬라이드에 100 μl 트레거 U 미디어의 드롭 10 용기를 배치합니다. </li><li> 피어스 릴리스 살균 훌륭한 해부 프로브 한 쌍의와 내장 원생 동물문 부드럽게 900 μl 트레거 U 미디어를 포함하는 1 ML의 microcentrifuge 관에 200 μl 피펫과 직감의 내용을 전송할 수 있습니다. 직감 벽 조각 (5 S), 새로운 튜브에 뜨는의 양도 900 μl의 침강에 대한 허용 후. </li><li> sigmacoted 현미경 슬라이드에 원생 동물문 문화 10 μl를 전송 200 X의 배율의 현미경으로 원생 동물문의 상태를 확인하십시오. </li><li> 에어로빅 원생 동물문 Tetrahymena의 pyriformis, 아모 이바 SP., Euglena SP. 그리고 Paramecium SP의 관리 문화를 준비합니다. (캐롤라이나 생물학 공급 회사, 벌링턴, NC)뿐만 아니라 공급 업체에서 권장하는 문화 미디어에서 대장균의 하룻밤 문화 등. </li></ol> 실험 2 :에 형광 염료와 결합 리간드 추가 원생 ​​동물문과 박테리아 문화는 표면 세포막과 세포 벽에 바인딩을위한 테스트 우리는 이전에 (http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf보실 수 있습니다 프로토콜) 원생 동물문에 바인딩 19 heptapeptide 시퀀스를 식별하는 파지 디스플레이 라이브러리 (뉴 잉글랜드 Biolabs 부동산, 입스 위치, MA)를 사용합니다. Trypanosoma brucei 막에서 알려진 putative glycoproteins에 유사 보여 펩티드 순서 (ALNLTLH)와 리간드가 합성 및 C - 터미널 형광 프로브 (EDANS, 5 결합했다 - ((2 - Aminoethyl) 아미노) 나프탈렌 - 1 - sulfonic EDANS NovaTag 수지 (EMD Biosciences)를 사용하여 고체 펩타이드 합성 (SSPS)를 통해 산, λmax = 341 nm의, λem = 471 NM). 여기서 우리는 리간드는 흰개미 창자와 원생 동물문 무료 생활의 다른 아니지만 세균에 격리 있다고 원생 동물문에 바인딩 것을 보여줍니다. <ol><li> 문화로 특급에서 설명하는 원생 동물문. 1. 12 H. 4 10 %의 포름 알데히드 ° C와 원생 동물문 수정 </li><li> 원생 동물문 솔루션 (30 XG, 10 분)을 원심 분리기, 표면에 뜨는를 버리고 고정 1ml 트레거 U 미디어 두번 원생 동물문을 포함한 펠렛 씻으십시오. 펠렛은 1 ML 트레거 U 미디어 다시 일시 중지합니다. 또한, 원생 동물문 기타 수정하고, E. 컨트롤 대장균 박테리아. </li><li> 50 μm의의 최종 농도에 형광 염료 EDANS (물 준비)을 결합하여 합성 리간드의 솔루션으로 1-2 H에 대한 고정 미생물을 품어. 리간드는 트레거 U 미디어보다 물 속에서 더 사라져 버린다고합니다. </li><li> 341 nm의 흡광도에서 최대 및 471 nm의 청색에서 지역의 배출량 400 X의 배율에서 형광 현미경으로 미생물을 관찰. </li></ol> 실험 3 : 체외에서 lytic 펩타이드 (원생 동물문 문화)에 결합 리간드의 protozoacidal 활동을 테스트 리간드의 공액 및 lytic 펩타이드 헤케이트는 (Mutwiri 외. 2000) 이전에 LSU 단백질 시설에서 합성되었다. <ol><li> 자료를 Silanize과 무산소 글러브 박스에 흰개미 굿 원생 동물문 문화를 준비S는 특급으로 설명했다. 1. </li><li> aerobe 제어 미생물 (예를 들어, E. 대장균과 자유 생활 원생 동물문 종 티 pyriformis)의 문화를 준비합니다. </li><li> 글러브 박스, 0.5 ML Eppendorf 튜브에 원생 동물문 문화의 198 μl의 피펫 6 aliquots의 혐기성 환경에서. 흰개미 창자 원생 동물문 문화의 aliquots의 절반 (최종 농도 1 μm의)에 리간드 - lytic 펩타이드의 100 μm의 솔루션 2 μl를 추가합니다. aliquots의 다른 절반 (컨트롤)에 물 2 μl를 추가합니다. </li><li> benchtop에서 E. 비슷한 aliquots 준비 대장균과 T. 1 μm의 lytic 펩타이드, 리간드 - lytic 펩타이드 또는 물로 pyriformis. </li><li> 1 H 후, 슬라이드 각 원생 동물문 문화 10 μl를 전송합니다. 200 X의 배율의 현미경으로 컨트롤의에 원생 동물문 처리의 생존을 비교합니다. </li><li> 1 일 이후 H, 약 플레이트 100 μl. E. 10 -4 희석 ° C 야간 37 BHI과 부화에 대장균 문화. 접시에 콜로니 형성 단위의 숫자를 비교합니다. </li></ol> 실험 4 : 흰개미 hindgut에의 형광 염색에 결합 리간드의 분사 <ol><li> 20-30 μm의의 팁 크기를 얻기 위해 듀얼 스테이지 열 수준 (65 48)와 Narishige PC - 10 유리 micropipette의 풀러를 사용하는 바늘 (모델 GD - 1, 1 X 900mm) 당기세요. 마이크로 미터를 사용하여 현미경으로 그것을 측정하여 팁 크기를 확인합니다. </li><li> CA 한 바늘을 입력합니다. 찬란 표시 리간드의 50 μm의 30 μl가 연결된 주사기를 사용하여 물속에서 정지. 제어를위한 물을 다른 바늘을 입력합니다. micromanipulator의 홀더에 micropipette (0.5 μl 용량과 32mm의 길이, 드루먼드 과학 회사)를 연결합니다. 두 번째 micromanipulator에 분사 시스템 홀더에 바늘을 연결합니다. 약 1 S 펄스 길이와 10-12 PSI 주입으로 초기 주입 매개 변수를 설정합니다. micropipette로 천천히 주사를 미리하고 일정한 볼륨 reproducibly 주입되도록 제어 질소 가스 흐름에 연결된 펄스 길이 컨트롤 페달 구동 고속 전자 분사 시스템을 사용하여 솔루션을 주입. 주사 후, micropipette를 제거하고 버니어 캘리퍼스를 사용하여 주입 용액의 길이를 기록합니다. micropipette의 알려진 매개 변수에서 주입된 볼륨을 계산합니다. 질소 가스와 단일 주사에 0.3 μl 솔루션을 추방하기 위해 펄스 길이의 압력을 조정합니다. </li><li> 항문에 배설물 선물을 제거하는 소프트 포셉있는 흰개미 노동자의 복부의 끝에 머리를 묶어라. 5 분 얼음 그들을 재미로 흰개미 노동자를 무력화. </li><li> 메스 블레이드를 사용하여 100 μl 피펫 팁을 절단하여 흰개미 노동자를 보유하는 수신기를 확인합니다. 10 길이 끝을 잘라 - 12mm과 흰개미의 크기에 따라 사용합니다. </li><li> micromanipulator에 리시버를 연결합니다. 는 등의 측면에 페트리 접시에 노동자를 삽입하고 질소 흡입 펌프를 사용하여 수신기에 먼저 작업자 머리를 대기음 수 있도록 수신기에서 작업자 protrudes의 종착역. </li><li> 수신기에있는 흰개미를 들고 조심스럽게 노동자 항문에 삽입하는 micromanipulator를 사용하여 채워진 바늘을 미리. 솔루션의 0.3 μl를 (컨트롤 찬란 표시 리간드 또는 물) 주입. </li><li> 젖은 종이 필터와 함께 별도의 배양 접시에 리간드 또는 물을 주입 노동자를 놓고, 26에서 그들을 유지 ± 2 ° C와 78% RH </li><li> 주입 흰개미의 내장을 근절하다하고 수집 위의 특급 같이 24 H 후 원생 동물문. 1. 수정과 같은 특급과 같이 원생 동물문 관찰합니다. 2. </li></ol> 실험 5 : 생체내에 lytic 펩타이드 (흰개미 hindgut에 주입)에 결합 리간드의 protozoacidal 활동을 테스트 <ol><li> 특급에서 설명한대로 자료를 Silanize. 1. </li><li> 물속에 리간드 - lytic 펩타이드의 500 μm의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 유리 바늘, 수신기 및 흰개미 노동자를 준비 3.4) 단계 3.1) 따르십시오. </li><li> 3.5에서 설명한 방법) 20 흰개미 노동자의 hindgut에 리간드 - lytic 펩타이드 솔루션 (치료) 나 물 (제어)의 0.3 μl를 주입 다음. </li><li> 여러 노동자 24 H에 대한 흰개미, 절멸하다 용기를 잡고 3.6에서 설명한대로) 현미경 굿 내용을 관찰합니다. 및 3.7). </li><li> 흰개미 굿의 원생 동물문의 죽음이 확인 즉시, 촉촉한 필터 종이 배양 접시에 남아있는 치료 흰개미와 컨트롤을 유지하고 일상적인 사망률을 관찰. </li></ol> 대표 결과 : 실험 1 : 보통, foregut, midgut 및 hindgut이 절차는 (그림 1A) 제대로 따라하면 한 조각에서 얻을 수 있습니다. hindgut의 무산소 부분에 고밀도에있는 원생 동물문 및 포셉 (그림 1B 1 &amp; 2)로 hindgut을 천공하여 발표하실 수 있습니다. 최대 킬로그램Formosan 지하 흰개미의 용기 재미 시온단 종은 스핀들 모양의 P.입니다 200-300 μm의 길이 150 μm의 폭이고 육안으로 볼 수 grassii. 두 번째로 큰 종족은 배 모양의 H.입니다 hartmanni (50-140 μm의 길이 30-80 μm의 폭). 가장 작은 종족은 원추 모양의 S.입니다 leidyi (15-50 μm의 길이 8-30 μm의 다양한;. 라이 외 1983). 원생 동물문 종 그림 2에 표시됩니다. 최적의 문화 환경에서 Formosan 지하 흰개미의 내장에서 격리 원생 동물문의 세 종류가 무산소 트레거 U 미디어 (그림 3A)에 적어도 72 H에 대한 살아 있고 건강을 유지합니다. 그러나, 문화 조건이 최적이되지 않은 경우 원생 동물문 빨리 죽을 것이다. 미디어 산소 잔류물이있다면, 원생 동물문의 움직임은 즉시 중단됩니다. 삼투압은 무결성이 밖으로 원생 동물문 윌 솟아오른 곳과 전지의 파열 (그림 3B)의 표면 막에 손상 너무 높거나 멤브레인 경우. 삼투압가 너무 낮거나 세포막을 손상하는 경우에는 원생 동물문 (그림 3C) 주름 및 축소합니다. 실험 2 : 우리는 리간드가 감지 밀도에 Formosan 지하 흰개미의 hindgut에서 원생 동물문의 세 종류로 바운드 형광 프로브에 결합 것으로 확인되었습니다. 리간드 바인딩은 전체 세포의 표면 (그림 4)에서 발생합니다. 바인딩 사이트 axostyle (microtubules의 시트)와 P.의 핵에있는 원생 동물문의 앞쪽에 지역에 집중되어있다 grassii. 우리는 원생 동물문에 의해 섭취 목재 입자의 일부 누덕누덕 기운 autofluorescence을 관찰했다. 표면, axostyle과 핵 (그림 4)에 대한 autofluorescence가 없기 때문에 그러나, autofluorescence는 보통 리간드의 특정 바인딩에서 분별하기 쉽습니다. 우리는 또한 리간드가 원생 ​​동물문에 일반적인 구조에 바인딩하는 것이 좋습니다 모든 테스트를 무료 생활 에어로빅 원생 동물문 종 (그림 5)에서 형광을 감지. 그러나, 리간드 바인딩은 E.에 대한 관찰 않았다 대장균. 실험 3 : 리간드 - lytic 펩타이드 중 하나 μm의는 Formosan 지하 흰개미의 근로자의 창자와 자유 생활 T.에서 원생 동물문의 세 종류를 죽였어 미만 10 분 안에 체외에서 pyriformis, 컨트롤이 살아 남아있는 동안. 그림 6은 리간드 - lytic 펩타이드 대우 원생 동물문 흰개미 굿의 막 무결성의 진보 손실을 보여줍니다. 세포막의 팽창과 파열, 원생 동물문 주름, 죽습니다. 아무 차이는 E.의 숫자에서 관찰되지 않았습니다 리간드 - lytic 펩타이드와 물 사이의 트리 트먼트 대장균 식민지. 노 리간드와 Lytic 펩타이드 그러나, E.의 수를 줄일 상당히 콜리 식민지 (그림 7). 이것은 어느 정도로 리간드의 첨부 파일이 용해 이외의 대상 미생물을 보호하는 것이 좋습니다. 실험 4 : 찬란 표시 리간드의 0.3 μl 50 μm의이 흰개미 노동자의 hindgut에 주입했다, P.에 바인딩 grassii, S. leidyi 및 H. hartmanni는 특급과 비슷한 형광 현미경을 통해 확인되었다. 2 (그림 4). 흰개미 굿 조직 형광 표시하지 않았다. 실험 5 : 0.3 μl 500 μm의 리간드 - lytic 펩타이드의 주입은 24 시간 이내 Formosan 지하 흰개미의 용기 원생 동물문의 세 종류를 죽였어. 흰개미는 공생 원생 동물문의 손실 후 10 일 이내에 사망했다. 이전 Husseneder 및 콜리어 (2009) 흰개미 창자로 lytic 펩타이드의 동일한 농도를 주입했다. 창자 (72 H)의 원생 동물문과 흰개미는 (6 주) 죽은 줄 때까지 첨부된 리간드없이, 그것은 더 많은 시간이 걸렸습니다. 이것은 리간드가 원생 ​​동물문에 lytic 펩티드를 결합하여 대부분 lytic 펩티드의 protozoacidal 효율성을 증가시킬 수있다는 것을 제안합니다. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. A : 창자의 주요 부분 (포어 -, 중반, hindgut)를 보여주는 슬라이드에 Formosan 지하 흰개미 굿, B 1 &amp; 2 : Hindgut은 원생 동물문 들어있는 용기를 내용을 공개 포셉와 피어싱입니다. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Formosan 지하 흰개미의 hindgut에서 발견 원생 동물문 채찍질의 세 종류 : A) Pseudotrichonympha grassii, B) Holomastigotoides hartmanni, 및 C) Spirotrichonympha leidyi. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 문화 원생 동물문,) 건강한는 b)를, 불룩한 세포막과 원생 동물문, C)를 원생 동물문 원생 동물문 줄어들. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 리간드의 바인딩의 확인서 직감을 흰개미에 형광 프로브에 결합, 찬란 표시 리간드 및 치료 컨트롤 (autofluorescence를 보여주는)와 처리 (P. grassii, H. hartmanni, S. leydi 위로부터 아래로) 원생 동물문. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 리간드는 무료 생활 바인딩 에어로빅,) Tetrahymena, B) 아모 이바, C) Euglena에게 원생 동물문, 그리고 D) Paramecium. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. A) 물 (제어) 및 B) 1 μm의 리간드 - lytic 펩타이드와 원생 동물문의 치료. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7. E. 접시에 콜리 식민지 (10 -4 희석) :)) 물 (제어), B로 치료 1 μm의 리간드 - lytic 펩타이드, C로 치료) 1 μm의 lytic 펩타이드로 치료.

<ol><li>Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugates+of+lytic+peptides+and+LHRH+or+%CE%B2CG+target+and+cause+necrosis+of+prostate+cancers+and+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Conjugates of lytic peptides and LHRH or βCG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

리간드 - lytic 펩티드가 성공적으로 효과적으로 암 세포를 (헨젤과 Leuschner 2004, 헨젤 외. 2007) 목표 및 파괴하는 데 사용되었습니다. 이런 개념을 바탕으로, 우리는 표면에 바인딩 heptapeptide 리간드를 개발 Formosan 지하 흰개미의 용기 원생 동물문와 흰개미를 달성하는 흰개미의 창자에 이러한 의무 셀룰로오스 - 소화 symbionts를 파괴할 목적으로 lytic 펩타이드에 결합 제어 (Husseneder 및 콜리 2009). 우리는 성공적으로 파란색 범위에서 방출과 형광 프로브 (EDANS)와 리간드를 사용하여 체외에서 생체내에 Formosan 지하 흰개미의 용기 원생 동물문의 세 종류로 리간드의 결합 확인. 흰개미 굿의 루멘의 나무 입자의 autofluorescence와 원생 동물문에 의해 섭취는 특정 바인딩의 검색을 방해 않습니다. 경험 관찰자가 형광 표시 리간드와 autofluorescence (그림...

<table><tbody><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL-2</td><td></td></tr><tr><td>EDANS</td><td>Novabiochem, EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혐기성 글로브 박스</td><td>Coy Laboratories, Inc.</td><td>주문 제작</td><td></td></tr><tr><td>Intellus 환경 제어기</td><td>Percival Scientific, Inc.</td><td>I36NL</td><td></td></tr><tr><td>PC-10 유리 마이크로피펫 풀러</td><td>Narishige International</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>유리 니들 (모델 GD-1, 1 X 900 mm)</td><td>Narishige International</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Leitz 마이크로매니퓰레이터</td><td>Vermont Optechs, Inc.</td><td>ACS01</td><td></td></tr><tr><td>마이크로인젝터</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1</td><td></td></tr><tr><td>마이크로캡</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-0005</td><td></td></tr><tr><td>LEICA 형광 이미징 시스템</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMRxA2</td><td></td></tr><tr><td>LEICA 해부 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>LEICA 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMLB</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 해부 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ61</td><td></td></tr></tbody></table>

원생 동물문 테미트 굿 반대 리간드 - lytic 펩티드의 protozoacidal 활동 테스트 체외에서 (원생 동물문 문화) 및 생체내에 (테미트 hindgut에 microinjection)

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

우리는 화학 살충제의 사용에 대한 신뢰 감소로 이어질 것이 지하 흰개미 컨트롤에 소설 접근법을 개발하고 있습니다. 지하 흰개미는 나무를 효율적으로 소화하기 위해 노동자의 hindguts의 원생 동물문에 의존하고 있습니다. Lytic 펩티드는 protozoan 기생충 (Mutwiri 외. 2000) 다양한 죽일 표시되며 또한 Formosan 지하 흰개미, Coptotermes formosanus (Husseneder 및 콜리어 2009)의 용기 원생 동물문되었습니다. Lytic 펩티드는 eukaryotes의 특이 현상이 면역 체계의 일부이며, 미생물 (Leuschner 및 헨젤 2004)의 세포막을 파괴. 그들은 높은 eukaryotes (Javadpour 외. 1996)의 전기 중립 콜레스테롤 함유 세포 세포막에 영향을주지 않기 때문에 대부분의 lytic 펩티드는 높은 eukaryotes을 해칠 가능성이 없습니다. Lytic 펩타이드 작업은 리간드의 추가에 의해 특정 세포 유형에 타겟팅할 수 있습니다. 예를 들어, 헨젤 외. (2007) lytic 펩티드 혼자가 아닌 특정 펩티드와 복합가 효과적이지 않을 동안 암 세포막 수용체 리간드와 복합 lytic 펩티드는, 유방암 세포를 파괴하는 데 사용될 수 있다고 보도했다. Lytic 펩티드는 또한 전립선과 고환의 암 세포 (Leuschner 및 헨젤 2004)의 타겟 파괴에 대한 종양 세포의 수용체에 바인딩 인간 호르몬으로 복합되어있다. 이 문서에서 우리는 Formosan 지하 흰개미의 내장에서 원생 동물문의 표면 막에 바인딩 heptapeptide 리간드에 결합 lytic 펩타이드 (헤케이트)의 protozoacidal 활동을 설명하는 데 사용되는 기법을 제시한다. 이러한 기법은 흰개미 노동자의 창자의 근절을 포함, 창자의 무산소 문화 (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, 원생 ​​동물문 Spirotrichonympha leidyi), 형광 염료로 표시된 리간드가 원생 동물문하고 있지만 세균이나 직감 조직에 원생 동물문 자유 사는 다른 흰개미 굿에 바인딩되는 미세한 확인. 우리는 또한 lytic 펩타이드에 결합 같은 리간드 효율적으로 체외 (원생 동물문 문화) 및 생체내 (근로자의 hindgut에 microinjection)의 원생 동물문 흰개미 굿을 죽이고 있지만, 혼자 lytic 펩타이드보다 bacteriacidal는 것을 보여줍니다. 미만 2 주 이내에 흰개미의 죽음에 원생 동물문 연결의 손실. 앞으로, 우리는 유전 흰개미 창자에서 원생 동물문을 죽이고 이후 식민지에서 흰개미를 죽이겠어요 리간드 - lytic 펩티드를 표현하는 &quot;트로이 목마&quot;로 흰개미 식민지를 통해 흰개미의 hindgut 및 확산에 살아남을 수 미생물 엔지니어 것입니다 . 리간드 - lytic 펩티드는 또한 protozoan의 기생충에 대한 약물 개발을위한 유용하게 사용될 수 있습니다.

우리는 리간드가 원생 ​​동물문 lytic 펩티드와 결합하여 형광 현미경 그 리간드를 사용하여 Formosan 지하 흰개미의 용기 원생 동물문 죽이는 셀룰로오스 - 소화 이들의 표면 막에 바인딩 입증 절차를 제시<em&gt; 체외에서</em&gt; (무산소 원생 동물문 문화)와<em&gt; 생체내에</em&gt; (흰개미의 hindgut로 주입).

원생 동물문 테미트 굿 반대 리간드 - lytic 펩티드의 Protozoacidal 활동 테스트 체외에서 (원생 동물문 문화) 및 생체내에 (테미트 Hindgut에 Microinjection)

우리는 화학 살충제 사용에 대한 의존도를 낮출 수 있는 새로운 지하 흰개미 방제법을 개발하고 있습니다. 지하...

본 절차의 전체적인 목표는 합성된 리간드가 Formosan subterranean termite(마이코테르메스)의 장 내에 있는 셀룰로오스 분해 원생동물에 특이적으로 결합함을 입증하고, 용해성 펩타이드와 결합된 리간드가 혐기성 원생동물 배양을 통한 in vitro 실험 및 termite 후장 주입을 통한 in vivo 실험에서 이러한 원생동물을 사멸시킴을 보여주는 것입니다. 이를 위해 먼저 혐기성 조건에서 worker termite의 장 내 원생동물을 추출합니다. 다음 단계는 형광 결합 리간드가 termite 장 내 원생동물에 결합하는지를 in vitro에서 확인하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 리간드 결합 용해 펩타이드가 시험관 내(in vitro)에서 흰개미 장내 원생동물을 사멸시키는 것을 보여주는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 형광 결합 리간드와 리간드 결합 용해 펩타이드를 흰개미 후장에 주입하여 체내(in vivo)에서 결합과 장내 원생동물의 파괴를 확인하는 것입니다. 원생동물 배양액의 흰개미 후장 주입과 형광 현미경 관찰을 통해, 용해 펩타이드에 결합된 리간드가 시험관 내 및 체내에서 흰개미 장내 원생동물에 결합하여 효율적으로 사멸시킨다는 것을 보여줍니다.리간드를 용해성 펩타이드에 결합시키면 용해성 펩타이드만 사용했을 때보다 원생동물에 대한 독성이 증가하였습니다. 리간드가 박테리아 세포막에 결합하지 않았기 때문에 E. coli와 같은 비표적 생물에 대한 독성은 감소했지만, 원생동물의 소실은 2주 이내에 흰개미의 사망으로 이어집니다. 지하 흰개미의 장 내 공생 원생동물을 사멸시키기 위해 LIG 용해성 펩타이드를 사용하는 본 발표자의 기술은 흰개미 방제를 위한 대안적 기술을 개발하려는 노력의 일환입니다.장내 공생균이 없으면 화학 물질에 대한 의존도가 낮아져 흰개미는 죽게 됩니다. 우리는 리간드가 원생동물에 결합하고 리간드 용해 펩타이드가 원생동물을 사멸시킨다는 것을 입증하기 위해 흰개미 장에서 원생동물을 추출합니다. 원생동물 내부의 나무 입자는 자가형광을 나타냅니다. 따라서 형광 리간드로 처리한 원생동물의 결과와 처리하지 않은 원생동물의 결과를 비교하는 것이 중요합니다.위양성을 방지하기 위해 펩타이드를 후장에 직접 주입합니다. 펩타이드를 흰개미에게 먹일 경우, 중장에 있는 프로테아제와 전장에서 이를 소화시키기 때문입니다. New England Bio Labs의 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 원충에 결합하는 19개의 헵타펩타이드 서열을 식별했습니다. 그중 Trypanosoma brucei 막에서 알려진 추정 당단백질과 유사성을 보이는 펩타이드 서열을 가진 리간드 하나를 선택했습니다.펩타이드 합성 후, 펩타이드 접합체의 용해 특성을 평가하기 위해 E-D-A-N-S novatech 레진을 이용한 고체상 펩타이드 합성을 통해 합성된 펩타이드를 C 말단 형광 프로브에 결합시켰습니다. 이 과정에서는 실험 하루 전 LSU 단백질 시설에서 미리 합성된 합성 리간드와 용해 펩타이드 접합체를 사용합니다. 사용되는 모든 재료를 sigma coat로 코팅하여 원생동물이나 펩타이드가 표면에 흡착되는 것을 방지하십시오.균일하게 층을 도포하고 다음 날 사용하기 전까지 하룻밤 동안 건조하십시오. 글로브 박스 내에 팬 박스를 준비하여 제습제와 D형 촉매 스택 팩을 통해 실온에서 공기를 지속적으로 순환시켜 1시간 이상 습도와 산소 수치를 낮추십시오. 20분에서 30분 동안 질소를 지속적으로 글로브 박스에 채우고, 필요할 때마다 추가 질소를 사용하여 혐기성 조건을 유지하십시오.다음으로, Traeger U 배지를 준비하고 pH를 7로 조정합니다. 글로브 박스 내의 잔류 산소를 제거하기 위해 2.5% hydrogen, 5% carbon dioxide, 92.5% nitrogen 혼합 가스가 연결된 튜브와 200 µL 팁을 사용하여 멸균된 배지를 글로브 박스 내에서 필터링하며 1시간 동안 처리합니다. 재료가 준비되면, 핀셋을 사용하여 페트리 접시에서 흰개미 일개미를 꺼내 70% ethanol이 채워진 비커에 몸 전체를 담그고, 핀셋으로 흰개미를 잡은 상태에서 약 10초 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 표면 오염물을 제거하기 위해 일개미를 ethanol에서 꺼내 깨끗한 Kim wipe 위에서 약 20초 동안 건조시킵니다.글로브 박스 내에서, 흰개미 장 수집을 위한 Trager U 배지 100 µL가 도포된 실로화된 현미경 슬라이드와 원생동물 수집을 위한 Trager U 배지 900 µL가 담긴 튜브를 준비합니다. 그다음 해부 현미경과 멸균된 미세 팁 핀셋 한 쌍을 사용하여 일개미의 복부를 고정하고, 다른 핀셋으로 복부 끝을 잡아 장을 45도 각도로 부드럽게 위 또는 아래로 끌어올립니다. 이때 중장과 후장을 포함한 장 전체를 한 조각으로 네 개 수집하도록 합니다. 수집한 흰개미 장을 현미경 슬라이드 위의 Trager U 배지 100 µL 한 방울에 놓습니다.다음으로 슬라이드에서, 멸균된 미세 해부용 프로브 한 쌍으로 후장을 찔러 원생동물을 방출시키고, 200 µL 피펫을 사용하여 장 내용을 900 µL의 Traeger 용액이 들어 있는 1 mL 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 장벽 파편이 침전될 때까지 5초 동안 기다린 후, 상층액 900 µL를 새 튜브로 옮깁니다. 원생동물 배양액 10 µL를 시그마 코팅된 현미경 슬라이드로 옮깁니다.슬라이드를 준비하여 현미경 200배 배율에서 원생동물의 상태를 확인합니다. 원생동물을 입수한 직후, 공급업체가 권장하는 배양 배지에서 호기성 원생동물, tetra piriformis, amoeba, ug, gleaner, paramecium의 대조군 배양액과 e coli의 하룻밤 배양액을 준비합니다. 고정된 흰개미 장 원생동물 및 기타 원생동물 대조군과 e coli를 10% formaldehyde와 함께 4 °C에서 12시간 동안 고정합니다. 그 후 원생동물 용액을 30 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다.상층액을 버리고 고정된 원생동물이 포함된 펠릿을 1 mL의 Trager U media로 2회 세척합니다. 펠릿을 1 mL의 Traeger Edia에 현탁시킨 후, 물에 용해되어 최종 농도가 50 µM이 되도록 조절한 형광 염료 E-D-A-N-S가 결합된 합성 리간드 용액 100 µL와 함께 고정된 미생물을 1~2시간 동안 배양합니다. 리간드로 처리한 미생물과 처리하지 않은 대조군을 형광 현미경의 400배 배율에서 관찰하며, 최대 흡수 파장은 341 nm, 청색 영역의 방출 파장은 471 nm로 설정합니다.리간드가 접합된 용해성 펩타이드(litic peptide)의 특성을 평가하기 위해, 섹션 3에 제시된 방법으로 준비된 원충 배양액 198 µL를 0.5 mL 에펜도르프 튜브(eppendorf tubes) 6개에 각각 분주합니다. 흰개미 장내 원충 배양액 분주량의 절반에 100 µM 농도의 리간드 용해성 펩타이드 솔루션 2 µL를 첨가합니다. 최종 농도가 1 µM이 되도록, 나머지 절반의 분주량에는 대조군으로서 멸균수 2 µL를 첨가합니다.1시간 후, 각 원생동물 배양액 10 µL를 슬라이드로 옮깁니다. 리간드가 결합된 용해 펩타이드(litic peptide)를 처리한 원생동물의 생존율을 대조군과 비교하여 200배 배율의 현미경으로 관찰합니다. 2단계 가열 수준의 NGI PC 10 마이크로피펫 풀러를 사용하여 니들을 뽑아냅니다. 팁 크기를 20~30 µm로 맞추기 위해, 현미경으로 측정하여 팁 크기를 확인합니다.마이크로미터를 사용하여 니들 하나에 물에 현탁된 50 µM 형광 표지 리간드를 약 30 µL 채웁니다. 대조군으로 사용하기 위해 부착된 시린지를 사용하여 다른 니들에 물을 채웁니다. 마이크로 피펫을 홀더와 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다. 니들을 두 번째 마이크로 매니퓰레이터의 주입 시스템 홀더에 부착합니다.초기 주입 매개변수를 펄스 길이 약 1초, 주입 압력 10~12 PSI로 설정합니다. 그다음 니들을 마이크로 피펫 안으로 천천히 진입시킨 후, 풋 페달을 사용하여 용액을 주입합니다. 마이크로 피펫을 제거하고 주입된 용액의 길이를 기록합니다.버니어 캘리퍼스를 사용하여 마이크로 피펫의 기지 파라미터로부터 주입량을 계산하고, 0.3 µL의 용액을 배출하도록 압력과 펄스 길이를 조정하십시오. 다음으로, 주입을 위해 각 처리군당 20마리의 흰개미를 준비하십시오. 먼저 부드러운 포셉으로 복부 끝을 짜서 직장에 남아 있는 배설물을 제거합니다.그 다음, 흰개미 일개미들을 얼음 위에 5분 동안 두어 냉각시킴으로써 움직이지 못하게 합니다. 100 µL 피펫 팁을 잘라 흰개미 일개미를 담을 수 있는 수신기를 만듭니다. 메스 날을 사용하여 팁을 10~12 mm 길이로 자른 후, 흰개미의 크기에 맞춰 사용하고 이를 바이알에 넣습니다.나사 캡을 사용하여 리시버를 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다. 일개미를 페트리 접시 위에 등 쪽이 위로 오게 놓은 다음, 질소 흡입 펌프를 사용하여 일개미의 머리부터 리시버 안으로 흡입하여 일개미의 끝부분이 리시버 밖으로 돌출되게 합니다. 일개미를 리시버에 고정한 상태에서 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 채워진 바늘을 조심스럽게 전진시켜 일개미의 항문에 삽입합니다. 형광 표지된 리간드 또는 대조군용 물 0.3 µL를 주입합니다.리간드 또는 증류수를 주입한 일개미를 젖은 여과지가 깔린 개별 페트리 접시에 넣고, 26 °C, 상대 습도 78% 조건에서 하룻밤 동안 유지합니다. 24시간 후, 주입된 흰개미의 장을 적출하고 이전에 설명한 방법대로 원생동물을 수집합니다. 형광 현미경을 사용하여 주입된 흰개미의 원생동물 내 리간드 결합을 관찰함으로써, 살아있는 흰개미 내에서 리간드 결합 용해 펩타이드의 용해 특성을 평가합니다.이전 주입 단계와 동일하게 주입 재료, 장비 및 흰개미를 준비하고, 20마리의 흰개미 일개미 후장에 500 µM 리간드 용해 펩타이드 용액 또는 대조군으로서 물 0.3 µL를 주입합니다. 24시간 후, 여러 일개미의 장을 적출하여 200배 배율의 현미경으로 장 내용물을 관찰하고, 처리된 흰개미 장 내의 모든 원생동물이 사멸했음을 확인합니다. 처리군 및 대조군으로 남은 흰개미들은 습윤 여과지가 깔린 페트리 접시에 보관하며 매일 사망률을 관찰합니다. 형광 프로브가 결합된 리간드가 세 종류의 원생동물인 p grassi, h heart mani 및 sla 모두에 결합함을 확인합니다.네 마리의 Mosson 지하 흰개미 후장(hind gut)에서, 검출 가능한 밀도로 리간드 결합이 세포 전체 표면에서 발생하며, 특히 축 상의 미세소관 층과 핵이 있는 원생동물의 앞부분 영역에 집중되어 있음을 확인하였습니다. 또한, 테스트한 모든 자유 생활 호기성 원생동물 종에서도 형광이 검출되었으며, 이는 리간드가 원생동물의 일반적인 구조에 결합함을 시사합니다. E. coli에서는 리간드 결합이 관찰되지 않은 반면, 1 µM의 리간드 용해 펩타이드는 Omo 및 지하 흰개미 일개미의 장에서 유래한 세 종류의 원생동물과 유리 생활 T. piriformis를 in vitro에서 10분 이내에 모두 사멸시켰으며, 대조군은 생존 상태를 유지하였습니다.이 이미지는 리간드 결합 용균 펩타이드로 처리한 흰개미 장내 원생동물의 세포막 무결성이 점진적으로 소실되는 모습을 보여줍니다. 리간드 결합 용균 펩타이드 처리군과 물 처리군 사이에는 e coli 콜로니 수의 차이가 관찰되지 않았으나, 리간드가 없는 용균 펩타이드는 e coli 콜로니 수를 상당히 감소시켰습니다. 이는 용균 펩타이드에 리간드를 부착함으로써 비표적 미생물을 용해로부터 어느 정도 보호할 수 있음을 시사합니다. 500 µM 리간드 결합 용균 펩타이드 0.3 µL를 주입했을 때, 24시간 이내에 집흰개미와 지하흰개미의 장내 원생동물 3종이 모두 사멸했으며, 리간드 결합 용균 펩타이드를 주입한 흰개미는 10일 후에 사멸했습니다.husen and Colia 2009에서 보여준 바와 같이, 리간드가 접합되지 않은 용해성 펩타이드를 주입했을 때보다 원생동물과 흰개미가 3배 더 빠르게 사멸하였으며, 이는 최적의 배양 조건 하에서 리간드가 용해성 펩타이드의 원생동물 세포 사멸 효율을 증가시킴을 시사합니다. Omo. subterranean 흰개미의 장에서 추출한 세 가지 원생동물 종은 최소 3일 동안 생존하며 건강한 상태를 유지해야 합니다.하지만 배지에 산소 잔류물이 남아 있으면 원생동물의 이동이 즉시 중단됩니다. 잘못된 배지를 사용하여 세포 내 삼투압이 너무 높아지면 원생동물의 세포막이 팽창하여 원생동물이 파열됩니다. 반대로 세포 내 삼투압이 너무 낮아지거나 세포막이 손상되면 원생동물은 쭈그러들고 수축합니다. 원생동물을 고정하면 형광 결합 리간드가 원생동물에 결합하는 것을 더 쉽게 검출할 수 있습니다.원충이 자유롭게 움직일 때는 형광을 검출하고 이를 나무 입자의 자가형광과 구별하는 것이 어렵습니다. 이 기술을 숙달하면 보조자의 도움을 받아 시간당 약 30마리의 흰개미에 주입할 수 있습니다. 리간드 콜리티크 펩타이드는 지하 흰개미 장 내의 프로토좀 공생체를 사멸시켜 흰개미를 방제하기 위해 개발되었으나, 인간에게 많은 질병을 일으키는 슬래시 마니아, 포노마, 테, 오디움과 같은 프로토좀 기생충에 대응하는 약물을 개발하는 데에도 유용할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 흰개미 장에서 추출한 원생동물을 배양하고 유지하는 방법, 형광 현미경을 통해 리간드의 원생동물 특이적 결합을 확인하는 방법, 리간드 콜리티크 펩타이드의 원생동물 자살 작용을 in vitro에서 증명하는 방법, 그리고 마지막으로 in vivo 확인을 위해 흰개미 장에 펩타이드를 주입하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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배우세요 리간드-리틱 펩타이드 결합체를 이용해 흰개미 장내 원생동물을 체외 및 생체내에서 사멸시키는 방법을. 형광 현미경과 미세주입 기술로 결합 확인 및 살균 효과를 검증합니다.

원생 동물문 테미트 굿 반대 리간드 - lytic 펩티드의 Protozoacidal 활동 테스트 체외에서 (원생 동물문 문화) 및 생체내에 (테미트 Hindgut에 Microinjection)

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