Name: 콜드 preconditioning에서 Neuroprotection 연구를위한 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: 학습하세요 콜드 preconditioning을 이용한 신경보호 메커니즘 연구 방법을 토끼 해마 슬라이스 배양을 통해 TNF-α와 interleukin 11 사이토카인 신호를 분석하고 수술 및 마취 관련 신경손상 예방 치료 표적을 식별하는 기술을 익히세요.

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이 작품은 국립 신경 장애 뇌졸중 연구소 (NS - 19108), 편두통 연구 재단, 그리고 리처드 P. Kraig로 화이트 재단 교부금에 의해 투자되었다. 미스 마샤 P. Kraig는 문화 매체와 슬라이스 문화의 유지 보수의 준비에 도움. 우리는이 문서의 최종 버전에 대한 그녀의 의견과 수정에 대한 옐레나 Grinberg 감사합니다.

<ol><li>Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+in+hippocampal+slice+cultures+involves+changes+in+voltage-gated+Na%2B+channel+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression.</a> Brain Res. 998, 155-163 (2004).</li>
<li>Beattie, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synaptic+strength+by+glial+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synaptic strength by glial TNFalpha.</a> Science. 295, 2282-2285 (2002).</li>
<li>Breder, C. D., Dewitt, D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+inducible+cyclooxygenase+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of inducible cyclooxygenase in rat brain.</a> J Comp Neurol. 355, 296-315 (1995).</li>
<li>Caggiano, A. O., Breder, C. D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+elevation+of+cyclooxygenase-2%2C+but+not+lipoxygenase%2C+in+regions+synaptically+distant+from+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Long-term elevation of cyclooxygenase-2, but not lipoxygenase, in regions synaptically distant from spreading depression.</a> J Comp Neurol. 376, 447-462 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+nitric+oxide+influence+induction+of+reactive+gliosis+from+spreading+depression+in+microglia+but+not+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes.</a> J Comp Neurol. 369, 93-108 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+and+4-aminopyridine+prevent+the+lipopolysaccharide-induced+outwardly+rectifying+potassium+current+and+interleukin-1beta+production+in+cultured+rat+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 and 4-aminopyridine prevent the lipopolysaccharide-induced outwardly rectifying potassium current and interleukin-1beta production in cultured rat microglia.</a> J Neurochem. 70, 2357-2368 (1998).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E+receptor+subtypes+in+cultured+rat+microglia+and+their+role+in+reducing+lipopolysaccharide-induced+interleukin-1beta+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E receptor subtypes in cultured rat microglia and their role in reducing lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta production.</a> J Neurochem. 72, 565-575 (1999).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+therapies+for+stroke+and+traumatic+brain+injury+often+display+U-shaped+dose+responses%3A+occurrence%2C+mechanisms%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Drug therapies for stroke and traumatic brain injury often display U-shaped dose responses: occurrence, mechanisms, and clinical implications.</a> Crit Rev Toxicol. 38, 557-577 (2008).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+stress+response+terminology%3A+Integrating+the+concepts+of+adaptive+response+and+preconditioning+stress+within+a+hormetic+dose-response+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).</li>
<li>Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis%3A+the+dose-response+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis: the dose-response revolution.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 175-197 (2003).</li>
<li>Hansel, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD4%2B+T-cell+gene+expression+in+allergic+subjects+using+two+different+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD4+ T-cell gene expression in allergic subjects using two different microarray platforms.</a> Allergy. 63, 366-369 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Kunkler, P. E., Fedynyshyn, J. P., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+multiplexed+bead-based+cytokine+immunoassays+for+rat+serum+and+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 136, 87-98 (2004).</li>
<li>Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+IgG+is+neuroprotective+via+enhancing+microglial+recycling+endocytosis+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-alpha.</a> J Neurosci. 28, 12199-12211 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+clasmatodendrosis+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture.</a> Glia. 33, 169-179 (2001).</li>
<li>Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+and+Microglial+Hormetic+Involvement+in+Neurological+Health+and+Migraine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Dose-Respose+Society%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha and Microglial Hormetic Involvement in Neurological Health and Migraine.</a> International Dose-Respose Society. , (2010).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+cytokine+protein+expression+profiles+from+spreading+depression+in+hippocampal+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+current+source+density+analysis+in+hippocampal+organotypic+culture+shows+that+spreading+depression+occurs+with+uniquely+reversing+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents.</a> J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytosis+from+excitotoxic+injury+in+hippocampal+organ+culture+parallels+that+seen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+precede+electrophysiological+changes+of+spreading+depression+in+hippocampal+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures.</a> J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%2FQ+Ca2%2B+channel+blockade+stops+spreading+depression+and+related+pyramidal+neuronal+Ca2%2B+rise+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture.</a> Hippocampus. 14, 356-367 (2004).</li>
<li>Lambertsen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+protect+neurons+against+ischemia+by+synthesis+of+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor.</a> J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).</li>
<li>Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis+and+disease+resistance%3A+activation+of+cellular+stress+response+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis and disease resistance: activation of cellular stress response pathways.</a> Hum Exp Toxicol. 27, 155-162 (2008).</li>
<li>Ning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+simultaneous+gene+profiling+of+84+drug-metabolizing+genes+in+primary+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Systematic and simultaneous gene profiling of 84 drug-metabolizing genes in primary human hepatocytes.</a> J Biomol Screen. 13, 194-201 (2008).</li>
<li>Oppenheim, J., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOppenheim%2C+J+%22in+Cytokine+Reference%22">in Cytokine Reference</a>. Oppenheim, J. J., Feldman, M. 1, Academic. New York. (2001).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45-e45 (2001).</li>
<li>Stellwagen, D., Beattie, E. C., Seo, J. Y., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+and+GABA+receptor+trafficking+by+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha.</a> J Neurosci. 25, 3219-3228 (2005).</li>
<li>Stellwagen, D., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaling+mediated+by+glial+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaling mediated by glial TNF-alpha.</a> Nature. 440, 1054-1059 (2006).</li>
<li>Streit, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+neuroprotective%2C+immunocompetent+cells+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS.</a> Glia. 40, 133-139 (2002).</li>
<li>Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+augmentation+of+ischaemia-related+neuronal+death+by+tumour+necrosis+factor-alpha+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro.</a> Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

냉간 preconditioning neuroprotection에 참여 시토킨 신호 시스템의 묘사에 중요한 두 가지 근본적으로 중요한 개념은 그림 6과 그림 7에 있습니다. 첫째, 크린 시토킨 정상적인 두뇌의 분자 신호를 매우 낮은 농도입니다. 그럼에도 불구하고, 생리학 시토킨 농도 변화 때문에 유전자 발현을 변경하는 능력 (그림 6)의 뇌 구조와 기능 (즉, 표현형)을 변경하는 엄청난 잠재력이 있습니다. 또한, 크린 시토킨 비​​슷한 효과와 단일 시토킨 변수 효과 (그림 7)을 가질 수있을 수 높은 중복하고 여러 크린 시토킨에 pleiotropic 있습니다. 따라서, 정확하게 차가운 - preconditioning, (또는 다른 생리 preconditioning 자극)와 관련된 신호 변수의 복합 분석 것은 결정되어야합니다에서 neuroprotection에 대한 본래 시토킨 - 기지를 설립. 이것은 멀티 플렉스 전략 분석을 통해 수행됩니다. 이것은 차가운 - preconditioning neuroprotection의 시토킨 "서명"을 수립합니다. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 두뇌 시토킨 신호의 파워. 삽화 다른 잘 인식 '매쉬'의 농도에 비해 뇌 크린 시토킨의 생리적 농도의 거대한 신호 전력을 전달. 농도는 기준점으로 하나의 고양이 수염으로 시작, 거리의 역수로 표현된다. 나트륨 (10 -1 M은 고추의 입자에 의해 그림)와 칼륨이 (토마토로 그림 10 -3 M) 각각 150 주변 3 MM의 수준에서 중간 뇌 공간에 존재, 및 잘 인식 역할을 신경 세포 electrophysiological 기능을 수행합니다. 마찬가지로, PH (즉, ~ 10 -7 M 수소 이온의 수준과 시카고의 레이크 프런트를 따라 780m로 그림)과 칼슘 (즉, 7.8 km는 맥코믹에서 시카고의 레이크 프런트 따라 위성 Google 이미지에서 본 그림과 같이 ~ 10 -8 M 수준 ) 시카고 대학 근처에 하이드 파크 (Hyde Park) 프로 몬 토리 포인트에 놓습니다. 또한,이 농도 이상의 중간 공간에 출시 신경 전달 물질은 현지 뇌 영역의 활동에 영향을 미칩니다. 반대로, 크린 시토킨는 (지구에서 화성의 거리로 표시) 이상의 천만 배 적은 농도에서 뇌 기능을 변경할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7. 타고난 시토킨 경로의 인터랙티브 신호. 크린 시토킨 상당히 중복하고 여러 크린 시토킨에 pleiotropic 아르 비슷한 효과를 가질 수 있으며 하나의 시토킨 변수 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 다양성은 리간드, 수용체, 그리고 phosphoproteins의 수준에서 발생하는 복잡한 상호 작용 신호 때문이다. 또한 복잡한 두뇌 세포 특정 타고난 시토킨, 수용체, 관련 phosphoprotein 변경 각각의 능력과 다양한 세포 유형으로 구성되어있다는 사실에서 유래. 여기에 설명을 위해 경로를 (면역 세포 연구에서 파생된) 신호에만 타고난 시토킨가 표시됩니다. 단순 들어, 두뇌는 본래 크린 시토킨에 대한 잠재적인 상호 작용을 보여주는 하나의 셀 (흰색 라인) (IL - 1α와 IL - 1β () IL - 1α / β, TNF - α, IL - 6로 여기에 언급로 그려진 것입니다 IFN - γ와 IL - 10), 수용체 (IL - 1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR 및 IL - 10R) 및 phosphoproteins (즉, kinases ERK1 / 2, P38 (P38 - MAPK)와 JNK) 및 전사 요인 (ATF - 2, NFκB와 STAT3). ATF - 2를 통해 유전자 발현을 실행 JNK, p38 - MAPK 및 ERK1 / 2에 TNFR1 통해 예를 들어, TNF - α는 신호. TNF - α는 NFκB 활성화를 통해 직접 유전자 발현을 바꿀지도 모르겠어. 함께, 이러한 전사 인자의 활성화로 표시 크린 시토킨 및 수용체의 표현 (뭉툭한 끝) 증가 (화살표) 및 감소 보여주고 있습니다. 중요한 것은, 이러한 경로 하나 시토킨에 변화 (예를 들어, TNF - α) 다른 (예를 들어, IL - 1β) 크린 시토킨의 영향 생산을 보여줍니다. 따라서, 정확하게 차가운 - preconditioning, 관련 신호 변수의 복합 분석을 결정해야합니다에서 neuroprotection에 대한 시토킨 - 기지를 설립. 이것은 감기 - preconditioning의 본래 시토킨 "서명"을 수립합니다. (이미지 참조 # 25 데이터에서 컴파일되었습니다.)

슬라이스 문화의 준비 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Millicell - CM 조직 문화를 삽입 (30 ㎜) </td><td> 써모 피셔 </td><td> PICM0 - 3050 </td><td></td></tr><tr><td> 기초 중간 이글 </td><td> Invitrogen </td><td> 21,010 </td><td></td></tr><tr><td> 얼의 밸런스드 소금 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> E2888 </td><td></td></tr><tr><td> 호스 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35,050 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15,295 </td><td></td></tr><tr><td> D - 글루코오스 </td><td> 시그마 </td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> BSL - 1 퓸 후드 </td><td> 빵 굽는 사람 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 맥일웨인 조직 헬기 </td><td> Brinkmann </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 테플론 디스크 </td><td> Brinkmann </td><td> 023-49-310-1 </td><td></td></tr><tr><td> 주걱 </td><td> 써모 피셔 </td><td> 14-373 - 25A </td><td></td></tr><tr><td> 곡선 홍채 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14091-09 </td><td></td></tr><tr><td> 롱 스트레이트 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14002-14 </td><td></td></tr><tr><td> 롱 포셉 </td><td> 써모 피셔 </td><td> 13-812-40 </td><td></td></tr><tr><td> 직각 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11808-02 </td><td></td></tr><tr><td> 짧은 포셉 </td><td> 써모 피셔 </td><td> 13-812-38 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Inox 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> 이 이리스 spatulae </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 10094-13 </td><td></td></tr><tr><td> 150 X 15mm 페트리 요리 </td><td> 써모 피셔 </td><td> 08-757-148 </td><td></td></tr><tr><td> 60 X 15mm 페트리 요리 </td><td> 써모 피셔 </td><td> 08-757 - 100B </td><td></td></tr><tr><td> 와일드 M8 stereomicroscope </td><td> 와일드 Heerbrugg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gey의 균형 소금 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> G9779 </td><td></td></tr><tr><td> Blak - 레이 단파 자외선 측정 미터 </td><td> UVP </td><td> J - 225 </td><td></td></tr><tr><td> 6 - 잘 팰컨 문화 요리 </td><td> 써모 피셔 </td><td> 08-772 - 1B </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21,103</td><td></td></tr><tr><td> B27 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 17,504 </td><td></td></tr><tr><td> Gem21 Neuroplex </td><td> 제미 Bioproducts </td><td> 400-160-010 </td><td></td></tr><tr><td> 아스코르비 산 </td><td> 시그마 </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 분석기 </td><td> 바카라 </td><td> # 2820 </td><td></td></tr></tbody></table> 슬라이스 문화의 활력을위한 사전 검사 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Sytox 그린 </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td></td></tr><tr><td> DMIBRE 거꾸로 현미경 </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 콜드 - Preconditioning <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> BSL - 2 퓸 후드 </td><td> NuAire </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Excitotoxic 상해 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> CoolSnap FX CCD 카메라 </td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluoroscein </td><td> Invitrogen </td><td> F36915 </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph 소프트웨어 </td><td> 분자 장치 </td><td> V. 7.5.04 </td><td></td></tr><tr><td> 100 μm의 깊이 hemacytometer </td><td> Hausser 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> N - 메틸 - D - aspartate </td><td> Calbiochem </td><td> 454575 </td><td></td></tr><tr><td> SigmaStat 소프트웨어 </td><td> Systat 소프트웨어 주식 회사 </td><td> V. 3.5 </td><td></td></tr></tbody></table> 콜드 Preconditioning 적용된 공동 트리 트먼트 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> sTNFR1 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 425 - R1 - 050 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A - 4503 </td><td></td></tr></tbody></table> RNA 격리 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> RNAl ater </td><td> 앰비온 </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 RNEasy 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 74,004 </td><td></td></tr><tr><td> β - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 어부 </td><td> 03446-100 </td><td></td></tr><tr><td> Diposable 1.5 RNAse - 무료 페슬 </td><td> 사우스 제르 정밀 도구 및 몰드 주식 회사 </td><td> 749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N261A </td><td></td></tr><tr><td> 트리스 [히드록시 메틸] aminomethane </td><td> 시그마 </td><td> T3069 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (ethylenediaminetetraacetic 산성 나트륨 소금 하이드 레이트 </td><td> 시그마 </td><td> # E7889 </td><td></td></tr></tbody></table> RNA의 양을 정함 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> RiboGreen 어세이 </td><td> Invitrogen </td><td> R11491 </td><td></td></tr><tr><td> 효모 tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ML 원심 분리기 튜브 </td><td> 미국 과학 </td><td> 16155500 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 플레이트 형광 분석 </td><td> Nunc </td><td> DK - 4000 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 플레이트 형광 판독기 </td><td> Tecan </td><td> Safire II </td><td></td></tr></tbody></table> 정량 PCR <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> iScript 역방향 전송 키트 </td><td> 바이오 래드 </td><td> 170-8891 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR 그린 </td><td> Invitrogen </td><td> S7563 </td><td></td></tr><tr><td> 플래티넘 DNA 형성 촉매 효소 </td><td> Invitrogen </td><td> RNA Ultrasense 11732-927 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler thermocycler </td><td> 바이오 래드 </td><td> iCycler 광학 모듈 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler 시스템 소프트웨어 </td><td> 바이오 래드 </td><td> V. 3.1 </td><td></td></tr></tbody></table> Microarrays에 대한 정량 PCR <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 어웨이 RNase </td><td> 분자 BioProducts </td><td> # 7000 </td><td></td></tr><tr><td> 알티 2 퍼스트 스트랜드 키트 </td><td> SABiosciences </td><td> C - 03 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR 그린 기반의 PCR 믹스 </td><td> SABiosciences </td><td> PA - 011 </td><td> iCycler에 대한 특정 </td></tr><tr><td> RT PCR이 프로파일의 배열 </td><td> SABiosciences </td><td> PARN - 011A </td><td></td></tr></tbody></table> Proteomic 어세이 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그/ 모델 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 세포 용해 키트 </td><td> 바이오 래드 </td><td> 171-304011 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 마이크로 7 </td><td></td></tr><tr><td> BSA 단백질 재고 </td><td> 바이오 래드 </td><td> 500-0007 </td><td></td></tr><tr><td> BCA 단백질 분석 키트 </td><td> 써모 과학 </td><td> 23,225 </td><td></td></tr><tr><td> 단백질 96 MicroWell 플레이트 </td><td> Nunc </td><td> 449824 </td><td></td></tr><tr><td> 실링 테이프 </td><td> 바이오 래드 </td><td> 2,239,444 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 플레이트 리더 </td><td> 퍼어킨 엘머 </td><td> 1420 - mulilabel 카운터 </td><td></td></tr><tr><td> Bioplex 랫 TNF - α의 시토킨 분석 </td><td> 바이오 래드 </td><td> X0000001T </td><td></td></tr></tbody></table> Immunostaining <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 모델 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 16 % Paraformaldehyde </td><td> 알파 Aesar </td><td> 43,368 </td><td></td></tr><tr><td> 라이신 </td><td> 시그마 </td><td> L - 6001 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 나트륨 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> S374 - 1 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 periodate </td><td> 시그마 </td><td> S - 1878 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 azide </td><td> 시그마 </td><td> S - 2002 </td><td></td></tr><tr><td> 과산화수소 (30 %) </td><td> 시그마 </td><td> H1009 </td><td></td></tr><tr><td> 염소 혈청 </td><td> 콜로라도 세럼 회사 </td><td> CS 0920 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> 시그마 </td><td> T - 8787 </td><td></td></tr><tr><td> 얼룩 요리 </td><td> 테드 펠라 (주) </td><td> 14,511 </td><td></td></tr><tr><td> 플레이트 쉐이크 </td><td> 랩 - 라인 인 스트 루먼트 (주) </td><td> 3520 </td><td></td></tr><tr><td> # 1 필터 보고서 (185mm) </td><td> 워트 먼지 </td><td> 1001-185 </td><td></td></tr><tr><td> 3,3 - diaminobenzidine </td><td> 시그마 </td><td> D8001 </td><td></td></tr><tr><td> 디메틸 sulfoxide </td><td> 시그마 </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> Pharmco - AAPER </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> 크실렌 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> X3S - 4 </td><td></td></tr><tr><td> Permount 설치 미디어 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> SP15 - 100 </td><td></td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯 </td><td> Leica </td><td> cm 3 050 S </td><td></td></tr><tr><td> 조직 테크 </td><td> 테드 펠라 (주) </td><td> 27,050 </td><td></td></tr><tr><td> 미세 팁 페인트 브러쉬 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 11,806 </td><td></td></tr><tr><td> PAP 차단 펜 </td><td> 테드 펠라 (주) </td><td> 22,309 </td><td></td></tr><tr><td> SFX 신호 향상제 </td><td> Invitrogen </td><td> A31631 </td><td></td></tr><tr><td> Antifade을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

콜드 preconditioning에서 neuroprotection 연구를위한 전략

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

신경 부상 관리가 용이​​하고 안전 preconditioning 치료 효과의 개발에 의해 완화 수있는 전신 마취와 관련 수술 절차의 병적 상태와 사망률의 자주 원인입니다. 우리는 부상 발병하기 전에 두뇌를 보호하는 치료제 개발을위한 새로운 목표를 식별하는 수단으로 추위 preconditioning에 대한 책임 신경 면역 신호를 정의하기 위해 추구합니다. 시간이 지남에 따라 변화를 신호 낮은 수준의 프로 염증 중재자 감기 - preconditioning neuroprotection을 위해 필수적입니다. 이 신호는 자극성의 자극이 분명 될 보호를위한 자극에 적응을위한 충분한 시간 임계값 크기에 도달할 것을 요구 생리 조절 hormesis의 기본 신조와 일치합니다. 따라서, 냉간 preconditioning neuroprotection에 관련된 면역 신호의 묘사는 생물 학적 시스템과 실험 조작 플러스 기술 역량이 높은 재현성과 구분이 필요합니다. 우리의 접근 방식은 밀접하게 자신의 성숙하고 정지 macroglia / microglia의 영향을 다중 시냅스 신경 네트워크와 생체내 매쉬의를 반영 체외 모델로 hippocampal 슬라이스 문화를 사용하는 것입니다. 그들이 femtomolar 범위에서 작동중인 크린 시토킨의 주요 소스되므로이 glial 상태 microglia에 특히 중요합니다. 또한, 슬라이스 문화가 몇 주 동안 체외에서 유지 될 수있는가 활성화 자극을 보여주고과 적응 반응을 평가할 수있는 충분한 시간입니다. 마지막으로, 환경 조건이 정확하게 그 시토킨가의 신호 때문에 슬라이스 문화를 사용하여 제어할 수 있습니다 추​​위 preconditioning 것은, 측정 했었 및 중요한 노드 측면을 해부하다하기 위해 변조된 수 있습니다. 시토킨 신호 시스템 분석은 민감하고 재현성 멀티 플렉스 기술의 사용을 필요로합니다. 우리는 조직 전체 시토킨 변화를 평가하는 정량 실시간 qPCR 배열 검사 다음 microglial 정품 인증 화면으로 TNF - α에 대한 양적 PCR을 사용합니다. 후자는 동시에 변화를 신호 여러 시토킨 시스템을 측정하는 가장 민감하고 재현성을 의미합니다. 중요한 변경 사항은 타겟 qPCR 그리고 단백질 감지와 함께 확인하고 있습니다. 우리는 Luminex 기술을 사용하여 다중 microsphere 흐름 cytometric assays를 사용하여 조직 기반 시토킨 단백질의 변화에​​ 대한 조사. 셀 - 특정 시토킨 생산은 이중 레이블 immunohistochemistry로 결정됩니다. 함께 촬영, 제안 조사 전략을 결합이 뇌 조직 준비 및 사용의 스타일, 차가운 - preconditioning의 장점을 모방 수있는 새로운 치료제의 개발을위한 잠재적인 목표를 식별을위한 최적의 접근법 수 있습니다.

우리는 부상 발병하기 전에 두뇌를 보호하는 치료제 개발을위한 새로운 목표를 식별하는 수단으로 추위 preconditioning에 대한 책임 신경 면역 신호를 정의하기 위해 추구합니다. 우리는 생물 학적 시스템, 실험 조작 플러스 높은 재현성 및 민감 기술 용량을 필요로 이러한 작업을위한 전략을 제시한다.

콜드 preconditioning에서 Neuroprotection 연구를위한 전략

신경계 손상은 전신 마취 및 관련 수술 절차로 인해 발생하는 이환율과 사망률의 흔한 원인이며, 이는 ...을 통해 완화될 수 있습니다.

신경계 손상은 전신 마취로 인한 이환율 및 사망률의 빈번한 원인입니다. 본 영상에서 제시하는 연구의 목적은 뇌 손상 발생 전 뇌를 보호하기 위한 새로운 치료 표적을 발굴하는 수단으로서, 저온 사전처리가 쥐의 신경 면역 신호 전달에 미치는 영향을 조사하는 것입니다. 이는 건강하고 수명이 긴 성체 쥐의 해마 슬라이스 배양물을 제작함으로써 달성됩니다.면역 기반의 신경 보호를 유도하기 위해 배양물에 저온 전처리를 실시합니다. 그 후 anci 독소를 첨가하고 슬라이스 배양물을 이미징합니다. 이미지 분석 결과, 저온 전처리가 선택적 신경세포 손실 수준을 획기적으로 감소시키는 것으로 나타났습니다.제 이름은 Richard Craig이며, 여기는 Heidi Mitchell입니다. 저희는 시카고 대학교 신경과 소속이며, 오늘은 뇌 질환에 대해 뇌를 더 강하게 만드는 수단으로서 저수준의 전염증성 면역 신호 전달과 관련된 신경 보호에 관한 질문에 답하기 위해 슬라이스 배양 준비법을 어떻게 사용할 수 있는지 설명해 드리겠습니다. 일반적으로 이 절차를 처음 접하는 분들은 저수준의 전염증성 신호를 나타낼 수 있는 건강한 배양 상태와 장기적인 생존력을 확보해야 한다는 점 때문에 어려움을 겪습니다.이제 Heidi가 저수준의 염증성 신호 전달을 측정하여 뇌 신경 보호제를 제작하기 위해, 실험실에서 이러한 장애물을 극복하는 데 사용하는 여러 절차를 보여드리겠습니다. 다음 실험들은 깨끗한 실험복을 착용하고 그 소매 위로 멸균 장갑을 겹쳐 낀 상태에서 수행해야 합니다. 먼저 Mcilwaine 조직 절단기 및 관련 테플론 인서트, 면도날, 수술 도구, 해부용 페트리 접시를 포함하여 절차에 필요한 모든 품목을 BSL 1 등급의 층류 후드(lamina flow hood) 안에 배치하는 것으로 시작하십시오.후드는 HIPAA 필터가 장착된 양압 배양실에 위치해야 하며, 실험 시작 최소 30분 전에 독립형 자외선 공기 정화 팬으로 공기를 정화해야 합니다. 후드 내부에 해부용 냉각 플레이트를 배치하고, 세포 배양 후드 내 인근의 항온수조에 연결하십시오. 6웰 플레이트의 각 웰에 밀리셀 인서트를 넣고, 각각에 배양액 1.1 milliliters를 추가하십시오.트레이를 36 °C, 5% carbon dioxide, 95% 습도 조건의 인큐베이터에 최소 20분 동안 둡니다. 쥐 새끼들은 필요할 때까지 가열 램프 아래에 두어 따뜻하게 유지합니다. 쥐 새끼를 100% carbon dioxide에 넣어 마취시킵니다. 마취가 되면 쥐 새끼를 100% ethanol에 담근 후, 참수하여 몸통은 하나의 100 millimeter Petri dish에, 머리는 다른 dish에 넣습니다.다음으로, 곡선 홍채 가위를 사용하여 정중선 절개를 한 후, 양쪽 눈 뒤편으로 좌우 측면 절개를 하여 두개골을 엽니다. 각도 핀셋을 사용하여 덮여 있는 두개골을 젖히고, 스패튤라를 사용하여 뇌를 긁어내기 시작합니다. 스패튤라로 삼차신경을 절단하여 뇌를 제거한 다음, Glucose가 첨가된 10 mL의 멸균된 차가운 gaze balanced salt solution이 담긴 60 mm 페트리 접시의 하단부에 뇌를 넣습니다.다음으로, 2번 홍채 스패튤라 아래에서 5번 IOx 포셉을 사용하여 각 반구에서 해마를 분리한 후, McIlwain 초퍼용 테플론 디스크 위에 놓습니다. 스패튤라를 사용하여 뇌 조직으로부터 배지를 밀어내고, 절편 두께를 350 to 400 µm로 설정한 초퍼를 사용합니다. 1 mL 퍼펫을 사용하여 해마의 장축에 수직이 되도록 빠르게 절편을 만듭니다.테플론 인서트에서 갓 절단한 슬라이스를 씻어내어 차가운 gaze BSS가 들어 있는 60mm 페트리 접시의 상단 절반에 옮깁니다. 슬라이스를 실체 현미경 아래에 두고 관찰합니다. 치상회(dentate gyrus)와 방추세포층(parametal cell layer)이 온전하게 보존된 슬라이스를 식별합니다.다음으로 가장 큰 조각 3개를 인서트에 조심스럽게 올리며, 팝당 총 12개의 조각을 준비합니다. 인서트를 6-웰 트레이에 넣고 36 °C에서 3~4일마다 배양합니다. 기존 배지를 신선하고 따뜻한 배지로 교체하여 성장 배지를 갱신합니다.7일 후 세포를 36 °C 인큐베이터로 옮깁니다. 배지를 1.1 mL의 serum free supplemented neuro Basal medium으로 교체합니다. 18일째에 슬라이스 배양물의 활성도를 확인합니다.먼저 6웰 배양 접시에 1.1 milliliters의 ox poel을 넣습니다. 접시를 인큐베이터에 넣어 36 degrees Celsius까지 가온합니다. 그동안 현미경용 fitzy 필터가 장착된 형광 광원을 켜고 최소 20분 동안 예열합니다.이렇게 하면 빛의 세기가 균일하게 유지됩니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 슬라이스 배양 인서트를 10분 동안 inox 배지에 넣으십시오. 그 후, 이를 다시 SIM-free 배지로 옮기십시오.배양 인서트를 현미경 스테이지 위에 놓고, 비가역적인 CA one 파라메탈 층 손상 여부를 스크리닝하기 위해 방향을 표시합니다. 배양물을 도립 현미경의 무균 표면에 놓고 5배율로 관찰하며, 슬라이스의 방향은 사전 스크리닝 시와 유사하게 유지합니다.FIT CX citation 방출 큐브로 전환하십시오. 저온 전처리를 위해 ca one 영역 내에 cytx 양성 세포가 30개 미만인 배양물을 선택하십시오. 6-웰 배양 접시에 무혈청 배지 1.1 milliliters를 넣고, 배지를 평형화하기 위해 이 접시를 5%carbon dioxide와 95%습도가 유지되는 30 degree 인큐베이터에 최소 20분 동안 보관하십시오. 20분이 경과한 후에 다음 단계를 진행하십시오.배양기에서 평형 배지를 제거합니다. 조직 슬라이스가 담긴 배양 인서트를 일반 무혈청 배지에서 30 °C 배지로 옮깁니다. 그런 다음, 배양을 위해 30 °C 배양기에 90분 동안 넣습니다.슬라이스 배양물을 다시 일반 무혈청 배지로 옮기고 36°C에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 인서트를 cyt media로 옮겨 20분 동안 유지함으로써 슬라이스 배양물의 실험 사용을 위한 사전 스크리닝을 시작합니다. 슬라이스 배양물이 배양되는 동안 자외선 램프와 CCD 카메라의 전원을 켜고 20분 동안 예열합니다.필요한 경우, 소프트웨어를 사용하여 CCD를 50 사이클 동안 빛에 노출시켜 초기화하십시오. 그다음 90 µL의 PBS에 녹인 10 µL의 fluorescein 용액을 깊이 100 µm의 혈구계수기(hemocytometer)에 피펫으로 분주하고 이를 현미경 스테이지 위에 놓으십시오. 소프트웨어를 사용하여 다이내믹 레인지(dynamic range)가 4,096 중 1,000이 되도록 노출 시간을 조정하십시오.다음으로 저온 전처리를 거친 슬라이스 배양물이 담긴 디쉬를 현미경에 올리고 이미지를 획득합니다. 이 이미지들은 배경 형광 수준을 결정하는 데 사용되며, 이는 손상된 슬라이스에서 방출되는 형광에서 차감될 것입니다. 만약 저온 전처리 자체가 손상을 유발했다면, 다음 단계에서 형광이 증가된 손상 세포들이 관찰될 것입니다.ExoToxic 손상의 효과를 조사하려면, 36°C에서 최소 20분 동안 평형을 맞춘 20~50 µM NMDA가 포함된 무혈청 배지로 인서트를 옮깁니다. 36°C에서 60분 동안 배양하며, 이때 NMDA는 신경전달물질인 glutamate의 효과를 모방합니다. 배양 후, 각 인서트를 세 개의 서로 다른 60 mm 디쉬에 세 번씩 담가 NMDA를 씻어냅니다.각각 36°C로 데워진 신경 기저 배지 10 milliliters를 포함합니다. 360 millimeter 세척 접시 한 세트당 인서트를 3개 이상 사용하지 마십시오. 세척 후, 인서트를 신선한 배지가 담긴 트레이에 넣고 36°C 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.24시간 후, 이전과 동일하게 플루오레세인 표준물질로 카메라를 보정합니다. 그런 다음 이미지 촬영 20분 전에 배양물을 OX 배지에 넣습니다. 손상 후 하루 뒤에 손상 수준이 낮을 경우, Metamorph 소프트웨어를 사용하여 손상 정도를 정량화하기 위해 필요에 따라 실험 기간을 2~3일로 연장합니다.손상 정도를 측정하기 위해 CA one 영역 주변에 관심 영역(area of interest)을 설정하여 선택된 영역의 강도를 측정합니다. 손상 이미지에서 설정한 관심 영역을 배경 이미지로 복사하여 붙여넣으십시오. 그 다음, 통계 소프트웨어를 사용하여 손상 및 배경 이미지에서 얻은 값을 excel에 입력합니다.대조군 및 저온 전처리 배양군의 분자 수에서 배경값을 뺀 값을 정량화하고, 적절한 통계 검정을 실행하여 대조군 대비 실험군의 손상 정도를 비교하십시오. 대조군은 각 실험 실행 시 항상 포함되어야 합니다. 이 이미지는 21일간의 인비트로(in vitro) 배양 후 전형적인 성숙한 해마 슬라이스 배양 염색 상태를 보여줍니다. 녹색으로 표시된 새로운 신경 말단 표지는 주요 뉴런의 세포 구조를 설명하는 데 사용됩니다.해마의 ca 1 및 ca 3 영역의 파라메탈 뉴런과 왼쪽의 치상회 또는 DG 뉴런이 나타나 있습니다. 고배율로 보여지는 CA 1 영역은 휴지기 미세아교세포의 분지된 특성을 보여줍니다. 성숙한 슬라이스 배양 내에서, 세포들은 미세아교세포 표면 마커인 CD 11 B로 표지되었습니다. 이 그림은 냉각 전처치의 효과, 신경 보호, 그리고 사멸 세포용 cytx green 마커로 배양된 해마 슬라이스 배양의 결과를 보여줍니다.왼쪽의 사전 스크리닝 이미지는 이곳에 ca one 손상이 없음을 보여줍니다. 위쪽에는 위가공 대조군 배양액이, 아래쪽에는 냉처치 전처치 배양액이 표시되어 있습니다. 중간 행의 이미지는 20 µM NMDA에 노출된 지 24시간 후의 상대적인 슬라이스 배양 손상을 보여줍니다.sham 대조군 손상이 cp로 표시된 저온 사전처리에 노출된 배양 세포의 손상보다 더 큼을 알 수 있습니다. 상대적 손상 색상 보정 척도는 왼쪽 상단 이미지에 표시되어 있습니다. 전통적으로, 배양 세포를 20 micromolar MDA에 하룻밤 동안 노출시키는 것과 같이 최대 수준의 손상에 노출시켜 CA1 신경세포 손상 수준을 최대화하고, 최대 손상 대비 손상 비율로 표시되는 sham 대비 저온 사전처리의 상대적 손상을 측정합니다.그러나 최대 손상 자극에 노출되는 것만으로는 사전 처리에 의한 신경 보호 효과를 상쇄하기에 충분하지 않을 수 있습니다. 따라서 손상 정도와 최대 손상 정도의 비율을 사용하는 것은 사전 처리에 의한 신경 보호 효과를 정확하게 반영하지 못할 수 있습니다. 이는 오른쪽 이미지에서 저온 사전 처리의 최대 수준이 가짜 대조군(sham controls)보다 낮게 나타나는 것을 통해 확인할 수 있습니다.본 연구에서는 손상 정도를 최대 손상 정도의 비율로 나타낼 경우, 저온 사전처리에 의한 신경 보호 효과가 가려질 수 있다는 점이 밝혀졌습니다. 이는 도식에서 확인할 수 있는데, NMDA 노출 하루 후 위손상(sham injury)군은 빨간색으로, 저온 사전처치군은 파란색으로 표시되어 있습니다. 위손상 대조군에서는 손상 수준이 5로 나타난 반면, 저온 사전처치군의 손상 수준은 3으로 결정되었습니다. 이는 40%의 신경 보호 효과와 일치하는 결과입니다.하지만 손상 대비 최대 손상과 같은 비율을 사용하는 전통적인 형식을 사용할 경우, 보호 효과가 나타나지 않습니다. 즉, 위가공군(sham) 50% 대비 냉각 전처치군(cold preconditioning) 50%와 같습니다. 여기에 표시된 것과 같이 mRNA 샘플을 사용하여 정량적 PCR을 수행하였습니다.파란색 선으로 표시된 저온 사전처치 후의 TNF alpha 수치는 초록색, 노란색 및 보라색 선으로 표시된 대조군보다 높았습니다. 이는 저온 사전처치가 뇌 내 TNF alpha의 생산 증가를 유발함을 시사하며, quantitative PCR 및 quantitative PCR array 결과를 확인하기 위해 면역 염색을 수행하였습니다. 이 슬라이스 배양물은 빨간색으로 표시된 interleukin 11과 초록색으로 표시된 뉴런을 보여주는 A new end로 처리되었습니다.화살표로 표시된 일부 parametal 뉴런이 interleukin 11 및 new end 염색을 나타내며 노란색으로 표시됨에 주목하십시오. 화살표는 astrocyte로 추정되며 interleukin 11 염색만 증가하여 나타나는 몇 개의 더 작은 세포들을 가리킵니다. 저온 사전 조건화 신경 보호에 관여하는 사이토카인 신호 전달 체계를 기술함에 있어, 몇 가지 근본적으로 중요한 개념들을 유념하는 것이 중요합니다.정상적인 뇌에서 사이토카인의 농도는 극히 낮지만, 사이토카인 농도의 작은 변화만으로도 유전자 발현이 달라집니다. 따라서 저농도에서도 사이토카인은 뇌의 구조와 기능을 변화시켜 결과적으로 생물체의 표현형을 바꿀 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 개념은 고양이 수염을 기준점으로 하여 나트륨, 칼륨, pH 및 칼슘을 TNF alpha와 비교함으로써 거리의 역수로 여기서 표현됩니다.또한 사이토카인은 매우 중복적이며 다중 작용성(pleiotropic)을 띠고 있다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 즉, 여러 사이토카인이 유사한 효과를 낼 수 있으며, 단일 사이토카인이 가변적인 효과를 나타낼 수 있습니다. 따라서 저온 사전처리에 의한 신경 보호의 선천적 사이토카인 기반을 정확하게 규명하기 위해서는 관련 신호 전달 변수들에 대한 종합적인 분석이 이루어져야 합니다. 이는 저온 사전처리 신경 보호의 사이토카인 시그니처를 확립할 수 있는 멀티플렉스 분석 전략을 통해 달성됩니다. 일단 숙달되면, 이러한 배양은 약 3시간 이내에 준비하여 연구를 위한 조작을 수행할 수 있습니다.저온 사전 처리에 대한 반응은 약 3일에 걸쳐 수행할 수 있습니다. 이러한 절차를 수행하는 동안, 저온 사전 처리 후 나타나는 낮은 수준의 염증 유발 신호를 검출하는 능력을 유지하기 위해 무균 기술과 최소한의 핸들링이 필수적이라는 점을 반드시 기억해야 합니다. 저온 사전 처리가 뇌에 영양 공급 및 보호 효과를 주는 기전을 규명하기 위해 프로테오믹스 및 분자 생물학적 분석과 같은 다른 방법들을 배양물에 적용할 수 있습니다.

strategies-for-study-of-neuroprotection-from-cold-preconditioning

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

증거가 축적되고, 그 허혈 (PC) - 뇌에 대한 비 손상 허혈성 도전 - 후속 손상 허혈성 모욕을 과도 전압 보호 기능을 부여. 우리는 C57BL6 / J 생쥐의 일시적인 국소 대뇌 허혈 (중간 대뇌 동맥 폐색, MCAO에 의한)에 초기 허혈 내성 (IT) 유도 컨디셔닝 자극으로 양측 경동맥 폐색 (BCCAO)를 설립했다.

초점 대뇌 국소 빈혈에 조기 허혈성 공차를 유도하기 위해 적절한 전처리 자극으로 양측 경동맥 동맥 폐색

출처: Zheng, Y., et al. 뇌허혈에 대한 산성 사후 조절의 신경 보호를 연구하기 위한 실험 모델. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 중대뇌동맥폐색(MCAO)의 마우스 모델에서 허혈성 손상에 대한 신경 보호 효과를 평가하기 위해 산성 사후 컨디셔닝(APC)의 적용을 보여줍니다. MCAO 모델에서 재관류와 관련된 단계와 흥분 독성, 산화 스트레스 및 신경 사멸을 완화하기 위한 재관류 중 APC의 적용을 간략하게 설명합니다.

 뇌허혈의 마우스 모델에서 산성 사후 컨디셔닝의 신경 보호 효과 평가

출처: Poinsatte, K., et al., 마우스의 반복적인 저산소 전처리 및 일시적인 중대뇌 동맥 폐색에 따른 신경혈관 보호의 정량화. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 허혈성 뇌졸중을 유발하기 전에 제어된 저산소증 주기에 마우스를 노출시켜 반복적인 저산소 전처리(RHP) 방법을 보여줍니다. 이 실험은 혈액-뇌 장벽 안정성, 신경 적응 및 염증에 미치는 영향을 평가합니다.

마우스의 반복적 저산소 전처리에 대한 신경 적응

출처: Brandli, A. 원격 사지 허혈 전처리: 설치류의 신경 보호 기술. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 전신 신경 보호를 유도하기 위한 쥐의 비침습적 사지 허혈 전처리 프로토콜을 보여줍니다. 이 절차에는 제어된 동맥 폐색 및 재관류가 포함되며, 보호 인자를 방출하는 세포 스트레스 경로를 유발합니다. 이러한 요인은 뇌 및 망막과 같은 원격 기관의 허혈성 및 대사 손상에 대한 저항력을 향상시킵니다.

신경 보호를 위한 쥐 모델의 비침습적 사지 허혈 전처리

원격 허혈 (RIP)의 손상 스트레스에 대한 조절 조직의 방법이다. 우리는 5-10 분간 혈압계 커프를 팽창하여, 뒷다리에서 원격 허혈 방법을 확립했다. RIP의 신경 보호 기능은 설치류에서 망막 변성의 모델에서 입증되고있다.

원격 사지 허혈 양상 : 설치류에 신경 기술

이 프로토콜은 마우스의 일시적인 중대뇌동맥 폐색 후 경색 부피와 혈액-뇌 장벽 파괴를 감소시키는 반복적인 저산소증 전조건화 또는 전신 저산소증에 대한 짧은 노출을 설명합니다. 또한 신경혈관 보호의 효능을 평가하기 위해 뇌졸중 후 경색 용적과 혈액-뇌 장벽 파괴의 이중 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

마우스의 반복 저산소 전처리 및 과도 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 신경 혈관 보호의 정량화

말단 중간 대뇌 동맥 분기 (MCAO)의 수술 폐색 실험 뇌졸중 연구에서 자주 사용하는 모델입니다. 이 논문은 마우스에서 생체 내에 길이 현미경을위한 기회를 제공하는 측의 두개 창에 삽입, 결합 영구 MCAO의 기본적인 기술을 설명한다.

측면 만성 두개골 창 준비 활성화 생체 마우스의 말초 중간 대뇌 동맥 폐색에 따라 관측

산성 후 조절은 뇌 허혈을 예방합니다. 여기서는 APC를 실행하는 두 가지 모델을 제시합니다. 이들은 시험 관내에서 산소 - 글루코스 부족 후에 산성 버퍼 corticostriatal 슬라이스를 전달함으로써 생체 내에서 중간 대뇌 동맥 폐색 후 20 % CO 2 흡입에 의해 각각 달성된다.

대뇌 허혈에 대한 산성 후행 조절의 신경 보호를 연구하기위한 실험 모델

사지의 주의 깊은 조화를 요구 하는 자연 환경에서 복잡 한 운동에는 정수 리 피 질 영역 포함 됩니다. 다음 프로토콜 걷는 고양이에 메모리 기반 장애물 회피에 정수 리 지역 5의 역할을 설명 하기 위해 가역 냉각 유도 비활성화의 사용을 설명 합니다.

가역 냉각 유도 Deactivations 공부 장애물 메모리 걷는 고양이에 대뇌 피 질의 기여를

심근 보호에 저체온증의 다른 정도의 뚜렷한 영향은 철저하게 평가되지 않았습니다. 본 연구의 목표는 인간 심근세포 기반 모델에서 다른 저체온증 치료에 따른 세포 사멸 의 수준을 정량화하여 미래의 심층 분자 연구의 토대를 마련하는 것이었습니다.

인간 심장 근세포 모델에서 저체온증-사전 조절 에 따른 심근 보호의 체외 평가

이 문서는 쥐에 있는 전신 단기간 저체온증 유도의 2개의 방법을 설명합니다. 첫 번째 빠른 유도 방법은 온도의 급격한 감소를 위해 팬과 에탄올 스프레이를 사용하여 능동 냉각을 사용합니다. 두 번째 방법은 점진적 냉각 방법입니다. 이것은 이소플루란 마취의 조합과 홈더믹 히트 매트에 온도 설정의 감소를 사용하여 달성된다. 이로 인해 외부 냉각 장치를 사용하지 않고도 코어 체온이 점진적으로...

임상 관련성 및 메커니즘을 검사 하는 연구에 대 한 모델을 사용 하 여 쥐에 짧은 기간 저온증 유도

학습하세요 콜드 preconditioning을 이용한 신경보호 메커니즘 연구 방법을 토끼 해마 슬라이스 배양을 통해 TNF-α와 interleukin 11 사이토카인 신호를 분석하고 수술 및 마취 관련 신경손상 예방 치료 표적을 식별하는 기술을 익히세요.

콜드 preconditioning에서 Neuroprotection 연구를위한 전략

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