Name: 모기 (A. aegypti)와 감염 표현형 결정에 뎅그열 감염 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: 학습하세요 뎅그열 바이러스 감염 프로토콜을 통해 Aedes aegypti 모기의 중장 및 타액선에서 바이러스 역가를 측정하는 방법을 배우세요. 이 기술은 유전자 기능 연구와 질병 전파 메커니즘 이해에 필수적입니다.

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A.이 C6/36 세포주에 바이러스를 전파. <ol><li> 세포는 75cm이 플라스크에 confluency 80 % 성장; </li><li> 술병에 남아 3-4 ML과 미디어를 제거; </li><li> 0.5 ML 주식 바이러스를 가지고 세포 당 1.5 바이러스 입자의 감염의 다중성과 함께 위의 셀에 추가합니다. 서서히 실온에서 15 분 동안 휴대용 술병을 흔들어. </li><li> 5% CO 2와 37 ° C에서 45 분 동안 품어 </li><li> 30 ML 미디어를 추가, 5 일 동안 알을 품다. </li></ol> B. 바이러스와 혈액의 혼합물 준비 <ol><li> 스크레이퍼로 세포를 분리하고 50 ML 원뿔 튜브에 세포와 미디어를 전송; </li><li> 10 분 800g에 Centrifugate, 표면에 뜨는를 수집하지만, 세포 펠렛과 함께 뜨는의 1ml를 떠나; </li><li> ° C 물 목욕, 반복 2 ~ 3 배 37 해동 후 건조 CO 2에 위의 세포 펠렛을 고정하고, </li><li> 뜨는을하고, 3 단계에서 수집한 뜨는와 결합, 10 분 800g에 Centrifugate; </li><li> Plasmodium falciparum과 아노 펠 레스 모기를 감염시킬 수 gametocyte 문화의 준비에 대해 동일한 절차 (3 단계)와 전체 인간의 혈액을 수집; </li><li> 4 단계에서 바이러스 뜨는와 함께 위의 모든 인간의 혈액의 동일한 금액을 결합, 그리고 (전체 볼륨의 10 %) 인간의 혈청을 추가합니다. </li><li> 37 ° C 물 목욕 30 분 인간의 혈액과 뎅그열 바이러스의 상기 혼합물을 품어 </li></ol> C. 먹이 모기 이 절차는 모기에 Plasmodium falciparum 감염에 대한 섹션에서 설명했던 일들을 거의 동일합니다. 우리는 일 7시 분석 midgut 감염, 피로 수유 후 14 일에서 타액 감염. 바이러스와 접촉에 온 모든 자료는 75 % 에탄올과 10 %의 다음 표백제 처음에 처리됩니다. D. 어세 모기 조직에서 바이러스 titer <ol><li> 2-3 일 모기 조직의 절개 전에 세포는 분석이 실시되는 하루 confluency 80 %에 도달 이러한 24 잘 접시에 C6/36 세포를 성장; </li><li> 모기가 4 anesthetized 아르 ° C, 희생과 1 분 75 % 에탄올에서 그들을 담글하여 멸균 표면. 그렇다면 모기는 해부 현미경 midgut 또는 침샘의 해부 전에 두 번 멸균 물로 씻어되었습니다. 이 단계에서 아래의 모든 절차는 생물 학적 안전 캐비닛 같은 무균 환경에서 실시해야합니다. 이러한 조직은 150 μl 미디어를 포함하는 튜브에 옮겨 90 초간 Kontes 펠렛 유봉 모터 균질되며 </li><li> 990 μl 미디어에 homogenate 10 μl를 추가하여 1:100 희석하다; </li><li> 추가 1 확인 : 10, 1:100 및 96 잘 판에 매체와 1:1000 희석을; </li><li> 24 잘 판에있는 미디어를 제거하고 각 해당 잘하려면 위의 네 dilutions 각각 100 μl를 추가합니다; </li><li> 그리고 5 %에서 45 분 동안 부화 상온에서 15 분에 대해 천천히 접시를 흔들어 CO 2 37 ° C; </li><li> 각 잘하는 프로필 메틸 셀룰로오스 오버레이 (1 %)의 1ml을 추가합니다; </li><li> 37 접시를 품어 ° C 오일에 대한 5 % CO 2; </li><li> 여기에서 단계 멸균 환경을 필요로하지 않지만 같은 다른 병원체주의는 항상 주의해야한다. 각 플레이트의 프로필 메틸 셀룰로오스 오버레이를 취소하고 여분 미디어를 제거 얼룩 </li><li> 각 잘하는 메탄올 / 아세톤 정착액 (1:1)의 1ml을 추가합니다. 1 시간 4 ° C에 보관; </li><li> 정착액을 붓고하고, 1X PBS로 한번 씻어; </li><li> 5% 곤드레 만 드레 취한와 바이러스에 대한 기본 항체에 1:1000 희석하다; </li><li> 1 시간 각 37 품어, 잘 ° C로 희석 hyperimmune 액체 200 μl를 추가합니다; </li><li> 1 X PBS로 hyperimmune 유체 및 세척 플레이트를 제거합니다 </li><li> 5% 곤드레 만 드레 취한 (1 X PBS의 100 ML에 5g 분말 탈지 우유)에 염소 안티 마우스 공액의 1:1000 희석 (KPL 캣 # 074-1806)를 준비하고, 다음 각 잘 200 μl을 추가하고에서 알을 품다 1 시간을위한 37 ° C; </li><li> 다음과 같이 기판을 준비 : 해산 후, 1 X PBS의 20 ML에 3&#39; - Diaminobenzidine terrahydrochloride 1 타블렛 (시그마 고양이 # D5905)을 추가하고 다음 30 % 수소 퍼옥시데이즈 8 μl를 추가 </li><li> 각 잘하려면 위의 기판 200 μl를 추가합니다. 10 분 실온에서 서합시다 </li><li> 기판을 제거하고 각 잘하는 증류수의 1ml을 추가하여 반응을 정지 </li><li> 건조에 물 얼룩 접시를 부어 </li><li> 바이러스 입자를 카운트 </li></ol>

<table><tbody><tr><td>인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td><td>5% CO2, 37°C</td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브</td><td></td><td></td><td></td><td>플라스틱</td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td></td><td></td><td></td><td>조직 배양용</td></tr><tr><td>피펫맨</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td></td><td></td><td></td><td>유리, 멸균</td></tr><tr><td>항온수조</td><td></td><td></td><td></td><td>37°C</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>순환식 항온수조</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리막 급이 장치</td><td></td><td></td><td></td><td>급이 장치용 고무 튜브 포함</td></tr><tr><td>모기 컵</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 표백제</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트</td><td></td><td></td><td></td><td>6-well, 24-well 및 96-well 플레이트</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td></td><td></td><td></td><td>유리</td></tr><tr><td>슬라이드</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>정밀 핀셋</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>1X, 멸균</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C6/36 세포</td><td>세포</td><td></td><td></td><td>바이러스 증식용</td></tr><tr><td>C6/36 배지</td><td></td><td></td><td></td><td>10% 열 불활성화 FBS, 1% L-glutamine 및 비필수 아미노산, 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin이 포함된 MEM</td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>1 X PBS 20 ml에 1정제를 녹인 후, 30% 과산화수소 8 &amp;#x03BC;l 첨가</td></tr><tr><td>30% 과산화수소</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. aegypti</td><td>동물</td><td></td><td></td><td>모기</td></tr></tbody></table>

모기 (a. aegypti)와 감염 표현형 결정에 뎅그열 감염 프로토콜

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

이 절차의 목적은 실험실 조건에서 뎅그열 바이러스 Aedes의 모기를 감염하고 모기가 조직의 감염 수준 및 바이러스의 역학을 조사하는 것입니다. 이 프로토콜은 정기적으로, 특히 벡터 능력을 확인할 수있는 새로운 호스트 요인의 식별, 모기 바이러스 상호 작용을 연구하는 데 사용됩니다. 전체 실험은 BSL2의 연구실에서 수행되어야합니다. Plasmodium falciparum 감염과 마찬가지로, 장갑과 실험 복을 포함한 적절한 복장은 항상 착용해야합니다. 실험 후, 바이러스와 접촉 온 모든 자료는 일반 세탁기와 함께 진행하기 전에 75 % 에탄올과 표백로 치료해야합니다. 다른 모든 자료는 폐기 앞에 autoclaved해야합니다.

유전자가 뎅그열 바이러스에 대한 잠재적 내화물로 식별되면, 그것은 모기 내에서 바이러스 감염을 방지에의 역할에 대해 평가해야합니다. 이 프로토콜은 모기의 뎅그열 감염의 범위가 assayed 수있는 방법을 보여줍니다. 문화, 멤브레인 수유 모기 인간의 혈액에있는 바이러스를 성장하고, 모기 midgut에서 바이러스 titers을 시금에 대한 기술은 증명됩니다.

모기 (A. aegypti)와 감염 표현형 결정에 뎅그열 감염 프로토콜

본 절차의 목적은 실험실 조건에서 이집트숲모기(Aedes mosquito)를 뎅기 바이러스로 감염시키고, ...의 감염 수준과 역학을 조사하는 것입니다.

저는 George Dimopoulos이며, 지금부터 Aedes GTI 모기에 덴그열 바이러스를 감염시키는 절차를 보여드리겠습니다. 가장 먼저 해야 할 일은 Aedes albopictus 세포주에서 바이러스를 증식시키는 것입니다. 제 이름은 Jose Luis Ramirez이며, ous 연구실의 박사 과정 학생입니다.이 실험 절차를 위해 조직 배양 후드와 37 °C로 설정된 CO2 인큐베이터가 갖춰진 BSL 2 시설이 필요합니다. 50 ml 플라스틱 원심분리관이 필요하며, 인간 혈청, 37 °C 항온수조, 원심분리기가 필요합니다.96웰 플레이트와 기타 표준 분자 생물학 및 생화학 시약과 소모품이 필요합니다. 이곳은 BSL 2 시설 내의 일반적인 조직 배양 후드이며, 첫 번째 단계는 75 cm² 플라스크에서 80% 합류도(confluency)까지 성장한 세포를 꺼내는 것입니다. 사용된 배지는 10% 열 불활성화 태아 송아지 혈청(heat-inactivated fetal bovine serum), 1% L-glutamine 및 비필수 아미노산이 첨가된 MEM 배지입니다.이제 세포에 뎅기 바이러스를 첨가하겠습니다. -80°C 냉동고에서 바이러스 스톡을 꺼내 37°C 인큐베이터에서 해동했습니다. 세포당 약 1.5개의 바이러스 입자 농도가 되도록 약 0.5 mL의 바이러스 스톡을 세포에 첨가합니다.그 후 세포를 진탕기에 넣고 낮은 속도로 약 15분 동안 진탕합니다. 다음으로, 세포를 CO2 배양기에 넣고 약 45분 동안 배양합니다. 온도는 37 °C, CO2 농도는 5%로 설정합니다. 45분간의 배양이 끝나면 세포를 꺼내어 배지 30 ml를 첨가한 다음, 다시 배양기에 넣고 5일 동안 더 배양합니다.이제 감염을 위한 바이러스 입자를 준비하겠습니다. 먼저, 스크레이퍼를 사용하여 플라스크에서 세포를 떼어낸 다음, 배지와 함께 50 ml 원심분리관으로 옮깁니다. 이제 세포를 12,000 RPM으로 10분 동안 원심분리하여 펠렛으로 만듭니다.이 병의 바닥에서 펠릿을 확인할 수 있습니다. 다음으로, 세포로부터 바이러스를 방출시키기 위해 상층액을 제거하고 세포가 포함된 1 ml만 남깁니다. 이후 이를 동결시킵니다.이렇게 하면 세포가 파쇄되며, 이후 세포를 해동하고 다시 동결시키는 과정을 3~4회 반복하며, 동결은 드라이아이스 상에서 진행합니다. 동결 후, 세포 펠렛을 37 °C 항온 수조에 넣어 해동시킨 다음 다시 드라이아이스로 동결합니다. 각 동결 단계 사이에는 볼텍싱을 통해 세포를 부유시킵니다. 이제 바이러스가 포함된 상층액을 수집하여, 마찬가지로 바이러스 입자가 포함되어 있는 이전 원심분리 단계의 상층액에 추가합니다.이제 이 바이러스 조제물을 동일한 양의 인간 전혈 및 혈청과 혼합할 준비가 되었습니다. 여기서는 바이러스 조제물을 15% 인간 혈청이 첨가된 인간 전혈과 혼합하였습니다. 이 혈액-바이러스 용액은 이제 모기에게 급여하여 감염시키는 데 사용될 것입니다.이 혈액을 멤브레인 피더(membrane feeder)에 넣은 다음, 모기가 들어 있는 컵 위에 멤브레인 피더를 배치하여 모기가 약 25분 동안 혈액을 섭취하도록 하겠습니다. 멤브레인 피더를 고정하기 위해 클립을 끼워 두었습니다. 이 클립은 기본적으로 망 위에서 피더가 움직이지 않게 눌러주는 역할을 하며, 이제 피더에 혈액을 넣겠습니다.모기들은 자연적으로 어두운 곳에서 자주 흡혈하기 때문에, 경우에 따라 이 실험은 암실에서 수행할 때 더 효과적일 수 있습니다. 이는 물론 모기 군집이 어떻게 조건화되었는지에 따라 달라집니다. 이제 모기들이 약 25~30분 동안 흡혈했으므로, 막 피더(membrane feeder)를 제거하여 오염 제거를 위해 안전한 용기에 담아둡니다.흡혈 처리 후, 흡혈하지 못한 모기를 흡혈한 모기로부터 분리해야 합니다. 이를 위해 혈액을 섭취한 모기가 들어 있는 소형 컵을 저온실에 5분에서 10분 동안 두어 모기를 마취시켰습니다. 보이는 바와 같이, 모기들은 저온 상태에서 이미 마취되었습니다.뚜껑을 열고 모기들을 작은 페트리 접시로 옮깁니다. 모기들이 계속 냉각 상태를 유지하여 탈출하지 못하도록 페트리 접시는 아이스 버킷 위에 둡니다. 이 모기들은 감염된 상태이므로, 외부로 유출되지 않도록 각별히 주의해야 합니다. 모기들을 저온실로 옮긴 후, 상온으로 유지되는 일반 곤충 사육실로 이동시키는데, 이때 모기들이 항상 진정된 상태를 유지할 수 있도록 페트리 접시를 아이스 버킷에 담긴 채로 옮깁니다.흡혈한 모기가 흡혈하지 않은 모기(UNFI)와 어떻게 구분되는지 확인할 수 있습니다. 흡혈한 모기는 체내에 혈액이 들어 있으며, 완전히 팽창한 상태입니다.일부는 혈액을 부분적으로 섭취하여 완전히 팽창하지 않은 상태입니다. 이들은 복부에 소량의 혈액이 들어 있지만, 다른 개체들은 복부에 많은 양의 혈액이 들어 있습니다. UNFI 개체들은 복부에 혈액이 전혀 없으므로, 흡혈한 개체와 흡혈하지 않은 개체를 매우 쉽게 구별할 수 있습니다.이제 모기들을 페트리 접시에서 왁스 라인 처리된 판지 컵으로 옮기겠습니다. 다음 단계는 모기 내 뎅기 바이러스 감염 여부를 분석하는 것입니다. 모기의 중장 내 바이러스 감염을 분석하려면, 흡혈 후 약 7일째에 모기를 해부해야 합니다.침샘의 바이러스 감염을 분석하려면 흡혈 후 약 14일째에 모기를 해부해야 합니다. 이제 Jose가 모기에서 중장을 해부하는 방법을 보여드리겠습니다. 모기들은 현재 얼음 위에서 마취된 상태이며, 70% ethanol에 약 1분 동안 담가 살처분할 것입니다. 다음으로, 모기를 두 번의 연속적인 세척 수조로 옮깁니다.각각 1분씩 처리합니다. 이는 모기에서 에탄올을 세척해내기 위함입니다. 이제 현미경 슬라이드 위에서 PBS를 이용해 모기를 해부하겠습니다.Aedes mosquitoes의 중장(midgut)을 분리하는 가장 좋은 방법은 모기를 날개 위로 뒤집어 놓은 다음, 한쪽 핀셋으로는 복부를 잡고 다른 핀셋으로는 흉부를 잡은 뒤 모기를 잡아당기는 것입니다. 이제 Jose가 모기를 잡아당기고 있으며, 모기의 복부와 흉부 사이에 장이 나타날 것입니다. 여기서 장은 모기의 윗부분에 나타난 반투명한 조직입니다.이제 해부한 장을 세포주 배지로 옮기고, 장에서 바이러스 입자를 분리하기 위해 조직 배양 후드로 가져가겠습니다. 해부된 중장을 조직 배양실로 가져와 유발(pestle)로 균질화하여 바이러스 입자를 방출시킵니다. 중장 균질화 후, 균질액에 배지를 추가하여 바이러스 입자를 1:100 비율로 희석합니다.그런 다음 이를 1:10, 1:100에서 1:1000까지 추가로 희석합니다. 96-웰 플레이트의 경우, 24-웰 플레이트에서 Alba picto 세포주를 80% 합류도(confluency)로 준비했습니다. 그 후 Alba picto 세포의 상층액을 제거하고, 각 희석 단계의 바이러스 입자 농도를 결정하기 위해 이 세포들에 희석된 바이러스 입자를 첨가합니다.이를 통해 바이러스의 감염 수준을 결정할 수 있습니다. 모기 중장 내에서 세포를 실온에서 15분 동안 천천히 흔들어 섞어줍니다. 그 다음, 세포를 37 °C CO2 배양기에 45분 동안 배양합니다.다음으로 각 웰에 1% methyl cellulose overlay 1 ml를 첨가하고, 플레이트를 37 °C CO2 인큐베이터에서 5일 동안 다시 배양합니다. 5일간의 배양 후, 각 웰에 acetone methanol 고정액 1 ml를 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 4 °C 냉장고에서 1시간 동안 배양합니다.다음으로, 고정액을 제거하고 각 웰을 PBS로 한 번 세척합니다. 다음으로, 5% 혈액 용액에서 항 뎅기 1차 항체를 1:1000 비율로 희석합니다. 다음으로, 이 항체 용액 200 µL를 첨가합니다.각 웰에 분주하십시오. 감사합니다. 다음으로, 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 그다음 과면역 액체를 제거하고 각 웰을 1 XPBS로 세척합니다.다음으로, 2차 항체를 사용하여 동일한 방식으로 절차를 반복합니다. 프로토콜에 따라 기질 20 ml를 준비하여 용기에 담습니다. 그 후, 각 웰에 기질 200 µL를 첨가합니다.다음으로 기질을 제거하여 반응을 중단시키고, 각 웰에 1 ml의 증류수를 추가합니다. 그런 다음 플레이트에서 물을 버리고 플레이트를 건조시킵니다. 각각의 색상 점은 바이러스의 플라크를 나타내며, 이 플라크들의 수를 세어 균질화한 모기의 원래 중장에 포함되어 있던 바이러스 입자의 수를 추정할 수 있습니다.지금까지 aegypti 모기에 뎅기 바이러스를 감염시키는 절차를 살펴보았습니다. 이 프로토콜은 모기 세포주에서 바이러스를 생산하는 과정을 포함합니다. 이후 세포주로부터 바이러스 입자를 정제 및 분리하며, 이를 인간 전혈과 혼합하여 모기에게 급여합니다.바이러스가 모기를 감염시키고 감염이 확립되면, 모기의 중장 조직을 분리하고 이 중장의 감염 수준을 결정하는 방법을 보여드렸습니다. 기본적으로 중장을 균질화하고 이 절차를 통해 중장에서 바이러스 입자를 방출시킵니다. 그런 다음, 이 바이러스 입자로 모기 세포주를 다시 감염시켜 중장의 감염 수준, 즉 모기 중장을 감염시킨 바이러스 입자의 수를 결정합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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여성 A. aegypti 모기에의 dsRNA의 분사

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A는 설명 모기 hemocytes를 수집하고 얼룩 아직 정확한 방법을 단순화. 우리의 방법은 Aedes 모기에 hemocytes의 깨끗한 준비를 분리 높은 사출 기술의 정확성과 재관류의 단순 결합. 이 방법은 연구가 필요한 hemocytes의 유형에 대한 지식과 풍부한을 용이하게합니다.

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말라리아 전염 모기는 분자 기술을 통해서만 감지할 수 있는 역학적으로 중요한 여러 가지 특성을 가지고 있습니다. MALDI-TOF 기반 SNP 유전형 분석 플랫폼을 활용하여 말라리아 매개체의 여러 주요 특성(종, 살충제 내성, 기생충 감염 및 숙주 선택)을 동시에 검출할 수 있는 분석을 개발했습니다.

말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석

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현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

제시된 프로토콜은 봉쇄 환경에서 Zika와 같은 주어진 바이러스에 대한 Aedes aegypti 모기 집단의 벡터 역량을 결정할 수 있다.

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모기 (A. aegypti)와 감염 표현형 결정에 뎅그열 감염 프로토콜

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