모기 (A. aegypti)와 감염 표현형 결정에 뎅그열 감염 프로토콜

저는 George Dimopoulos이며 이제 Aidas GTI 모기를 뎅기열 바이러스에 감염시키는 방법에 대한 절차를 보여 드리겠습니다. 가장 먼저 해야 할 일은 Aidas Aus 세포주에서 바이러스를 전파하는 것입니다. 제 이름은 호세 루이스 라미레즈(Jose Luis Ramirez)이고, 연구실에서 박사 과정을 밟고 있는 학생입니다.

이 절차를 위해서는 조직 배양 후드가 있는 BSL 2 시설, 섭씨 37도로 설정된 CO2 인큐베이터가 필요합니다. 50ml 플라스틱 원추형 튜브가 필요합니다. 우리는 인간 혈청이 필요하고, 수조가 필요하고, 섭씨 37도, 원심 분리기가 필요합니다.

우리는 96 웰 플레이트 및 기타 표준 분자 생물학 및 생화학, 시약 및 소모품이 필요합니다. 이것은 BSL 2 시설에서 일반 조직 배양 후드이며, 첫 번째 단계는 75제곱센티미터 플라스크에서 80% co로 성장한 세포를 제거하는 것입니다. 이것은 10%L-글루타민 및 비필수 아미노산이 보충된 10%의 열, 열 및 활성화된 소 태아 혈청을 함유한 MEM 배지입니다.

자, 이제 뎅기열 바이러스를 세포에 추가해 보겠습니다. 우리는 영하 80도의 냉동고에서 바이러스 스톡을 꺼내 37도 인큐베이터에서 해동했습니다. 우리는 세포당 약 1.5개의 바이러스 입자 농도를 달성하기 위해 세포에 약 0.5밀리리터의 스톡 바이러스를 추가합니다.

그런 다음 세포를 느린 쉐이킹 속도로 약 15분 동안 쉐이커에 놓습니다. 다음으로, 세포를 CO2 인큐베이터에 약 45분 동안 넣습니다. 섭씨 37도에서 CO2 농도는 5%입니다.45분 배양 후 세포를 꺼내고 배지 30ml를 추가한 다음 세포를 다시 인큐베이터에 넣고 5일 동안 더 배양합니다.

이제 바이러스 입자가 감염될 수 있도록 준비합니다. 먼저 스크레이퍼를 사용하여 플라스크에서 세포를 분리한 다음 미디어와 함께 50ml 원추형 튜브로 옮겨야 합니다. 지금 우리는 12, 그(것)들을 펠릿으로 만들기 위하여 10 분 동안 000 RPMs에 분리기 세포가 있다.

이 병의 바닥에서 펠릿을 볼 수 있습니다. 다음으로, 상등액을 제거하고 세포에서 바이러스를 방출하기 위해 세포와 함께 1ml만 남깁니다. 우리는 그들을 얼릴 것입니다.

그러면 세포가 파열되고, 그런 다음 세포를 해동한 다음 다시 얼린 다음 이 과정을 3-4번 반복하고 드라이아이스에서 얼립니다. 동결 후 세포 펠릿을 37도 수조에 올려 해동한 다음 각 동결 단계 사이에 건조한 눈에서 다시 동결하고 WEP는 소용돌이를 통해 세포를 매달립니다. 이제 우리는 상등액을 함유한 바이러스를 수집하여 바이러스 입자를 포함하는 이전 원심분리의 상층액에 첨가하고 있습니다.

이 바이러스 제제는 이제 동일한 양의 전혈 및 혈청과 결합할 준비가 되었습니다. 여기에서 우리는 15%human 혈청으로 보충된 전혈과 바이러스 준비를 결합했습니다. 이 혈액 바이러스 용액은 이제 모기에게 먹이를 주고 감염시키는 데 사용될 것입니다.

우리는 이 혈액을 멤브레인 피더에 넣고 이 멤브레인 피더를 모기가 들어 있는 컵에 놓고 모기가 약 25분 동안 이 피를 먹도록 할 것입니다. 멤브레인 피더를 안정화하기 위해 멤브레인 피더에 클립을 배치했습니다. 그것은 기본적으로 그물에서 무게를 줄이고 이제 우리는 피를 공급기에 추가할 것입니다.

어떤 경우에는 자연적으로 모기가 어두운 곳에서 먹이를 먹기 때문에 이 실험은 어두운 곳에서 수행할 때 더 잘 작동할 수 있습니다. 이것은 물론 모기 군집이 어떻게 조절되었는지에 달려 있습니다. 모기는 이제 약 25분에서 30분 동안 먹이를 먹었고, 우리는 멤브레인 피더를 제거하고 오염 제거를 위해 안전한 용기에 넣을 수 있습니다.

혈액 피팅 후, 부적합한 모기는 연방 모기에서 제거되어야 합니다. 이를 위해 우리는 피를 먹인 모기가 담긴 작은 컵을 5분에서 10분 동안 차가운 방에 넣어 모기를 쓰러뜨렸습니다. 보시다시피 모기는 이미 추위에 떨고 있습니다.

우리는 뚜껑을 열고 모기를 작은 휘발유 접시에 담아 얼음 양동이에 담아 모기가 내내 추위에 떨며 도망칠 수 없도록 합니다. 이들은 감염된 모기이므로 느슨해지지 않도록 모든 주의를 기울여야 한다는 것을 기억하십시오. 일단 모기가 냉장실에 내려가면 모기를 실온으로 유지되는 일반 방으로 옮기지만 우리는 항상 얼음 양동이에 보관된 석유 접시에 모기를 넣습니다.

UNFI 모기에서 Fed 모기를 제거하는 방법을 볼 수 있습니다. 연준의 사람들에게는 피가 흐르고 있습니다. 그들은 완전히 충혈되어 있습니다.

그들 중 일부는 부분적으로 피를 먹었기 때문에 완전히 충혈되지 않았습니다. 그들은 복부에 소량의 피를 가지고 있지만 다른 사람들은 복부에 많은 피를 가지고 있습니다. UNFI는 복부에 피가 없기 때문에 연준과 부적합한 사람들을 쉽고 쉽게 구별할 수 있습니다.

그래서 우리는 이 모기들을 휘발유 접시에서 왁스 라인 판지 컵으로 옮길 것입니다. 다음 단계는 모기의 뎅기열 바이러스 감염을 분석하는 것입니다. 모기의 장내 바이러스 감염을 분석하려면 모기가 혈액을 섭취한 후 약 7일째에 모기를 해부해야 합니다.

그리고 살리샘의 바이러스 감염을 분석하려면 혈액 공급 후 약 14일 후에 모기를 해부해야 하며, Jose는 이제 모기에서 내장을 해부하는 방법을 보여줄 것입니다. 모기는 이제 얼음 위에서 마취되었으며 약 1분 동안 70% 에탄올에서 배양을 통해 모기를 죽일 것입니다. 다음으로, 우리는 모기를 두 개의 연속적인 수조로 옮깁니다.

각 1분씩. 이것은 모기로부터 에탄올을 씻어내기 위한 것입니다. 이제 PBS의 모기를 현미경 슬라이드로 해부해 보겠습니다.

집시 모기에서 중장을 해부하는 가장 좋은 방법은 모기를 날개에 거꾸로 놓고 한 집게로 복부 부분을, 다른 집게로 흉부를 잡은 다음 모기를 당기는 것입니다. 이제 호세는 모기를 떼어내고 장이 모기의 복부와 흉부 사이에 나타날 것입니다. 이제 장은 모기의 윗부분에 나타난 반투명 조직입니다.

이제 절개된 장을 세포주 배지로 옮기고 조직 배양 후드로 가져와 장에서 바이러스 입자를 분리합니다. 절개된 중간 내장을 조직 배양실로 가져와 바이러스 입자를 방출하기 위해 유봉으로 균질화합니다. midgut 균질화 후에, 우리는 균질화에 바이러스 입자의 1개에서 100개의 희석을 달성하기 위하여 매체를 추가합니다.

그런 다음 이것을 1에서 10으로, 1에서 101에서 1000으로 더 희석합니다. 96 well plate에서 24 well plate에서 80%co fluency로 Alba picto cell line을 준비했습니다. 그런 다음 열공 알바 픽토 세포에서 sup natant를 제거하고 이 세포에 희석된 바이러스 입자를 첨가하여 각 희석액에서 바이러스 입자의 농도를 측정합니다.

이를 통해 바이러스의 감염 수준을 확인할 수 있습니다. 그런 다음 모기 중장에서 세포를 실온에서 15분 동안 천천히 흔듭니다. 그런 다음 37도 CO2 인큐베이터에 45분 동안 세포를 놓습니다.

다음으로 각 웰에 1ml의 1% 메틸 셀룰로오스 오버레이를 추가하고 플레이트를 37도 CO2 인큐베이터에서 5일 동안 다시 배양합니다. 5일간의 배양 후, 우리는 각 웰에 1ml의 아세톤 메탄올 고정제를 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 4도의 접시를 냉장고에서 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, 고정제를 제거하고 PBS로 각 웰을 한 번 씻습니다. 다음으로, 우리는 5% 혈액 용액에서 항 뎅기열 1차 항체를 1:1000 희석합니다. 다음으로, 이 항체 용액 200마이크로리터를 추가합니다.

하나하나 잘 머리를 움직입니다. 감사. 다음으로, 섭씨 37도에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 다음으로 고면역액을 제거하고 하나의 XPBS로 각 우물을 씻습니다.

다음으로, 2차 항체와 정확히 동일한 방식으로 절차를 반복합니다. 우리는 프로토콜에 따라 20ml의 기질을 준비하고 용기에 추가합니다. 그런 다음 각 웰에 200마이크로리터의 기판을 추가합니다.

다음으로 기질을 제거하여 반응을 중지하고 각 웰에 증류수 1ml를 추가합니다. 그런 다음 접시에서 물을 버리고 접시를 건조시킵니다. 각 색깔의 점은 바이러스의 플라크를 나타내며, 이 플라크를 세어 우리가 균질화한 모기의 원래 중장에 있던 바이러스 입자의 수를 추정할 수 있습니다.

우리는 방금 이집트 모기에서 뎅기열 바이러스 감염을 수행하는 방법의 절차를 보여 드렸습니다. 이 프로토콜은 모기 세포주에서 바이러스를 생산하는 것과 관련이 있습니다. 그런 다음 바이러스 입자는 세포주에서 정제되어 분리된 다음 인간 전혈과 혼합되어 모기에게 공급됩니다.

바이러스는 모기를 감염시킬 것이며 감염이 확인되면 모기의 중장 조직을 분리하는 방법과 이 중장의 감염 수준을 결정하는 방법을 보여주었습니다. 우리는 기본적으로 중장을 균질화하고 이 중장에서 바이러스 입자를 방출하는 절차를 사용합니다. 그런 다음 이 바이러스 입자를 사용하여 모기 세포주를 다시 감염시켜 중장의 감염 수준, 즉 모기 내 내장을 감염시킨 바이러스 입자의 수를 확인합니다.