Name: 모스키토 리어링 (A. gambiae)에 대한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T01:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: 배우세요 Anopheles gambiae 모기 사육 방법을 실험실 환경에서. 온도와 습도를 조절하여 모든 생활사 단계를 성공적으로 관리하고 말라리아 연구에 필요한 건강한 모기를 얻습니다.

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모기 음식 : <ol><li> 음식 : 접지된 물고기 음식 (Aquaricare). 작은 핀치가 추가되어야합니다. </li><li> 식품 B : CAT 식품 (Purina)을 접지. 작은 핀치가 추가되어야합니다. </li><li> 식품 C : 고양이 음식 (Purina). 두 정제가 추가되어야합니다. </li></ol> 블러드 : 동물이나 인간의 혈액은 뒷면 모기하는 데 사용할 수 있습니다. 신선한 피가 주사기로 수집하여 혈액의 각 10 ML에 대한 CPD (항응고제)의 1ml를 포함하는 멸균 15 ML 팔콘 튜브에 넣어 부드럽게 섞어 5 분 2000 rpm으로 실온에서 centrifuged입니다. 뜨는 다른 혈액 세포 (예 : WBC)을 구성되어 버피 코트를 제거를 돌보는 삭제됩니다. RBC 펠렛은 다음 pipetting하여 RPMI 매체의 동일한 볼륨에 정지하고, 추가로이 중간에 세 번 씻어입니다. 최종 세척 후 pelleted RBCs가 RPMI 매체의 동일한 볼륨에 resuspended 아르 4에 저장된 ° C (80~10일 보존 수 있습니다.) 먹이를하기 전에, RBC는 (RPMI)를 셀 아래로 펠렛을 (5 분 2000 RPM) centrifuged이며, 포장 RBC는 40 % 혈소판을 얻기 위해 혈청 (O + 인간 혈청)에 resuspended 있습니다. 피를 ° C 항상 먹이를 위해 37 보관해야합니다. DAY 1 : <ol><li> 3-5일 오래된 성인 여성 모기는 알을 낳기 위해 혈액을 공급하고 있습니다. </li><li> 혈액 먹이를 들어, 인공 막 (parafilm) 수유 방법은 다음과 같이 사용됩니다 : <ol><li> 적혈구는 (혈액 준비 위 참조) ~ 40 %의 혈소판을 (RBC 40 % 혈청 60 %를 포장)을 구하는 열 inactivated 혈청과 혼합됩니다. 이것은 유리 피더에 추가됩니다. </li><li> 피더는 (37 ° C) 물 재킷 따뜻한 연결하고, 멤브레인 표면에 모기의 액세스를 허용하기 위해 새장에 배치됩니다. </li><li> 모기는 ~ 30 분 동안 피드를 사용할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 3 일 : <ol><li> 그들은 피를 먹이 후 암컷 이틀 알을 낳습니다. 원뿔 모양에 싼 작은 종이 필터는 필터 종이 촉촉한도록하고, 증류수가 들어있는 작은 비커에 들어가게된다. 비커는 알을 낳기 위해 모기에 대한 밤새 케이지 내부에 보관됩니다. </li></ol> DAY 4 : <ol><li> 모기 계란을 포함 여과지는 ~ 300 ML 증류수와 플라스틱 트레이에 배치됩니다. 음식의 핀치는 트레이에 추가하고 달걀은 다음 일 동안 애벌레로 부화 수 있습니다. </li></ol> 일 5-8 : <ol><li> 성장하는 애벌레가 음식을 C의 두 돌판과 함께 매일 공급하고, 밀도와 인구에 대한 모니터링입니다. 여덟째 날 (오일 된 애벌레)에서 애벌레 인구는 각 트레이에 식품 식품 C의 두 정제를 한 스푼과 함께 1 트레이에서 ~ 10 트레이로 희석합니다. (~ 30 분) </li></ol> 일 9-12 : <ol><li> 애벌레는 12 일 (구일 된 애벌레)에서 식품 C. 매일 같이 먹이 있으며, 물을 신선한 물로 변화이며, 음식 (식품 및 식품 B C의 두 정제의 핀치) 추가됩니다. pupae이 단계에서 개발 시작합니다. 쟁반은 성인의 탈출을 방지하기 위해 그물로 덮여있다. (~ 80-10 분) </li></ol> DAY 13-15 : 삼일 - pupae는 다음 2 성인에 등장할 수 있습니다. 식품은 신중하게 성인의 탈출 방지하기 위해 그물을 제거하여 애벌레 / pupae 매일 주어집니다. DAY 16 : <ol><li> 성인은 진공에 연결된 흡인기를 통해 케이지로 수집하고 있습니다. 케이지는 10 %의 자당 (autoclaved) 및 케이지 처리하는 동안 발생할 수있는 잠재적인 설탕 유출 소크하기 위해 바닥에 종이 타월 라이닝과 함께 배어있는 목화 심지와 작은 100 ML 병으로 구성되어 있습니다. (~ 30-40 분) </li></ol> DAY 17-21 : <ol><li> 성인 (남성과 여성 모두) 다음 4~5일에 대한 insectary 방에 보관들은 다음주기를 시작하기 위해 다시 혈액 공급되기 전에 10 %의 자당에 공급하고 있습니다. 동일한 모기는 한 번 이상 알을 낳기 위해 사용할 수 있습니다. </li><li> 실험이나 양육을 위해 필요하지 않은 모기는 냉동실에 새장을 배치에 의해 사망​​ 수 있습니다. 사용 트레이와 케이지 그들이 다시 사용하기 전에 청소하고 건조해야합니다. </li></ol> 참고 :이 모기 양육 방식에서 일부 차이를 보일 수 있으며, 다른 연구소 서로 다른 기술을 가지고 있습니다.

<ol><li>Bangs, M. J., Soelarto, T., Barodji,, Wicaksana, B. P., Boewono, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+Anopheles+maculatus+from+Central+Java%2C+Indonesia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Colonization of Anopheles maculatus from Central Java, Indonesia.</a> J Am Mosq Control Assoc. 18, 359-363 (2002).</li>
<li>Beier, M. S., Beier, J. C., Merdan, A. A., el Sawaf, B. M., Kadder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+rearing+techniques+and+adult+life+table+parameters+for+Anopheles+sergentii+from+Egypt%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory rearing techniques and adult life table parameters for Anopheles sergentii from Egypt.</a> J Am Mosq Control Assoc. 266, 266-270 (1987).</li>
<li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Care+and+maintenance+of+anopheline+mosquitoes%2C+The+molecular+biology+of+disease+vectors%3A+A+methods+manual%22">Care and maintenance of anopheline mosquitoes, The molecular biology of disease vectors: A methods manual</a>. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Champman & Hall. London. 3-12 (1997).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>먹이 A</td><td></td><td>Aquaricare</td><td></td><td>분쇄된 물고기 먹이. 소량을 첨가해야 함.</td></tr><tr><td>먹이 B</td><td></td><td>Purina</td><td></td><td>분쇄된 고양이 먹이. 소량을 첨가해야 함.</td></tr><tr><td>먹이 C</td><td></td><td>Purina</td><td></td><td>고양이 먹이. 정제 2개를 첨가해야 함</td></tr><tr><td>RBC</td><td></td><td></td><td></td><td>준비된 적혈구: 인간 혈청 내 40% hematocrit</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>배지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td></td><td></td><td></td><td>항응고제</td></tr><tr><td>serum</td><td></td><td></td><td></td><td>O+ 인간 혈청</td></tr><tr><td>모기 피더</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anopheles gambiae</td><td></td><td></td><td></td><td>모기</td></tr><tr><td>10% sucrose</td><td></td><td></td><td></td><td>모기 먹이</td></tr><tr><td>곤충 사육장</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

모스키토 리어링 (a. gambiae)에 대한 프로토콜

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

이 프로토콜은 insectary에 모기 양육에 대해 설명합니다. insectary 객실은 28 유지 ° C와 12 시간 함께 ~ 80 %의 습도. 주 / 야주기. 이 절차를 들어, 모기 연습장 10 % 살균 자당 솔루션, 종이 수건, 비커, 왓먼 필터 종이, 유리 모이통, 인간 혈액 및 혈청, 물 목욕, parafilm, 증류수, 깨끗한 플라스틱 쟁반, 모기 음식 (설명 필요 아래), 어른을 수집하기 위해 트레이, 진공 및 수집 챔버를 충당하기 위해 그물 모기.

이 동영상은 실험실에서 뒤쪽 아노 펠 레스 gambiae하는 데 사용되는 일반적인 기법을 보여줍니다. 실험실 모기를 돌보는위한 방법은 혈액 먹이 어른 pupae에 애벌레에서 유기체의 생명주기의 모든 단계를 통해 증명하고 있습니다.

모스키토 리어링 (A. gambiae)에 대한 프로토콜

본 프로토콜은 곤충 사육실에서의 모기 사육 방법을 설명합니다. 곤충 사육실은 28°C의 온도와 약 80%의 습도로 유지되며, 12시간의 명/암 주기...

안녕하세요, 저는 존스 홉킨스 보건대학원 George OU 박사님 연구실의 박사후 연구원 Shish입니다. 분자 미생물학 및 면역학과에서 모기 종인 phis Gambi를 사육하는 방법을 보여드리겠습니다. 연구실 내 곤충 사육실에서 이들을 관리하며, 사육실은 보통 27 °C의 온도와 80% 습도로 유지됩니다.곤충 사육실은 자연 상태의 환경을 모방하기 위해 12시간 주기 낮밤 사이클로 유지됩니다. 이곳은 저희가 보유한 곤충 사육실로, 이곳의 핵심 시설이며 곤충들을 관리하는 곳입니다. 보시는 바와 같이, 알, 다양한 단계의 유충 및 번데기 등 모든 성장 단계의 모기가 담긴 다양한 트레이들이 준비되어 있습니다.이 트레이들에는 11일 또는 12일 된 유충들이 들어 있으며, 이곳은 성체 모기를 수집하여 10% sucrose 용액과 함께 유지하는 케이지입니다. 모기 사육을 시작하려면 모기에게 혈액을 먹여야 하는데, 모기가 알을 낳기 위해서는 혈액 속의 단백질이 필요하기 때문입니다. 따라서 1일 차는 성체 모기를 케이지에 수집하여 10% sucrose 상태로 유지한 후부터 시작됩니다.첫째 날에는 모기에게 혈액을 공급해야 하며, 이것이 인공 막 혈액 공급법을 사용하는 이유입니다. 이것은 모기의 막 공급에 사용하는 유리 피더입니다. 보이는 작은 구멍을 통해 내부에 혈액을 넣으면 그 안에 담기게 됩니다.하단 측면에는 두 개의 노즐이 있으며, 이는 37°C로 유지되는 온수조에 연결되어 있습니다. 혈액을 37°C의 온도로 유지하고 급이 장치를 준비하기 위해, 소량의 페릴(peril) 조각을 준비합니다. 양 끝과 네 면을 모두 잡아당겨 늘린 다음, 유리 급이 장치의 열린 쪽에 부착하여 피부와 유사한 얇은 막 형태의 층을 만듭니다.이것은 막 공급법(membrane feeding)이라고 불리는 방식입니다. 이것은 순환식 항온수조로, 수온을 37°C로 유지하며 유리 피더(glass feeder)를 통해 물을 순환시켜 혈액이 37°C의 따뜻한 상태로 유지되도록 합니다. 작은 모세관을 통해 유리 피더를 순환식 항온수조에 연결하고 항온수조를 켜면 물이 순환하게 되며, 물과 혈액은 서로 다른 두 개의 챔버에 들어 있기 때문에 절대 섞이지 않습니다.이것은 성체 Phis Gambi 모기가 들어있는 케이지입니다. 여기 유리 피더가 있으며, 이는 순환 수조에 연결되어 있습니다. 케이지 상단에 클램프를 고정하고 200 µL의 혈액을 추가합니다. 케이지에는 수컷과 암컷 모기가 모두 들어있습니다.피를 빨기 위해 찾아오는 것은 암컷뿐입니다. 흡혈은 약 30분 동안 지속됩니다. 흡혈 2일 후, 모기들이 알을 낳을 수 있도록 케이지 안에 산란 컵을 넣어줍니다.실험 방법은 다음과 같습니다. 작은 비커에 증류수를 일부 채운 후, 거름종이를 적셔 원추형으로 말아 증류수가 담긴 비커에 넣고 거름종이가 충분히 젖도록 합니다. 이제 모기가 밖으로 나오지 않도록 주의하며 모기 케이지를 천천히 열고, 알 수집 컵을 내부에 배치합니다.컵을 케이지 안에 넣은 다음 날, 즉 4일째 되는 날에 컵을 케이지에서 천천히 꺼냅니다. 여기 보면 죽은 모기들과 함께 검은색의 알들이 보입니다. 알이 준비되면 이를 플라스틱 트레이에 옮겨 담습니다.먼저, 플라스틱 트레이에 증류수를 채웁니다. 알이 담긴 여과지를 꺼내어 트레이에 넣습니다. 또한 분쇄된 어류 먹이인 먹이 A를 한 꼬집 추가하고, 트레이를 랙에 넣습니다.트레이를 시작하는 날에 트레이의 수평을 맞춰야 하며, 또한 이곳에 있는 종이 무엇인지 확인해야 합니다. 이는 알을 트레이에 넣은 다음 날의 과정입니다. 즉, 현재 알들은 부화 후 1일 되었으나, 실제 프로토콜은 모기 배양 5일 차에 해당합니다.검은색은 알이며, 곧 유충으로 부화할 예정입니다. 그리고 이것들은 모기 먹이입니다. 모기 사육을 위해 보통 세 가지 종류의 먹이를 사용합니다.먹이 A는 분쇄된 물고기 먹이이며, 모기 배양을 시작하는 X 단계에서 이 먹이를 첨가합니다. 매일 먹이 C(Purina에서 구매한 고양이 사료) 두 알을 첨가합니다. 8~9일 후, 트레이의 물을 교체하여 신선한 물을 공급합니다. 이때 먹이 A 대신 먹이 B(분쇄된 먹이 C, 즉 분쇄된 고양이 사료)를 한 꼬집 넣고, 먹이 C 두 알을 함께 첨가하여 알이 유충으로 부화하도록 합니다.유충은 세 가지 다른 단계로 나뉩니다. 첫 번째 단계, 두 번째 단계, 그리고 세 번째 단계입니다. 이들은 5~6일 된 유충이 들어 있는 트레이들입니다.이것들은 9~10일 정도 된 훨씬 더 나중 단계의 Ravi입니다. 그동안 물을 교체하고 새 물과 신선한 먹이를 추가하였습니다. 이 트레이에는 성체와 ppe가 모두 들어 있습니다.보시는 바와 같이, 모기장 아래에서 날아다니고 있는 것들이 성충입니다. 그리고 가장자리에는 성충으로 부화하게 될 어두운 색의 번데기들이 보입니다. 성충이 되면, 이와 같이 생긴 케이지에 수집할 준비가 된 것입니다.내부에는 페이퍼 타월이 깔려 있으며, 모기의 먹이원이 될 10% super solution이 담긴 작은 병과 면 비누 틴이 들어 있습니다. 뚜껑을 덮었으며, 이것은 진공 장치에 연결되어 트레이에서 성충을 수집하는 장치인 흡입기입니다. 흡입기의 이 부분이 여기에 연결되어 있으며 반대쪽 끝에 위치합니다.진공 장치에 연결합니다. 성충을 이 작은 상자에 수집하기 위해 케이지를 넣습니다. 이것은 흡입기의 또 다른 부분으로, 모기 트레이 내부에 삽입할 긴 튜브가 달려 있습니다.반대편은 케이지에 연결됩니다. 모든 부분이 밀착되어 진공이 잘 작동하는지 확인해야 합니다. 뚜껑을 닫고 모든 부분이 완전히 밀폐되었는지 확인합니다.백엔드를 천천히 시작합니다. 설정이 완료되면, 이 긴 파이프를 모기 트레이 안에 천천히 넣으며, 이때 모기가 밖으로 빠져나가지 않도록 망을 잘 닫아주십시오. 보시는 바와 같이, 모기들이 작은 케이지 안에 수집됩니다.모든 성충을 수집하기 위해 파이프를 천천히 이곳저곳으로 움직입니다. 이제 거의 다 끝났습니다. 모든 성충이 수집되었으며, 보시는 것처럼 모두 이 케이지 안에 들어 있습니다.그런 다음 천천히 진공 상태를 해제하고 수집 장치를 분리합니다. 이것이 *Ana gambiae* 성체 모기들이며, 며칠 동안 이 케이지 안에 머물게 됩니다. 모기들은 10% sucrose를 섭취하게 되며, 산란이 필요할 때만 흡혈하게 됩니다.지금까지 실험실 조건에서 모기를 사육하는 방법을 보여드렸습니다. 글로 정리한 주요 단계는 우선 혈액을 공급하는 것입니다. 그다음 알 컵을 배치하고 알이 부화하는 것을 관찰하며, 이후 유충, 번데기, 성충과 같은 서로 다른 단계들을 거치게 됩니다.마지막으로, 성충을 수집합니다. 이 기술의 중요성은 자연 상태의 야외 환경을 모사하여 건강한 모기를 확보해야 한다는 점에 있으며, 이후 이들에게 plasmodium을 감염시켜 말라리아에 관한 다양한 연구를 수행함으로써 궁극적으로 전 세계에서 말라리아를 퇴치하는 것을 주 목적으로 합니다.

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연구

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