모스키토 리어링 (A. gambiae)에 대한 프로토콜

안녕하세요, 저는 존스 홉킨스 보건대학원 George OU 박사님 연구실의 박사후 연구원 Shish입니다. 분자 미생물학 및 면역학과에서 모기 종인 phis Gambi를 사육하는 방법을 보여드리겠습니다. 연구실 내 곤충 사육실에서 이들을 관리하며, 사육실은 보통 27 °C의 온도와 80% 습도로 유지됩니다.

곤충 사육실은 자연 상태의 환경을 모방하기 위해 12시간 주기 낮밤 사이클로 유지됩니다. 이곳은 저희가 보유한 곤충 사육실로, 이곳의 핵심 시설이며 곤충들을 관리하는 곳입니다. 보시는 바와 같이, 알, 다양한 단계의 유충 및 번데기 등 모든 성장 단계의 모기가 담긴 다양한 트레이들이 준비되어 있습니다.

이 트레이들에는 11일 또는 12일 된 유충들이 들어 있으며, 이곳은 성체 모기를 수집하여 10% sucrose 용액과 함께 유지하는 케이지입니다. 모기 사육을 시작하려면 모기에게 혈액을 먹여야 하는데, 모기가 알을 낳기 위해서는 혈액 속의 단백질이 필요하기 때문입니다. 따라서 1일 차는 성체 모기를 케이지에 수집하여 10% sucrose 상태로 유지한 후부터 시작됩니다.

첫째 날에는 모기에게 혈액을 공급해야 하며, 이것이 인공 막 혈액 공급법을 사용하는 이유입니다. 이것은 모기의 막 공급에 사용하는 유리 피더입니다. 보이는 작은 구멍을 통해 내부에 혈액을 넣으면 그 안에 담기게 됩니다.

하단 측면에는 두 개의 노즐이 있으며, 이는 37°C로 유지되는 온수조에 연결되어 있습니다. 혈액을 37°C의 온도로 유지하고 급이 장치를 준비하기 위해, 소량의 페릴(peril) 조각을 준비합니다. 양 끝과 네 면을 모두 잡아당겨 늘린 다음, 유리 급이 장치의 열린 쪽에 부착하여 피부와 유사한 얇은 막 형태의 층을 만듭니다.

이것은 막 공급법(membrane feeding)이라고 불리는 방식입니다. 이것은 순환식 항온수조로, 수온을 37°C로 유지하며 유리 피더(glass feeder)를 통해 물을 순환시켜 혈액이 37°C의 따뜻한 상태로 유지되도록 합니다. 작은 모세관을 통해 유리 피더를 순환식 항온수조에 연결하고 항온수조를 켜면 물이 순환하게 되며, 물과 혈액은 서로 다른 두 개의 챔버에 들어 있기 때문에 절대 섞이지 않습니다.

이것은 성체 Phis Gambi 모기가 들어있는 케이지입니다. 여기 유리 피더가 있으며, 이는 순환 수조에 연결되어 있습니다. 케이지 상단에 클램프를 고정하고 200 µL의 혈액을 추가합니다. 케이지에는 수컷과 암컷 모기가 모두 들어있습니다.

피를 빨기 위해 찾아오는 것은 암컷뿐입니다. 흡혈은 약 30분 동안 지속됩니다. 흡혈 2일 후, 모기들이 알을 낳을 수 있도록 케이지 안에 산란 컵을 넣어줍니다.

실험 방법은 다음과 같습니다. 작은 비커에 증류수를 일부 채운 후, 거름종이를 적셔 원추형으로 말아 증류수가 담긴 비커에 넣고 거름종이가 충분히 젖도록 합니다. 이제 모기가 밖으로 나오지 않도록 주의하며 모기 케이지를 천천히 열고, 알 수집 컵을 내부에 배치합니다.

컵을 케이지 안에 넣은 다음 날, 즉 4일째 되는 날에 컵을 케이지에서 천천히 꺼냅니다. 여기 보면 죽은 모기들과 함께 검은색의 알들이 보입니다. 알이 준비되면 이를 플라스틱 트레이에 옮겨 담습니다.

먼저, 플라스틱 트레이에 증류수를 채웁니다. 알이 담긴 여과지를 꺼내어 트레이에 넣습니다. 또한 분쇄된 어류 먹이인 먹이 A를 한 꼬집 추가하고, 트레이를 랙에 넣습니다.

트레이를 시작하는 날에 트레이의 수평을 맞춰야 하며, 또한 이곳에 있는 종이 무엇인지 확인해야 합니다. 이는 알을 트레이에 넣은 다음 날의 과정입니다. 즉, 현재 알들은 부화 후 1일 되었으나, 실제 프로토콜은 모기 배양 5일 차에 해당합니다.

검은색은 알이며, 곧 유충으로 부화할 예정입니다. 그리고 이것들은 모기 먹이입니다. 모기 사육을 위해 보통 세 가지 종류의 먹이를 사용합니다.

먹이 A는 분쇄된 물고기 먹이이며, 모기 배양을 시작하는 X 단계에서 이 먹이를 첨가합니다. 매일 먹이 C(Purina에서 구매한 고양이 사료) 두 알을 첨가합니다. 8~9일 후, 트레이의 물을 교체하여 신선한 물을 공급합니다. 이때 먹이 A 대신 먹이 B(분쇄된 먹이 C, 즉 분쇄된 고양이 사료)를 한 꼬집 넣고, 먹이 C 두 알을 함께 첨가하여 알이 유충으로 부화하도록 합니다.

유충은 세 가지 다른 단계로 나뉩니다. 첫 번째 단계, 두 번째 단계, 그리고 세 번째 단계입니다. 이들은 5~6일 된 유충이 들어 있는 트레이들입니다.

이것들은 9~10일 정도 된 훨씬 더 나중 단계의 Ravi입니다. 그동안 물을 교체하고 새 물과 신선한 먹이를 추가하였습니다. 이 트레이에는 성체와 ppe가 모두 들어 있습니다.

보시는 바와 같이, 모기장 아래에서 날아다니고 있는 것들이 성충입니다. 그리고 가장자리에는 성충으로 부화하게 될 어두운 색의 번데기들이 보입니다. 성충이 되면, 이와 같이 생긴 케이지에 수집할 준비가 된 것입니다.

내부에는 페이퍼 타월이 깔려 있으며, 모기의 먹이원이 될 10% super solution이 담긴 작은 병과 면 비누 틴이 들어 있습니다. 뚜껑을 덮었으며, 이것은 진공 장치에 연결되어 트레이에서 성충을 수집하는 장치인 흡입기입니다. 흡입기의 이 부분이 여기에 연결되어 있으며 반대쪽 끝에 위치합니다.

진공 장치에 연결합니다. 성충을 이 작은 상자에 수집하기 위해 케이지를 넣습니다. 이것은 흡입기의 또 다른 부분으로, 모기 트레이 내부에 삽입할 긴 튜브가 달려 있습니다.

반대편은 케이지에 연결됩니다. 모든 부분이 밀착되어 진공이 잘 작동하는지 확인해야 합니다. 뚜껑을 닫고 모든 부분이 완전히 밀폐되었는지 확인합니다.

백엔드를 천천히 시작합니다. 설정이 완료되면, 이 긴 파이프를 모기 트레이 안에 천천히 넣으며, 이때 모기가 밖으로 빠져나가지 않도록 망을 잘 닫아주십시오. 보시는 바와 같이, 모기들이 작은 케이지 안에 수집됩니다.

모든 성충을 수집하기 위해 파이프를 천천히 이곳저곳으로 움직입니다. 이제 거의 다 끝났습니다. 모든 성충이 수집되었으며, 보시는 것처럼 모두 이 케이지 안에 들어 있습니다.

그런 다음 천천히 진공 상태를 해제하고 수집 장치를 분리합니다. 이것이 *Ana gambiae* 성체 모기들이며, 며칠 동안 이 케이지 안에 머물게 됩니다. 모기들은 10% sucrose를 섭취하게 되며, 산란이 필요할 때만 흡혈하게 됩니다.

지금까지 실험실 조건에서 모기를 사육하는 방법을 보여드렸습니다. 글로 정리한 주요 단계는 우선 혈액을 공급하는 것입니다. 그다음 알 컵을 배치하고 알이 부화하는 것을 관찰하며, 이후 유충, 번데기, 성충과 같은 서로 다른 단계들을 거치게 됩니다.

마지막으로, 성충을 수집합니다. 이 기술의 중요성은 자연 상태의 야외 환경을 모사하여 건강한 모기를 확보해야 한다는 점에 있으며, 이후 이들에게 plasmodium을 감염시켜 말라리아에 관한 다양한 연구를 수행함으로써 궁극적으로 전 세계에서 말라리아를 퇴치하는 것을 주 목적으로 합니다.