Name: 에서 기본 셀 문화 Drosophila Gastrula의 태아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 학습하세요 Drosophila 배아에서 1차 세포를 분리하여 RNAi 및 세포 이미징 분석을 수행하는 방법을. 면역형광 현미경을 통해 유전자 기능을 연구할 수 있습니다.

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JB는 데몬 런연 암 연구 재단 원정대 DRG - 1716-02에 의해 지원되었다. 점프 온 제로는 NIH / NIGMS 원정대 F32 GM082174 - 02에 의해 지원되었다. NP는 하워드 휴즈 의학 연구소의 수사관이다.

1. 파리 케이지의 준비 <ol><li> 같은 32 온스의 곤충 컵 등 편리한 용기 Drosophila (예 : 오레곤 - R 또는 유전자형과 같은 야생 형 변종) 성장. </li><li> 대형 배아 - 수집 연습장 새로 eclosed 파리를 전송하거나 인구 새장을 날아. </li><li> ~ 25의 온도와 공간에 새장을 이동 ° C 습도 65 ~ 12 H 비추어 %와 동기식 태아의 수집을 용이하게하기 위해 검은 12 H 사이클. </li><li> 그들 몰레 시즈 접시에 줄무늬 효모 붙여넣기를 죽인 먹이로 새장에 파리를 유지합니다. 2-3를위한 하루에 한 번 당밀 번호판을 (죽은 효모 붙여넣기)를 변경 D. </li></ol> 2. 동기 배아 수집 <ol><li> 기본 셀 준비의 날, 1-2 H 미리 누워 기간 동안 붙여 살해 효모와 코팅 파리 wth 새로운 번호판을 공급. </li><li> 단지 12 - H 어두운주기 전에 효모 붙여넣기의 최소 금액과 함께 줄무늬 신선한 당밀 플레이트와 함께 사전에 누워 접시를 교체하십시오. 비동기 이전 배아를 포함하는 사전 누워 컬렉션을 폐기. </li><li> 1-2 H. 기간 동안 태아를 수집 </li><li> 5-6 H. 25에서 배아와 저장소의 비교적 동기 인구를 포함하는 접시 ° C를 제거 배아 이번에 고급 gastrula 무대에있을 것입니다. </li></ol> 3. 수집 및 배아의 세척 <ol><li> 배아는 하단에있는 최고급 메쉬 체에서 수집하므로, 젖은 페인트와 함께 접시에서 배아를 풀어, 그리고 sieves의 스택 집합을 통해 미지근한 수돗물로 깨끗이 씻어. 가능한 한 많은 효모 및 비행 파편으로 제거하는 몇 분 동안 씻어. </li><li> 팁 배아는 한쪽에 축적되도록 sieves, 그리고 부드럽게 dechorionation 바구니에 체에서 그들을 씻어. </li><li> 배아가 건조 아무말도없이 조직 문화 후드 영역으로 이동합니다. </li></ol> 4. 배아의 균질화 및 세포의 도금 <ol><li> 소독 50 % (권 / 권) 50-10 분 표백제에서 그들을 immersing하여 배아를 d​​echorionate. 70% (권 / 권) 에탄올과 바구니의 벽에서 배아를 씻어. 또는 에탄올 치료를 받기 전에 증류수로 배아에서 표백제를 씻어. 이 시점에서 온워드 배아는 무균 조건과 조직 문화 후드에서 처리되어야합니다. </li><li> autoclaved 증류수와 표백제 및 / 또는 에탄올을 제거 철저하게 배아를 씻어. </li><li> dechorionation 단계 동안, 태아의 크기에 따라 실내 온도 M3 매체의 적절한 볼륨 다운스의 균질 화기를 입력하십시오. 배아의 볼륨 사이와 미디어의 비율은 0.5 - ML 배아 이상해서는 안됩니다 : 40 - ML 미디어 (또는 ~ 100-200 배아 / ML). </li><li> 잠수함 배아를 충분히 M3 미디어의 금액과 소독을 비커에 씻어서 배아를 놓습니다. 배아는 2-5 분 흠뻑 젖어 보자. </li><li> dechorionation 바구니를 분해하고 소독을 종이 타월로 Nitex 메쉬가 건조 얼룩. </li><li> 멸균 페인트로 균질 화기로 배아를 전송합니다. </li><li> 모든 배아가 일시 중지 때까지 튜브의 바닥에 도달하지 않고 느슨한 유봉을 사용하여 짧은 스트로크와 함께 부드럽게 균질. 부드럽게,하지만 단호하게, 여덟 전체 스트로크와 균질. 그것이 아래로 이동하고 같은 유봉을 비꼬아하지 마십시오. </li><li> 용탕 주입이나 pipetting을 통해 살균 50 ML 원뿔 원심 튜브에 homogenate를 전송하고, 튜브 캡. </li><li> 40g, 펠렛을 실온 조직 파편, 큰 세포 대단히 짧은 시간과 vitelline의 점막에서 10 분 원심 분리기. 깨끗한 튜브에 세포와 노른자가 들어있는 뜨는을 전송 5 분 원심 분리 단계를 반복합니다. </li><li> 세포를 따르고 또는 펠렛으로, 360g 10 분 깨끗한 튜브와 스핀으로 실내 온도를 pipetting하여 표면에 뜨는를 주의깊게 전송합니다. 뜨는 폐기하십시오. 문화 매체 10 ML에있는 세포 펠렛을 (RNAi 실험을위한 혈청 무료 중간) Resuspend. </li><li> 세포 밀도를 추정 hemocytometer를 사용하여 가능한 셀을 계산합니다. 한편, 펠렛 세포에 4.10 단계를 반복합니다. </li><li> 원하는 농도로 세포를 Resuspend. 시작하려면 1의 범위 ~ 5 X10 6 셀 / ML 및 1.7-2.5 X10 5 셀 / cm 2 판 밖으로보십시오. </li></ol> 5. 384 잘 접시에 성장 세포에 대한 기본 셀 RNAi <ol><li> 384 잘 플레이트에 잘 당 ~ 250 NG의 최종 농도 각 우물에 dsRNAs 5 μl를 분배. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여, 각 우물에 다른 dsRNA를 포함하는 384 잘 플레이트에 혈청 무료 M3 매체에 잘 따라 기본 셀 10 ML (1 ~ 4x106 세포 / ML)를 분배. 또한, 전지가 공촛점 이미징 8 - 음 유리 챔버 슬라이드에서 교양 수 있습니다. </li><li> 300g, 실온에서 1 분 번호판을 원심 분리기. 25 혈청없는 매체 문화 세포 ° 22 H 또는 18 ° C 1-2위한 C D. </li><li> 각 잘하는 혈청 함유 배지 30 ML을 추가합니다. 리&gt; </li><li> 300g, 실온에서 1 분 번호판을 원심 분리기. </li><li> ~ 7 D 25 추가 5 습기 챔버 문화 기본 세포 ° C.에 접시를 놓고 </li><li> 이미지 세포도 살지 immunofluorescence 염색법 후. </li></ol> 6. 대표 결과 : 최적의 조건에서, 문화에있는 세포 둥근 형태로 건강을 찾습니다. 문화 작은 세포 파편을 가지고 있고, 초기 도금 후 50 ~ 80 % 합류한다. 이러한 세포는 오랜 기간 동안 교양 후 형태학의 변화를 받아야합니다. 그것은 일반적으로 완벽하게 25 차별하는 문화의 세포 약 5~8일 소요 ° C. 좋은 품질의 차 문화는 일반적으로 세포 수준의 관심이 문화에 차별하는 방법 잘으로 판단됩니다. 예를 들어, 기본 근육 세포들은 종종 지점과 같은 형태를하고 sarcomeres 일련의 구성 myofibrils 같은 줄무늬가있는 multinucleated myotubes된다. 완전 차별 myotubes은 대개 저절로 문화에 이동합니다. 대조적으로, 차별화된 기본 뉴런들은 세포 기관과 클러스터를 형성하고, 그들의 축삭 케이블 다른 클러스터와 연결합니다. <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 기본 세포는 문화에 도금 후 morphologic 변경 사항을 받다 오른쪽 384 잘 판의 우물에 도금 후 기본 셀 (A) 명시야 이미지. 세포의 대부분은 원형 그대로 잘 구분됩니다. 기본 세포 배양의 (B) 명시야 이미지 20시간 도금 후. 차 전지는 이미 지점과 같은 형태 (긴 화살표)와 클러스터 (큰 애로)와 근육이 단계에서 인식 수를 형성하고 있습니다. 오일 도금 후 주요 문화 (C) 위상 대비 영상. 문화의 연결을 확장 (작은 화살표)의 연결을 클러스터 (대형 화살촉)와 근육 (중소 화살표)와 함께 더 많은 고급 보인다. <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. dsRNAs 취급 차 전지의 예 384 잘 판에 교양 차 전지는 Dmef2 - Gal4 들고 배아, D42 - Gal4, UAS - 미토 - GFP의 transgenes,하는 Dmef2 - Gal4 및 근육과 운동 신경에 미토 - GFP의 D42 - Gal4 드라이브 표현, 각각에서 고립되었다. 세포 lacZ (AC) 또는 비정상적으로 증가 (경우) (DF) 중 하나를 대상으로 dsRNAs로 치료했다. 주요 근육과 신경 모두 GFP (A, C, D, F)로 볼 수 있습니다. 흰색 화살표의 연결을 확장을 가리 킵니다. 굴지 (화살촉)의 Phalloidin의 얼룩은 lacZ dsRNAs (B와 C) 대우 문화에 지점과 같은 근육 구조를 공개하지만, 문화에 라운드 - 업 근육 형태가있다면 함께 치료 dsRNAs (E와 F). 병합된 이미지 (C, F)에서 근육이 노란색 스테인드지만, 붉은 부정적인 쇼 뉴런과 확장 (흰색 화살표). 아르 <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 주요 근육의 공촛점 micrographs 인간 vitronectin - 코팅 커버 유리 슬라이드에 교양 주요 근육은 immunofluorescently 방지 Drosophila Titin (KZ) (병합에 빨간색)과 굴지에 대한 phalloidin (병합에 녹색) 물들일되었습니다. 상단 패널은 야생 형 제어 근육이며, 아래 것들 살스 (CG31374) 단축 sarcomeres와 RNAi의 근육입니다.

<ol><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Laboratory+culture+of+Drosophila%22">Laboratory culture of Drosophila</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).</li>
<li>Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+WH2-domain-containing+protein%2C+promotes+sarcomeric+actin+filament+elongation+from+pointed+ends+during+Drosophila+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth.</a> Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).</li>
<li>Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+Drosophila+primary+cells+for+genes+involved+in+muscle+assembly+and+maintenance+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance .</a> Development. 135, 1439-1449 (2008).</li>
<li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li>
<li>Donady, J. J., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+culturing+of+Drosophila+embryonic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TCA+Manual%22%5BJournal%5D)">Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro.</a> TCA Manual. 3, 685-687 (1977).</li>
<li>Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neurons+and+myocytes+in+cell+cultures+made+from+Drosophila+gastrulae%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae.</a> Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).</li>
<li>Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+primary+cells+dissociated+from+gastrula+embryos+and+their+use+in+RNAi+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening.</a> Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Drosophila 세포의 주요 문화의 발달 패턴은 크게 기본 셀 준비 과정에서 여러 변수에 따라 가능 다를 수 있습니다. 우선, 달걀 부설에 사용되는 파리 젊은이가 (이전 일주일 이내)과 건강 (바이러스 또는 세균 감염은 무료). 있어야 그들이 쓸모 있고 그 배아에서 추출한 세포가 구별 수없는 오직 1~2일 위해 살아남을 것이다로 Unfertilized 또는 감염된 태아는 피해야한다. 둘째, 균질화 과정에서, 그것은 너무 많은 배아와 과부하 균 질기를하는 것이 중요합니다. 너무 많은 배아와 균 질기를 오버로드하면 부스러기 결국 세포 분화를 손상됩니다 죽은 세포의 숫자의 양을 증가의 원인이됩니다. 마지막으로, 세포는 세포의 기본 좋은 차별을 보장하기 위해 적절한 밀도로 도금한다. 우리는 기본 세포가 너무 높은 밀도에서 처음 씨앗을 때 뉴런과 근육 세포 모두의 분화가 급격하게 감소되고있는 것으로 나타났습니다. phenotypic 분석을 위해, 384 잘 접시는 ...

<table><tbody><tr><td>Shields 및 Sang M3 배지</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3652</td><td></td></tr><tr><td>소태아혈청</td><td>JRH Biosciences</td><td>12103-500M</td><td></td></tr><tr><td>우혈 소 췌장 유래 인슐린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>대형 배아 수집 케이지</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-101</td><td></td></tr><tr><td>#25 US 표준 시험체</td><td>VWR international</td><td>57334-454</td><td></td></tr><tr><td>#45 US 표준 시험체</td><td>VWR international</td><td>57334-462</td><td></td></tr><tr><td>#120 US 표준 시험 체</td><td>VWR international</td><td>57334-474</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 조직 분쇄기, Wheaton 7 mL</td><td>VWR international</td><td>62400-620</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 조직 분쇄기, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0040</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 조직 균질기, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0100</td><td></td></tr><tr><td>Costar, 384-웰 플레이트</td><td>VWR international</td><td>29444-078</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II 챔버 커버글라스</td><td>Fisher Scientific</td><td>171080</td><td></td></tr></tbody></table>

에서 기본 셀 문화 drosophila gastrula의 태아

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

여기 Drosophila gastrula의 배아에서 dissociated을 준비하고 culturing 기본 세포에 대한 방법을 설명합니다. 간단한에서는 많은 양의 젊고 건강한 파리에서 배아를 개최는 수집 소독 및 유리 균질 화기를 사용하여 단일 세포 현탁액에 다음 물리적 dissociated 있습니다. 문화 매체에 적절한 밀도에 문화 접시 또는 챔버 슬라이드에 도금 후,이 세포가 추가로 특정 세포 마커에 의해 확인할 수 있습니다 몇 가지 morphologically - 서로 다른 세포 유형으로 구별하실 수 있습니다. 또한, 우리는 유전자 최저를 이끌어내는 두 번 좌초 (DS) RNAS 이러한 세포를 치료에 대한 조건을 제시한다. Drosophila 차 전지의 효율적인 RNAi는 dsRNA 간단하게 함유 배지에서 세포를 입욕에 의해 수행됩니다. 다른 분자, 생화학, 세포 이미징 분석과 함께 효과적인 RNAi의 섭동을 수행하는 능력은 질문의 다양한 특히 Drosophila 차 전지, 차별화된 근육 세포의 연결에 관련된 사람에 답변 수 있습니다.

우리는에서 dissociated 기본 세포를 준비 상세한 프로토콜을 제공합니다<em&gt; Drosophil</em&gt; 배아. 다른 분자 생화학 및 세포 이미징 방법과 함께, 효과적인 RNAi의 섭동을 수행하는 능력은 질문 다양한에서 해결될 수 있도록<em&gt; Drosophila</em&gt; 기본 세포.

에서 기본 셀 문화 Drosophila Gastrula의 태아

본 논문에서는 초파리(Drosophila) 낭배기 배아에서 분리한 일차 세포를 준비하고 배양하는 방법을 설명합니다. 간단히 요약하면, 단계별로 구분된 다량의...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 RNAi 및 세포 이미징 분석을 위해 초파리 배아에서 분리한 일차 세포를 준비하는 방법을 보여주는 것입니다. 이를 위해 먼저 초파리 사육 케이지를 준비합니다. 그 다음, 동기화된 배아를 수집하고 세척한 뒤 균질화하여 세포를 분리합니다.그 다음 primary cell을 플레이팅하고 RNAi 구축물을 트랜스펙션합니다. 최종적으로 면역형광 현미경 관찰을 통해 분화된 primary cell에 대한 RNAi의 효과를 확인하여 결과를 얻을 수 있습니다. 제 이름은 Namo입니다.저는 하버드 의과대학 유전학과의 교수이자 Overuse Medical Institute의 연구원입니다. 그래서 오늘은 저와 연구실의 펠로우인 Jonathan, 그리고 전직 프로 펠로우와 함께 오가스 또는 배아로부터 일차 세포를 생성하는 기술을 소개해 드리겠습니다. 이 기술은 세포 및 발생 생물학의 여러 응용 분야에서 중요하며, 특히 몇 년 전 Janu가 보여주었듯이, 이 방법론은 일차 근육 세포의 전장 유전체 CRISPR 스크리닝에 사용될 수 있습니다.기존의 불멸화 세포주 분석과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 일차 세포 배양이 생물체의 생물학적 특성을 더 정확하게 반영한다는 점입니다. 일반적으로 이 방법을 수행하는 연구자들은 일부 단계가 단순히 텍스트를 읽는 것만으로는 습득하기 어렵기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 사멸 효모 페이스트를 준비하려면, 먼저 커피 그라인더를 사용하여 과립형 생효모를 고운 가루로 분쇄한 다음, 이를 비커에 넣고 20분 건조 사이클로 오토클레이브 멸균합니다. 오토클레이브 멸균 직후에.효모에 멸균된 뜨거운 물을 충분히 넣어 치약 정도의 점도를 가진 페이스트 상태로 만듭니다. 초파리 배아에서 분리한 일차 세포를 준비하려면, Oregon R과 같은 야생형 초파리 계통을 신선한 초파리 배양병에서 배양한 후, 갓 우화한 초파리들을 대형 배아 수집 케이지 또는 초파리 집단 케이지로 옮깁니다. 다음으로, 동기화된 배아 수집을 용이하게 하기 위해 케이지를 약 25 °C의 온도와 65% 습도, 12시간 명암 주기가 유지되는 방으로 이동시키고 초파리에게 먹이를 공급합니다.당밀 플레이트에 효모 페이스트를 도말합니다. 2~3일 동안 하루에 한 번씩 먹이 플레이트를 교체하십시오. 1차 세포 준비 당일에는 1~2시간의 산란 전 기간 동안 파리에게 신선한 플레이트를 공급하십시오.12시간의 암주기 직전에, 소량의 효모 페이스트를 도말한 신선한 당밀 플레이트로 사전 산란 플레이트를 교체하십시오. 비동기적인 노화 배아가 포함된 사전 산란 수집물은 폐기하십시오.1~2시간 동안 배아를 수집합니다. 상대적으로 동기화된 배아 집단이 포함된 플레이트를 제거하고 25 °C에서 5~6시간 동안 보관합니다. 이때 배아는 수집에 적합한 진행된 위장 단계(advanced gastro stage)가 됩니다.5~6시간의 배양 후, 젖은 붓을 사용하여 플레이트에서 배아들을 떼어냅니다. 그다음 겹쳐진 체에 넣고 충분히 헹구어 효모와 초파리 잔해를 최대한 제거합니다. 이때 배아들이 가장 아래쪽 체에 모이도록 합니다.체(sieve)를 기울여 배아가 한쪽으로 모이게 한 다음, 배아를 체에서 장식 바스켓(decoration basket)으로 조심스럽게 씻어 옮깁니다. 다음으로, 배아를 50% v/v 표백액에 담가 멸균 및 코팅 과정을 진행합니다. 배아가 인큐베이션되는 동안 5분에서 10분 동안 표백합니다.상온의 균질기(homogenizer)로 채웁니다. 배아 0.5 mL당 배지 40 mL 이하의 부피가 되도록 M3 배지를 넣습니다. 그다음 70% (v/v) 에탄올로 바스켓 벽면의 배아를 씻어냅니다.오토클레이브 멸균 증류수를 사용하여 배아를 충분히 헹궈 표백제 또는 에탄올을 제거합니다. 그다음, 헹군 배아를 M3 배지에 담급니다. 멸균된 비커에서 배아가 2~5분 동안 충분히 적셔지도록 두는 동안, 데코레이션 바스켓을 분해하고 멸균된 페이퍼 타월로 NYX 메쉬의 물기를 닦아냅니다.배아가 M three 배지에서 충분히 침지된 후, 멸균된 붓을 사용하여 배아를 균질기로 옮깁니다. 루즈 페스틀(loose pestle)을 사용하여 짧은 스트로크로 부드럽게 균질화하되, 페스틀이 튜브 바닥까지 닿지 않도록 주의하십시오. 모든 배아가 현탁되면 8회의 전체 스트로크를 통해 부드럽지만 확실하게 균질화합니다. 페스틀을 위아래로 움직일 때 비틀지 마십시오. 균질액을 붓거나 피펫팅하여 멸균된 50 milliliter 원뿔형 원심분리 튜브로 옮기고 뚜껑을 닫습니다. 조직 파편, 큰 세포 덩어리 및 지방막을 펠릿화하기 위해 상온에서 40 cheese(원문 유지)로 10분 동안 원심분리합니다.세포와 난황이 포함된 상층액을 깨끗한 튜브로 옮기고 원심분리 단계를 5분 동안 반복합니다. 다음으로, 상층액을 붓거나 피펫팅하여 깨끗한 튜브로 조심스럽게 옮긴 후, 실온에서 360 Gs로 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만들고 상층액을 제거합니다. RNAi 실험을 위해 세포 펠릿을 10 milliliters의 무혈청 배양 배지에 재부유시킵니다.세포 밀도를 추정하기 위해 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 생존 세포 수를 측정합니다. 그런 다음, 360 ×g에서 세포를 다시 펠렛화합니다. 세포를 무혈청 M3 배지에 1~5 × 10⁶ cells/mL 농도로 재부유시키고, 384-웰 플레이트의 각 웰에 1.7~2.5 × 10⁵ cells/cm² 밀도로 분주합니다.웰 플레이트에 최종 농도가 웰당 약 250 ng이 되도록 이중 가닥 RNA 5 µL를 분주합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 혈청이 없는 M3 배지에 부유된 1~4 × 10⁶ cells/mL 농도의 일차 세포 10 µL를 384웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 또는 공초점 이미징을 위해 8웰 글라스 챔버 슬라이드에서 세포를 배양할 수도 있습니다.상온에서 300 Gs로 1분 동안 플레이트를 원심 분리합니다. 플레이트를 25 °C에서 22시간 또는 18 °C에서 1~2일 동안 보관합니다. 각 플레이트에 M three 배지가 포함된 혈청 30 µL를 추가로 첨가합니다.플레이트를 상온에서 300 Gs로 1분간 원심분리합니다. 습윤 챔버 내 25 °C에서 일차 세포를 5~7일 더 배양합니다. 마지막으로, 세포를 살아있는 상태로 또는 면역형광 염색 후에 이미징합니다.최적의 조건에서 세포와 배양 상태는 건강하게 보일 것입니다. 원형의 형태를 띠며, 세포 파편이 거의 없고 50~80%의 합쳐짐(confluency)을 보일 것입니다. 초기 플레이팅 후 세포는 형태학적 변화를 거치며 25 °C에서 약 5~8일 동안 배양하면 완전히 분화됩니다. 이 명시야(brightfield) 이미지는 플레이팅 직후의 일차 세포(primary cells)의 예를 보여줍니다.분주 후 20시간이 지나면 대부분의 세포는 둥글고 온전하며 서로 잘 분리된 상태입니다. 일차 세포들은 이미 클러스터를 형성하며, 이 단계에서 가지 모양의 형태를 가진 근육을 확인할 수 있습니다. 이 단계의 대비 영상에서 5일 동안 배양한 일차 세포들은 신경 돌기, 신경 클러스터 및 근육이 나타나 훨씬 더 분화된 모습을 보입니다.이 예시들에서는 DMF2-GAL4, D42G4 및 UAS-mito-GFP 트랜스제닉을 보유한 배아로부터 일차 세포를 분리하였으며, 여기서 DMF2-GAL4와 D42G4는 각각 근육과 운동 신경세포에서 mito-GFP의 발현을 유도합니다. 세포는 LAC 또는 inflated를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA로 처리되었습니다. 이 형광 이미지는 LAC를 표적으로 하는 대조군 이중 가닥 RNA가 transfection된 배양물에서 GFP를 발현하는 분화된 일차 근육과 신경세포를 모두 보여주며, 흰색 화살표는 신경 돌기를, 화살표 머리는 가지 모양의 근육 구조를 가리킵니다. 분화된 근육을 Phalloidin으로 염색했을 때, 절반 이상의 근육이 가지 모양의 구조를 보였으며 나머지는 둥글게 뭉친 형태를 보였습니다.병합된 이미지에서 근육은 노란색으로, 신경 구조는 녹색으로 염색되었습니다. 이 형광 이미지는 inflated를 표적으로 하는 이중 가닥 RNA가 포함된 배양액 내에서 GFP를 발현하고 있는 분화된 일차 근육과 뉴런을 모두 보여주며, phin 염색으로 시각화했을 때 흰색 화살표는 신경 돌기를, 화살표 머리는 근육을 가리킵니다. 가지 모양의 근육이 일부 존재하는 야생형 대조군과 달리, 이 병합된 이미지에서는 모든 근육이 둥글게 뭉쳐 있으며, 근육은 노란색으로, 신경 구조는 녹색으로 염색되어 있습니다.이중 가닥 RNA를 처리한 이 배양물에서는 둥글게 말린 근육 형태만 관찰될 수 있음에 유의하십시오. 신경 돌기는 야생형 대조군과 유사해 보이지만, 이 이미지들은 anti drosophila titan을 이용해 빨간색으로, actin을 표지하는 Phin을 이용해 녹색으로 형광 염색한 일차 근육 세포를 보여줍니다. 이 패널들은 야생형 대조군 근육을 보여주며, 이들은 sarcomere가 단축된 근육으로 발달한 RNAi 처리 근육 세포를 나타냅니다.이 절차를 수행할 때는 실험 전반에 걸쳐 비교 가능한 결과를 얻기 위해 프로토콜을 일관되게 따르는 것이 중요합니다. 숙련된 후 적절하게 수행한다면 이 기술은 2~4시간 이내에 완료할 수 있습니다.

primary-cell-cultures-from-drosophila-gastrula-embryos

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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