기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

본 실험의 전반적인 목표는 2차원 및 3차원 배양 환경의 세포에 기계적 자극을 주기 위한 장치를 미세 가공하는 것입니다. 이는 다층 샌드위치 몰딩 및 적층 기술을 사용하여 수직으로 작동하는 마이크로 포스트 어레이를 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 수직 작동 마이크로 포스트 어레이를 수정하여 배양 필름을 신장시킴으로써, 필름 위에서 배양되는 세포에 정밀하게 제어된 변형(strain)을 가합니다.

또는, 세포에 기계적 자극을 주기 위해 마이크로 패턴화된 생체 재료 구조물을 압축하도록 어레이를 수정할 수 있습니다. 3차원 하이드로겔 어레이에서 배양한 결과, 형광 기준 마커의 이미지 분석을 통해 어레이 전체에 걸쳐 다양한 2차원 에코 이축 및 3차원 압축 변형이 동시에 적용됨을 확인할 수 있었습니다. 안녕하세요, 토론토 대학교 기계 및 산업 공학과와 생체 재료 및 의생명 공학 연구소의 Craig Simmons 및 U Sun 교수 연구실 소속 Chris Mariahs입니다.

오늘은 세포에 기계적 자극을 주는 데 사용되는 마이크로 장치를 제작하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 통해 인비트로(in vitro) 배양 환경에서 세포가 다양한 기계적 힘에 어떻게 반응하는지 연구하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.

샌드위치 몰드 제작 과정은 SU-8 마스터 위의 미경화 poly dimethyl siloxane 또는 PDMS 위에 오버헤드 투명 필름을 배치하는 것으로 시작됩니다. 이 샌드위치 구조를 폼 글라스와 금속 스택 사이에 넣고 오븐에서 압축 상태로 경화시킵니다. 마지막으로 스택을 분해하고 투명 필름을 벗겨내면 패턴이 형성된 PDMS 층이 남게 됩니다.

이 공정을 시작하려면 PDMS, 모노머 및 가교제를 충분히 혼합하십시오. 표준 10:1 비율로, 경화되지 않은 PDMS 혼합물 3 mL를 미리 제작된 SU-8 마스터 위에 도포하고 진공 챔버에서 폴리머를 탈기하십시오. 그런 다음 폼 패드와 SU-8 마스터를 플렉시글라스 베이스 플레이트 위에 배치하십시오.

잉크젯 투명 필름의 매끄러운 면을 경화되지 않은 PDMS 위에 조심스럽게 내려놓으며, 이때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 투명 필름 위에 Siloized 유리 슬라이드를 배치하고, 그 위에 두 번째 폼 패드와 플렉시글라스 상판을 올립니다. C-클램프를 사용하여 이 샌드위치 구조를 함께 고정하십시오.

PDMS 샌드위치를 80 °C 오븐에서 최소 4시간 동안 경화시킵니다. 경화가 완료되면 샌드위치를 오븐에서 꺼내 식힙니다. 충분히 식으면 클램프를 제거하고 샌드위치를 분해합니다.

투명 필름을 SU-8 마스터에서 조심스럽게 벗겨내어 패턴이 형성된 PDMS 필름을 유지합니다. 패턴 필름의 가장자리를 다듬어 과잉 PDMS를 제거하고, 사용 전까지 먼지가 없는 환경에 패턴 층을 보관하십시오. 이 프로토콜의 다음 부분에서는 수직으로 작동하는 포스트의 미세 가공 어레이 제작 과정을 다룹니다.

마이크로 포스트 어레이를 제작하기 위해서는 다층 제작 공정이 필요합니다. 가장 아래쪽의 패턴화된 PDMS 층은 샌드위치 몰드 제작 방식으로 준비합니다. 본 실험에서는 직경 600에서 1,200 µm 범위의 원형 패턴이 사용되었습니다.

PDMS 층을 깨끗한 유리 슬라이드로 전사하기 위해, 코로나 방전 장치를 사용하여 PDMS와 유리 표면을 산소 플라스마로 처리하십시오. 그 다음 두 표면을 서로 접촉시킵니다. 접합 과정을 완료하기 위해 적층된 시료를 80 °C의 핫플레이트 위에 10분 동안 두십시오.

투명 필름을 벗겨내어 폐기합니다. 이 과정은 패턴화된 PDMS 필름이 단단한 기판에서 분리되지 않도록 하여 개별 층의 수축을 방지합니다. 두 번째 샌드위치 성형 층은 원하는 다이아프램 및 포스트 구조의 음각 복제 몰드로 형성됩니다.

본 시연에서는 이 층을 형성하기 위해 직경 500 µm의 원형 기둥을 사용하였습니다. 먼저, 양면테이프를 사용하여 음각 복제 몰드를 유리 슬라이드에 임시로 부착하고, 진공 데시케이터 내에서 경화되지 않은 PDMS를 샌드위치 몰드 층 위에 도포합니다. 가스를 제거한 후 1000 rpm으로 45초 동안 스핀 코팅하여 60 µm 두께의 구동 다이아프램을 생성합니다. 스핀 코팅된 PDMS 층을 80 °C에서 약 20분 동안, 또는 PDMS가 끈적거리지만 만졌을 때 영구적으로 변형되지 않을 때까지 부분 경화시킵니다. 부분 경화된 PDMS 층에서 유리 슬라이드와 양면테이프를 제거하고 투명 필름을 사용하여 이를 한 쌍의 유리 핸들링 슬라이드에 부착한 후 플라스마 처리를 합니다.

부분 경화된 PDMS를 처리한 후, PDMS를 뒤집어 맞춤 제작된 정렬기에 배치합니다. 정렬기는 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 진공 척으로 구성됩니다. 다음으로 첫 번째 PDMS 층을 플라스마 처리한 후, 진공 척 아래의 회전 스테이지 위에 배치합니다.

아바타 12배 줌 머신 비전 시스템을 사용하여 두 층 사이의 정렬 상태를 관찰하십시오. 매니퓰레이터를 사용하여 층을 정렬하고 조심스럽게 접촉시키십시오. 손가락으로 가볍게 압력을 가해 층들을 서로 부착시키십시오.

그런 다음 정렬기에서 샌드위치를 꺼냅니다. 유리 핸들링 슬라이드를 제거하고 층들이 서로 완전히 밀착되었는지 확인합니다. 80 °C 오븐에서 30분 동안 추가로 경화시킵니다.

30분 후, 투명하고 실로나이즈(siloized) 처리된 복제 PDMS 몰드를 장치에서 떼어내어 폐기합니다. 그 다음, 변형되는 2차원 기판 위에서 배양된 세포 실험을 수행하기 위해 장치를 80 °C에서 최소 4시간 동안 완전히 경화시킵니다. 마이크로 액추에이터 어레이는 세 번째 PDMS 층을 장치에 접합하여 수정합니다.

세 번째 PDMS 층은 두 개의 층으로 구성된 구조입니다. 아래쪽 원은 구동 마이크로 포스트 하단의 구동 캐비티 크기와 일치합니다. 위쪽 원의 직경은 로딩 포스트의 직경보다 100 microns 더 큽니다.

200 micron 너비의 미세 채널이 이러한 특징부들을 연결 영역에 연결하며, 로딩 포스트와 배양 필름을 윤활하는 데 사용됩니다. 2D 배양을 위해 장치를 수정하려면, 먼저 서면 프로토콜에 설명된 대로 커넥터를 제작하여 장치에 접합하십시오. 그런 다음 투명 필름의 매끄러운 면 위에 10 to 15 micron 두께의 PDMS 층을 스핀 코팅하여 경화시킵니다.

80°C에서 최소 4시간 동안 얇은 PDMS 필름을 처리합니다. 다음 단계는 액추에이터에 진공을 가하여 PDMS 층을 장치에 접합하는 것입니다. 이를 수행하기 위해.

먼저, 액추에이터에 저진공을 가해 플라스마 처리 및 본딩된 포스트 배열을 낮춥니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 액추에이팅 마이크로 장치에 PDMS 필름을 스핀 코팅하면, 포스트와 배양 필름이 짧은 시간 동안 친수성을 유지하게 됩니다. 그런 다음 윤활제 주사기를 장치에 연결하고 윤활 채널을 90% glycerol 탈이온수 용액으로 채웁니다.

윤활 외에도, 이 제형은 PDMS의 친수성을 영구적으로 유지하여 마찰 계수를 감소시킵니다. 장치를 40 °C의 핫플레이트 위에 놓고 채널에 윤활제를 계속 주입하여 압력을 약간 상승시킵니다. 몇 분 후면 공기 방울이 PDMS를 통해 확산되어 모든 표면이 윤활됩니다.

마지막 단계로, 메스를 사용하여 포스트를 고정하던 음압을 제거합니다. 얇은 PDMS 필름 주변을 절개합니다. 장치 플라즈마 결합 부위에서 투명 백킹 필름을 조심스럽게 벗겨냅니다.

장치 배양 영역 주변에 손으로 자른 PDMS 가스켓을 배치합니다. 장치를 70% ethanol에 5분 동안 담가 멸균한 후, 생물안전작업대(BSC) 내에서 살균 UV 램프로 45분 동안 처리합니다. 표면을 플라스마 처리하고 100 µg/mL collagen과 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 인큐베이션합니다.

하룻밤 동안 배양한 후, 장치를 멸균 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 세척하고 cm²당 10,000~15,000개의 세포를 파종합니다. 표준 세포 배양 프로토콜에 따라, 마이크로 액추에이터 어레이를 수정하여 3차원 광패턴화된 하이드로겔 구조체에서 배양된 세포 실험을 수행할 수 있습니다. 먼저, 다층 PDMS 기반 플랫폼을 제작합니다.

기저 플랫폼을 meth로 덮은 후, 관련 유리 커버슬립 하이드로젤 전구체 용액을 주입합니다. 그 다음 광중합 가능한 생체 재료를 어레이 형태로 미세 패턴화하고 남은 전구체 용액을 씻어냅니다. 이렇게 제작된 수직 작동 로딩 포스트 어레이는 3차원 생체 재료에서 배양된 세포에 압축 기계적 힘을 가하는 데 사용할 수 있으며, 포스트 주변 영역을 스카치 테이프로 마스킹한 후 PDS 2010 lab COTER two 시스템을 사용하여 장치를 파릴렌 C로 코팅합니다.

이는 바이오 소재 시스템의 중합 역학을 개선합니다. 코팅이 완료되면 코팅 시스템에서 장치를 꺼내 스카치테이프를 떼어내어, 포스트 위에 파릴렌 C(parylene C)의 정합 층이 남도록 합니다. 그 다음, 95% 에탄올에 3-트리메톡시프로필 메타크릴레이트(3-trimethoxyphenyl methacrylate)를 2% v/v 농도로 용해한 용액에 2분 동안 침지하여 ACRL 유리 커버슬립을 메틸화합니다.

커버를 헹굽니다. 100% ethanol에 담근 후 100 °C에서 가열하여 표면에 메타크릴레이트 그룹이 남도록 합니다. 200 micron 두께의 PDMS 스페이서를 성형합니다.

페트리 접시 내부에 필름을 깔고 작은 구역으로 자릅니다. 이 작은 구역 네 곳을 MEA 관련 커버 슬립의 가장자리를 따라 플라스마 본딩합니다. 그다음, Lene C가 코팅된 장치의 PDMS 영역에 맞춰 해당 공간들을 플라스마 본딩합니다.

마지막으로 장치를 70% ethanol로 세척하고 생물 안전 작업대 내에서 살균제 또는 UV 광선에 45분 동안 노출시켜 멸균합니다. 세포가 함유된 PEG 하이드로젤을 장치 내에 포토리소그래피 방식으로 패턴화합니다. 서면 프로토콜에 기술된 대로 전구체와 광개시제 용액을 준비하고, 이를 충분히 혼합하여 광개시제 농도가 0.4% w/v인 용액을 얻습니다.

혼합물을 0.45 micron 시린지 필터로 여과하여 멸균하고 입자성 물질을 제거합니다. 트립신을 처리한 얼음 상태의 세포 배양물을 사용하여, 최종 희망 세포 농도의 2배가 되도록 배양액 내에 세포 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 세포 현탁액과 여과된 하이드로젤 전구체 광개시제 용액을 1:1 비율로 혼합합니다. 25 gauge 긴 바늘을 사용하여 용액을 마이크로 디바이스 내로 주입합니다.

장치 내부에 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오. 인쇄된 투명 마스크를 장치 표면의 정렬 마크에 맞춥니다. 장치 표면에서 365 nanometer 파장의 UV 광량이 17.5 milliwatt per square centimeter가 되도록 UV 조사 시스템을 설정하십시오.

마스크를 통해 하이드로겔을 195초 동안 조사합니다. 중합되지 않은 하이드로겔 전구체 용액을 PBS로 씻어내고, PBS를 배양액으로 교체한 뒤 로딩 포스트를 작동시켜 하이드로겔 구조체를 압축합니다. 여기 2D 기계적 자극 배양을 위해 완성된 샘플 장치가 나타나 있습니다.

작동 압력 전달 채널을 표시하기 위해 빨간색 염료가 사용되었으며, 윤활 채널의 변형 특성 분석을 표시하기 위해 파란색 염료 D가 사용되었습니다. 기판 위 형광 비드의 이동을 추적함으로써 인가된 변형장을 결정하는 실험을 수행할 수 있습니다. 빨간색 점은 비드의 변형 전 위치를 나타내며, 녹색 점은 변형 후 위치를 나타냅니다.

녹색 염료를 사용하여 작동 압력 채널을 표시한 3차원 압축 실험용 샘플 장치를 여기서 볼 수 있습니다. 마이크로 포스트 어레이의 평면도에서는 포스트 상단에 패턴화된 하이드로젤 구조체를 확인할 수 있으며, 하이드로젤 구조체 내 형광 비드의 포스트 측면 재구성 이미지를 통해 휴지 상태 및 55 kPa 작동 압력 하에서의 변형 특성 분석 과정을 3차원 배양 시스템에서 보여줍니다.

지금까지 2차원 또는 3차원 배양 시스템에서 세포를 기계적으로 자극하는 데 사용되는 장치를 제작하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 장치를 가능한 한 깨끗하고 먼지가 없도록 유지하고, 특히 정렬 단계에서 인내심을 갖는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모든 과정을 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.