Name: 항원 특정 VIVO에서 죽이는 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 학습하세요 생체 내 CD8+ T 세포의 세포독성 기능을 평가하는 CFSE 기반 킬링 분석법을. 이 프로토콜은 항원 특이적 면역 반응의 질적 측정을 가능하게 합니다.

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나는 면역 assays 및 마우스 처리 나를 소개하는 비앙카 Mothé, 칼라 Oseroff 및 마리 - 프랑스 DelGuercio 감사하고 싶습니다. GA 분배기의 연구실에서 작업이 NIH 그랜트 1 RO1 - AI - 073558, GLRCE 부여 1 - U54 - AI - 057153 및 바드 미국 3829-06에 의해 후원됩니다.

1. 예방 접종의 대상 - 특정 효과기 CTLs을 도출하는 것은 (주 0) <ol><li> 대상 시스템 : 시작하기 전에, 특정 이펙터에 따라 결정합니다. 생체내 CTL 분석의 고전이 예제에서, 우리는 특정한 CD8 + T 세포를 이끌어내는 수있는 정화 펩타이드 예방 접종을 사용합니다. 대상 시스템 : 동일한 펩타이드는 특정 이펙터를 작성, syngeneic 대상 세포를 펄스하는 데 사용됩니다. 또는 특정 effectors와 목표를 얻기 위해 전체 병원균이나 단백질을 사용하도록 선택할 수 있습니다. </li><li> 주사의 불임을 보장하기 위해 biosafety 후드의 작업 표면 안으로 오염을 제거하다. 먼저 두 ML 튜브에 포함된 PBS / 마우스 100 μL의 10 % DMSO에 펩타이드를 정화 50 μg을 배치하여 펩타이드 예방 접종을 준비합니다. 다음 혼합을 위해 1mm 구슬로 최대 0.2 ML 마크 매우 추운 불완전 프로 인드의 도움이되는의 동일한 금액을 추가합니다. 이 시점에서 사출까지 얼음에 immunogen 보관하십시오. Parafilm과 보안 덮개. </li><li> 즉시 혼합 후 얼음 다시 감광 유제를 삽입, 3 분 동안 감광 유제를 섞어 최대 RPM을 설정 구슬 때리는을 사용합니다. 결과 유제 일관성에 마요네즈와 유사해야합니다. 유제 4에 앉아 ° C 밤새 어떤 분리가 명시된 경우에는 시간이 허용하는가 (최대 주), 더 혼합하는 경우. 허용 </li><li> 모든 구슬을 끌어하지 않도록주의하고 유제를 잡아 1 ML의 주사기와 20 게이지 바늘 20.5을 사용하여 (구슬이 바늘의 측정보다 클 수 있지만, 여전히 인식해야합니다.) </li><li> 꼬리의 기지에 피하 주입을위한 보안 마우스. 우리는 안전에 대한 수정 플라스틱 50 ML 원뿔 관을 사용하여 부드럽게 주사 마우스를 고정. 유제의 0.2 ML로 마우스를 주사. </li></ol> 2. 수확 대상 셀 (주 8) <ol><li> 당신은 목표 세포에 대한 순진한 syngeneic 마우스가 필요합니다. AAALAC 기준에 따라 순진한 쥐를 안락사. </li><li> 마우스 머리 또는 기타 외부 오염 물질로부터 오염의 가능성을 최소화하기 위해 70 % 에탄올을 분사하여 마우스를 소독. </li><li> 해부 가위를 사용하면 마우스의 왼쪽에있는 피부를 통해 작은 싹둑합니다. 복막 색과 내장을 밝히기 위해서 피부 플랩을 세워. </li><li> 복막을 통해 싹둑, 조심되는 근본적인 기관 중 하나를 타협하지 않습니다. 비장은 표면에 가까이 있으며 컬러 간 (어두운 빨강)과 비슷하지만 작고 모양이 더 신장 콩입니다. 감염된 마우스는 일반적으로 감염되지 않은 컨트롤보다 특히 큰 spleens을 보여줍니다. </li><li> 조심스럽게있는만큼 최대 휴대폰 번호를 복구하기 위해서는 여러 조각으로 비장을 깰하지 부드럽게하는 간병, 비장을 당겨. 즉시 얼음 준비 매체 10 MLS를 포함한 15 ML 원뿔로 비장을 놓으십시오. 나머지 생쥐를 계속합니다. </li><li> 유리 조직 분쇄기로 15 ML 원뿔 튜브 (미디어 및 비장)의 내용을 하거라. 팔 위쪽 강도 많이 사용하여 비장을 분쇄. 모든 조직은 그것의 색깔을 잃었되면 당신은 결합 조직 밖으로 모든 세포를 회수했다고 가정 수 있습니다. </li><li> 50 ML 원뿔 관에 70 μm의 셀 필터를 통해 분쇄기의 내용을 하거라. 신선한 매체와 그라인더를 씻어 셀 스트레이너를 통해 부어. </li><li> 4 원심 분리기 ° C, 7 분 동안 1,300 RPM. 뜨는을 하거라. </li><li> 7분을 위해 37 °에서 준비 lysing 시약 및 부화 10 MLS에 Resuspend. </li><li> 신선한 미디어와 원심 분리기, 상기와 같은과 50 MLS 개까지 추가할 수 있습니다. </li><li> 50 MLS 신선한 미디어 및 원심 분리기 (세척 단계) 위와 같은에서 Resuspend. * 참고 : 순수한 대상 셀 인구가받는 마우스로 전송 원하는 경우이 시점에서 당신은 특정 세포 유형에 대한 자기 세포 분리 (예 : macrophages)를 수행할 수 있습니다. 또한이 시간에 당신은 특정 세포 죽이는 그 치료의 영향을 연구하기 위해 문화에 실험적 치료를 소개 수 있습니다. </li><li> 96 잘 라운드 바텀 조직 문화 처리 플레이트에 100μL의 X 10 7 잘 따라 세포 및 플레이트 1 카운트. *이 세포 / 음의 높은 농도이지만, 분석이 간단하기 때문에, 우리가이 농도에서 세포의 생존에 손실을 본 적이있다. </li></ol> 3. 대상 세포 치료 및 라벨링 <ol><li> 펄스 적절한 세포와​​ 병원체 특정 펩타이드 또는 펩타이드없는 컨트롤과 함께 복제 : 1 μg / ML 펩타이드를 추가합니다. 1.5 시간 4 ° C에서 알을 품다. 지난 30 분 동안 37 ° C 배양기로 이동합니다. 이 시간 동안 CFSE 시약을 준비합니다. </li><li> 제조 업체 사양에 따라 CFSE을 준비하고 0.5 및 25 μm의 사이에서 작동하는 농도로 희석. "높음"농도 CFSE보다 낮은 '낮음'농도가 10X합니다. 예를 들어, [낮은] 10 MLS PBS에 0.​​5 μL CFSE를 추가하고 위해 [고급] 10 MLS PBS로 5 μL CFSE를 추가합니다. 37 따뜻한 준비 CFSE ° C 레이블링하기 전에. </li><li> 인큐베이터와 P에서 세포의 플레이트를 제거합니다실온, 7 분 동안 1,300 rpm으로 고속 원심 분리기에 ellet. 뜨는 제거 플릭. </li><li> [낮은] 또는 해당 우물 적절한 시약 200 μL를 추가하고 37 15 분 동안 품어 °에서 [고급] CFSE C. 어느 Resuspend 세포 </li><li> 실온, 7 분 동안 1,300 rpm으로 보육하고 다시 펠릿 세포 플레이트를 제거합니다. 뜨는 제거 플릭. </li><li> 37 200 μL / 잘 예열 신선한 매체와 30 분 동안 품어의 Resuspend 세포 ° C. </li><li> 실온, 7 분 동안 1,300 rpm으로 보육 및 펠릿 세포 플레이트를 제거합니다. 뜨는 제거 플릭. </li><li> 100 μL / 잘 PBS에 Resuspend 세포. </li><li> 입양 전송을위한 하나 추가 물론 [낮은] 한 레이블 셀 잘 [고등] 마우스 세포마다 표시. 주사를 발생하는 0.2 MLS에 50% 구체적인 목표 50 % 관련이없는 세포가되어야합니다. </li><li> (그림 1 참조) 데이터 분석 도중 흐름 cytometer에서 실행에 대한 비 - 전송 제어의 역할을 몇 가지로 분류 세포를 별도로 설정하는 것을 잊지 마십시오. </li></ol> 4. 입양 전송 <ol><li> AAALAC 기준에 따라 이전 펩타이드 예방 접종을 쥐 (이 프로토콜의 일부로 # 1에서) 마취. </li><li> 받는 마우스로 역 궤도 경로를 통해 표시 대상 세포의 0.2 MLS를 주사. </li><li> 받는 사람 쥐를 euthanizing 6 시간 전의 또는 기타 미리 결정된 최적의 시간을 기다리십시오. </li></ol> 5. 수확 라벨 셀 * 참고 : 5.11 통해 5.1 2.11 통해 2.1 단계와 동일합니다 단계 <ol start="12"><li> 96 자 라운드 바텀 조직 문화 처리 플레이트에 100 μL의 X 10 6 자 당 1 셀 및 플레이트 아웃 카운트. </li><li> 모든 우물을 1 % paraformaldehyde의 최종 농도 100 μL 2 % paraformaldehyde를 추가하여 회수 및 비 전송 세포를 수정. </li></ol> 6. 유동세포계측법 및 데이터 분석 <ol><li> 흐름 cytometer에 샘플을 실행하고 데이터를 분석할 수 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 결과 히스토그램에 떨어지 에피토프 특정 피크가 특정 세포 죽이는 (그림 1)의 지표이다. 특정 세포 용해의 실제 가치를 결정하기 위해 다음과 같은 방정식을 (표 1 적용)를 사용 : 비율 = 관련성이 비율 : 에피토프 특정 비율 ([낮은] 최대 : [고등] 피크), 퍼센트 특정 용해 = [1 - (비 전송 제어 비율 / 실험 비율)] X 100 <img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. BALB / C 마우스 splenocytes를 발견 했어요. 숫자 CFSE 프로필은 높거나 낮은 CFSE의 표현형의 세포의 비율을 나타냅니다. A) 컨트롤을 비 - 양도. [낮은] CFSE의 봉우리가없는 펩타이드와 펄스 목표를 대표하는 동안 모든 [고급] CFSE의 봉우리는 에피토프 특정 타겟 세포를 나타냅니다. B) CFSE 라벨이 세포는 PBS 예방 접종을받는 마우스 (컨트롤)에서 복구. C) 두 개의 다른 펩타이드 특정받는 마우스에서 발견한 CFSE 라벨 세포는 감소 에피토프 특정 봉우리를 적어 둡니다. <img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 분석 데이터의 그래픽 표현. 쓰리 데이터 요소는 마우스의 각 그룹, PBS, 펩타이드 및 펩타이드 B.에 대한 표시 <table border="1"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> CFSE HIGH %의 에피토프는 펄스 </td><td> 엉뚱 CFSE LOW % </td><td> 비율 낮음 : 높음 </td><td> 퍼센트 에피토프 특정 죽이는 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 42.8 </td><td> 57.2 </td><td> 1.34 </td><td> 16.97 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 43.1 </td><td> 56.9 </td><td> 1.32 </td><td> 15.94 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 44.3 </td><td> 55.7 </td><td> 1.26 </td><td> 11.74 </td></tr><tr><td> 펩타이드 </td><td> 39.7 </td><td> 60.3 </td><td> 1.52 </td><td> 32.56 </td></tr><tr><td> 펩타이드 </td><td> 38.6 </td><td> 61.4 </td><td> 1.59 </td><td> 35.61 </td></tr><tr><td> 펩타이드 </td><td> 40.6 </td><td> 59.4 </td><td> 1.46 </td><td> 29.99 </td></tr><tr><td> 펩타이드 B </td><td> 38.7 </td><td> 61.3 </td><td> 1.58 </td><td> 24.68 </td></tr><tr><td> 펩타이드 B </td><td> 38.5 </td><td> 61.5 </td><td> 1.60 </td><td> 25.32 </td></tr><tr><td> 펩타이드 B </td><td> 39.3 </td><td> 60.7 </td><td> 1.54 </td><td> 22.76 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS NT 제어 </td><td> 47.4 </td><td> 52.6 </td> 1.11 <td></td></tr><tr><td> 응원 NT 제어 </td><td> 49.4 </td><td> 50.6 </td><td> 1.02 </td><td></td></tr><tr><td> 펩 B NT 제어 </td><td> 45.6 </td><td> 54.4 </td><td> 1.19 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 대표 데이터의 분석. "NT"는 아닌 전송됩니다.

<ol><li>Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+epitope+escape+on+PD-1+expression+and+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection.</a> J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).</li>
<li>Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strength+of+T+cell+receptor+signal+controls+the+polarization+of+cytotoxic+machinery+to+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse.</a> Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).</li>
<li>Ingulli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+tolerance+and+immunity+in+vivo+by+CFSE-labeling+of+administered+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells.</a> Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).</li>
<li>Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discordant+Brucella+melitensis+antigens+yield+cognate+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo.</a> Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li>
<li>Weston, S. A., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+studies.+Analysis+by+flow+cytometry+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy.</a> J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).</li>
<li>Akondy, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yellow+fever+virus+vaccine+induces+a+broad+and+polyfunctional+human+memory+CD8%2B+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response.</a> J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).</li>
<li>Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+antigen-driven+responses+by+flow+cytometry%3A+monitoring+proliferation+by+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution.</a> Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).</li>
<li>Labadi, A., Balogh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+preferences+in+serosal+homing+and+distribution+of+peritoneal+B-cell+subsets+revealed+by+in+situ+CFSE+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling.</a> Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).</li>
<li>Suffner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+support+homeostatic+expansion+of+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+in+Foxp3.LuciDTR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice.</a> J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다. 동물 실험은 위스콘신 - 매디슨 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)에서 정한 지침과 규정에 따라 수행되었다.

CFSE가 자손 10,11 가운데 상대적으로 균등하게 분할하기 때문에 분석은 clonal 확장을 포함한 세포의 proliferative 용량을 조사하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 예제 tetramers 또한 CFSE 라벨과 함께있을 수 있습니다 bioluminescence 13, 귀하의 가정에 따라 더 적절한 수 방법을 추적 기타 조직이있다하지만, 휴대 마이 그 레이션 6,12를 조사하기 위해 CFSE 라벨을 사용하는 것도 가능합니다. PE뿐 아니라 작동하지 않을 수 있습니다 동안 표면 마커에 대한 공동 얼룩 싶으면 너무, 흐름 cytometer에 여러 채널로를 통해 해당 CFSE의 스며들에 유의하는 것이 중요합니다, PeCy7는 형광단의 좋은 선택이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>1 mm 유리 비즈</td><td>Biospec Products</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 세포 스트레이너</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Adjulite 불완전 프로인트&amp;rsquo;s 보조제</td><td>Pacific Immunology</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-077</td><td></td></tr><tr><td>FC 500 유세포 분석기</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Kontes 유리 조직 분쇄기</td><td>Kontes Corp</td><td>885300-0015</td><td></td></tr><tr><td>Mini Beadbeater</td><td>Biospec Products</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PharmLyse 용해 시약</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant CFSE 키트</td><td>Invitrogen</td><td>V12883</td><td></td></tr></tbody></table>

항원 특정 vivo에서</emcfse 라벨 대상 세포를 사용하여> 죽이는 분석

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein 디아 세 테이트 succinimidyl 에스테르 (CFSE)를 쉽고 빠르게 생체내 수사에 대한 관심의 세포 인구를 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 이 라벨은 고전적인 증식 및 마이 그 레이션을 공부하기 위해 사용되었습니다. 여기서 제시하는 방법, 우리는 에피토프 특정 CFSE 표시 대상 세포 4-6의 생존과 살인 볼 입양 전송 후 일정을 단축했습니다. 그들의 수량이 오해 할 수 있으므로 CD8 + T 세포 클론의 특정 살인의 수준은 응답의 품질을 나타낼 수 있습니다. CD8 + T 특정 세포가 시토킨 생산 및 살인 7,8의 감소와 함께 시간이 지남에 따라 기능 소진 될 수 있습니다. 또한, 특정 CD8 + T 세포 클론은 TCR의 specificities 9 각기 다른뿐만 아니라 다른 사람으로 죽일 수 없습니다. 효과적인 세포 매개 내성 (CMI)의 경우, 항원은 T 세포 응답의 충분한 숫자뿐만 아니라 생산 파악뿐만 아니라, 강력한 기능 responding T 세포를해야합니다. 여기 BALB / C 마우스의 두 펩타이드 구체적인 T 세포 클론의 비율 세포 구체적인 살인을 평가합니다.

대부분의 감염은 강력한 CTL 반응을 이끌어내는,하지만 가끔 응답 세포의 수량은 병원균 제어 상관 관계를하지 않습니다<sup&gt; 1</sup&gt;. CTL 품질 측정 중 하나는 특별히 죽이는 능력이있다<sup&gt; 2</sup&gt;. 대상 세포의 CFSE 라벨이 CTL 응답 품질을 조사하는 데 사용할 수 있습니다<em&gt; 생체내에</em<sup&gt; 3,4</sup&gt;.

항원 특정 VIVO에서</emCFSE 라벨 대상 세포를 사용하여> 죽이는 분석

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)는 생체 내(in vivo) 연구를 위해 관심 있는 세포 집단을 쉽고 빠르게 표지하는 데 사용할 수 있습니다. ...

다음 실험의 전반적인 목표는 생체 내(in vivo)에서 표적 세포를 사멸시키는 능력을 조사함으로써, 특정 항원에 반응하는 CD8 양성 T 세포의 기능적 품질을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 수용 마우스를 면역화하여 항원 특이적 작동 CD8 양성 T 세포를 유도함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 일차 표적 세포에 특이성을 부여하거나 기타 처리를 하여 특이적 작동 표적 시스템의 구축을 완료합니다.다음으로, 표적 세포를 후안구 경로의 입양 전이를 통해 수용 마우스에 투여합니다. 생체 내(in vivo)에서 작동 세포의 살상 능력을 확인하기 위해, CFSE 염색 세포의 유세포 분석을 바탕으로 작동 세포가 표적 세포를 살상했는지 여부를 나타내는 결과를 얻었습니다. 안녕하세요, 저는 Marina Ward입니다.저는 위스콘신 대학교 매디슨 캠퍼스의 Gary Splitter 교수님 연구실에 재학 중인 대학원생입니다. 이 방법은 CTL 살상 작용에 대한 통찰을 제공하며, 세포 증식 및 생존 분석에도 적용될 수 있습니다. 입양 전이(adoptive transfer) 절차의 시연은 저희 연구실의 과학자인 Dr.Jerome harms가 진행하겠습니다. 우선 전략적으로 특정 이펙터 타겟 시스템을 정의하는 것부터 시작하겠습니다.예를 들어, 고전적인 in vivo CTL 분석에서는 정제된 펩타이드 면역화를 통해 특이적 CD8 양성 T 세포를 유도하고, 동일한 펩타이드로 동종 표적 세포를 펄싱하여 특이적 표적 시스템을 구축합니다. 주입 과정의 무균 상태를 보장하기 위해 생물안전 작업대의 작업 표면을 오염 제거하십시오. 먼저 2 mL 튜브에 펩타이드를 넣어 면역화 제제를 준비하십시오.마우스당 10% DMSO/PBS에 희석된 정제 펩타이드 50 micrograms를 100 microliters에 넣어줍니다. 그다음, 혼합을 위해 1 millimeter 비드가 포함된 매우 차가운 불완전 면역 보조제(incomplete adjuvant)를 동일한 양으로 추가합니다. 튜브 뚜껑을 파라필름으로 고정하고 주사 전까지 면역원을 얼음 위에 보관합니다.비드 비터(bead beater)를 최대 분당 회전수로 설정하여 에멀션을 3분 동안 혼합한 후, 즉시 에멀션을 다시 얼음 위에 놓으십시오. 결과물로 생성된 에멀션은 마요네즈와 유사한 점도를 가져야 합니다. 에멀션을 4°C에서 하룻밤 또는 최대 일주일 동안 보관하며, 면역화 시점에 층 분리가 관찰되면 추

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

CFSE는 covalently 형광 염료, carboxyfluorescein와 긴 세포내 분자를 표시합니다. 따라서, CFSE - 표시 셀 분할 때, 그 자손 이는 세포 분열을 평가하는 데 사용할 수있는 형광의 절반 금액을 보유하고 있습니다. 이 문서는 일반적으로 CFSE와 마우스 lymphocytes를 라벨에 사용되는 절차를 설명합니다.

림프구 확산을 모니터 Carboxyfluorescein 디아 세 테이트 Succinimidyl 에스터 (CFSE)의 사용

기능 T-세포 assays에서 항원의 소스로 사용되는 인체 조직의 추출물을 준비하기위한 간단한 프로토콜은 설명되어 있습니다. 이 방법은 조직 유래 항원에 대한 T 세포 반응을 측정 할 수...

기능 Assays을위한 조직 항원의 추출

이 비디오는 세포독성 T 림프구 또는 CTL 반응에서 면역 우성을 분석하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 보여줍니다. 주입된 형광 표적 세포는 면역원성 항원결정기에 해당하는 다양한 형광을 나타냅니다. 비장 후 수집 및 분류를 통해 고강도 형광 세포가 감소하는 것으로 나타나 CTL 반응에서 면역 우세를 확인할 수 있습니다.

세포독성 T 림프구 반응에서 면역우성을 평가하기 위한 분석

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

생체 내에서 상세히 T 세포 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 면역 반응에 대한 이해의 발전을 위해 중요하다. 여기에서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 동시에&gt; 250 매개 변수를 평가하는 생체 내 T 세포의 분석에서 형광 타겟 어레이 (FTA 체결)의 사용을 설명한다.

T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용<em&gt; 생체 내</em

이 프로토콜의 목표 vivo에서 의 검출에 대 한 항 원 특정 murine 모델에서 목표 셀의 살인을 허용 하는 것입니다.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

여기에서는 종양 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 반응에서 면역 우세의 검사를 가능 하 게 하는 유 세포 분석 기반의 생체 사 멸 분석 법을 설명 한다. 이 우아한 분석을 기계 론 적 연구와 약물 효능 테스트에 사용 하는 방법의 예를 제공 합니다.

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

여기에 제시된 것은 염료 희석을 이용한 항원 단백질 또는 펩티드에 반응하여 증식CD4+ T 세포를 측정하기 위한 프로토콜이다. 이러한 분석종은 희귀 항원 특이적 T 세포에 특히 민감하며 항원 특이적 세포의 복제를 용이하게 하기 위해 변형될 수 있다.

카르복시플루아세인 수치니미딜 에스테르를 이용한 증식 인간 항원 특이적 CD4+ T 세포의 정량화

이 원고는 유세포 분석기를 사용하여 종양 세포 유래 세포밖 소포 (EVs)의 생체 내 면역원성을 평가하는 방법을 설명합니다. 치료를 받는 종양으로부터 유래된 EVs-유도된 면역원성 세포 사멸은 종양 면역감시에 특히 관련있는 것으로 보인다. 이 프로토콜은 옥살리플라틴-유도된 면역자극성 종양 EVs의 평가를 예시하지만, 다양한 설정에 적응될 수 있다.

생체 내 비장 T 세포의 유세포 분석기에 의한 종양 유래 세포밖 소포의 면역원성 스크리닝

이 프로토콜은 생세포 영상과 유세포분석을 사용하여 인간 자연 살해 세포의 자연 키메라 항원 매개 매개 항체 의존성 세포독성을 일관되게 측정하기 위한 표준화된 시험 관 내 워크플로우를 제공합니다.

키메라 항원 수용체와 치료용 항체에 의해 증강되는 NK 세포 독성을 생세포 영상 및 유동 세포분석을 이용해 정량화합니다

학습하세요 생체 내 CD8+ T 세포의 세포독성 기능을 평가하는 CFSE 기반 킬링 분석법을. 이 프로토콜은 항원 특이적 면역 반응의 질적 측정을 가능하게 합니다.

항원 특정 VIVO에서 죽이는 분석

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