항원 특정 VIVO에서 죽이는 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 생체 내(in vivo)에서 표적 세포를 사멸시키는 능력을 조사함으로써, 특정 항원에 반응하는 CD8 양성 T 세포의 기능적 품질을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 수용 마우스를 면역화하여 항원 특이적 작동 CD8 양성 T 세포를 유도함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 일차 표적 세포에 특이성을 부여하거나 기타 처리를 하여 특이적 작동 표적 시스템의 구축을 완료합니다.

다음으로, 표적 세포를 후안구 경로의 입양 전이를 통해 수용 마우스에 투여합니다. 생체 내(in vivo)에서 작동 세포의 살상 능력을 확인하기 위해, CFSE 염색 세포의 유세포 분석을 바탕으로 작동 세포가 표적 세포를 살상했는지 여부를 나타내는 결과를 얻었습니다. 안녕하세요, 저는 Marina Ward입니다.

저는 위스콘신 대학교 매디슨 캠퍼스의 Gary Splitter 교수님 연구실에 재학 중인 대학원생입니다. 이 방법은 CTL 살상 작용에 대한 통찰을 제공하며, 세포 증식 및 생존 분석에도 적용될 수 있습니다. 입양 전이(adoptive transfer) 절차의 시연은 저희 연구실의 과학자인 Dr.Jerome harms가 진행하겠습니다. 우선 전략적으로 특정 이펙터 타겟 시스템을 정의하는 것부터 시작하겠습니다.

예를 들어, 고전적인 in vivo CTL 분석에서는 정제된 펩타이드 면역화를 통해 특이적 CD8 양성 T 세포를 유도하고, 동일한 펩타이드로 동종 표적 세포를 펄싱하여 특이적 표적 시스템을 구축합니다. 주입 과정의 무균 상태를 보장하기 위해 생물안전 작업대의 작업 표면을 오염 제거하십시오. 먼저 2 mL 튜브에 펩타이드를 넣어 면역화 제제를 준비하십시오.

마우스당 10% DMSO/PBS에 희석된 정제 펩타이드 50 micrograms를 100 microliters에 넣어줍니다. 그다음, 혼합을 위해 1 millimeter 비드가 포함된 매우 차가운 불완전 면역 보조제(incomplete adjuvant)를 동일한 양으로 추가합니다. 튜브 뚜껑을 파라필름으로 고정하고 주사 전까지 면역원을 얼음 위에 보관합니다.

비드 비터(bead beater)를 최대 분당 회전수로 설정하여 에멀션을 3분 동안 혼합한 후, 즉시 에멀션을 다시 얼음 위에 놓으십시오. 결과물로 생성된 에멀션은 마요네즈와 유사한 점도를 가져야 합니다. 에멀션을 4°C에서 하룻밤 또는 최대 일주일 동안 보관하며, 면역화 시점에 층 분리가 관찰되면 추가로 혼합하십시오.

실험의 이 단계에 사용할 마우스를 식별하십시오. 1 mL 주사기와 20 gauge 바늘을 사용하여 에멀전을 흡입합니다. 이때 표적 세포를 준비하기 위해 비드(bead)가 함께 흡입되지 않도록 주의하십시오.

나이브(naive) 동종 마우스를 사용하며, A-A-A-L-A-C 승인 표준에 따라 이 나이브 마우스들을 안락사시킵니다. 마우스의 털이나 기타 외부 오염 물질로 인한 오염 가능성을 최소화하기 위해 마우스의 해당 부위에 70% ethanol을 분사합니다. 해부용 가위를 사용하여 마우스의 왼쪽 피부를 작게 절개합니다.

피부 플랩을 당겨 복막낭과 내부 장기를 노출시킵니다. 아래에 있는 장기에 손상을 주지 않도록 주의하며 복막을 절개합니다. 표면에 가깝고 진한 붉은색을 띠는 비장을 찾습니다.

비장을 조심스럽게 적출하여 즉시 얼음에 보관된 10 mL의 준비된 RPMI 배지가 들어있는 15 mL 원심분리관에 넣습니다. 나머지 마우스에 대해서도 동일하게 진행합니다. 비장과 배지를 유리 조직 균질기로 옮깁니다.

모든 조직의 색이 사라질 때까지 비장을 갈아줍니다. 균질화된 결과물을 70 micron 셀 필터를 통해 50 milliliter 원심분리 튜브에 통과시킵니다. 균질기 내부를 신선한 배지로 한 번 헹구어 필터를 통해 비장 균질액과 합친 후, 4 °C, 1,300 rpm에서 시료를 원심분리합니다.

7분 동안 상층액을 따라내어 버립니다. 세포 펠렛을 10 mL의 용해제 및 시약에 재현탁하고 37 °C에서 7분 동안 배양합니다. 신선한 배지를 사용하여 50 mL까지 채운 후, 원심분리를 통해 세포를 수확합니다.

이 세척 과정을 반복합니다. 세포 수를 측정하여 96-well 라운드 바텀 조직 배양 플레이트의 각 well에 10 million cells씩 분주합니다.

4 °C에서 1시간 30분 동안 배양합니다. 마지막 30분 동안은 37 °C 인큐베이터로 옮깁니다. 제조사의 지침에 따라 신선한 CFSE 시약을 준비하고, 최종 작동 농도가 0.5에서 25 µM 사이가 되도록 희석합니다.

농도가 10배 차이 나는 두 가지 CFSE 용액을 조제합니다. 라벨링 전, 이 저농도 및 고농도 CFSE 용액을 37°C에서 평형화합니다. 대상 세포가 담긴 96-웰 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고 원심분리를 통해 세포를 펠렛화합니다.

실온에서 플레이트를 가볍게 쳐서 상층액을 제거합니다. 세포를 200 µL의 저농도 또는 고농도 CFSE 용액에 재현탁하고 37 °C 인큐베이터에서 15분 동안 배양합니다. 실온에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 플레이트를 가볍게 쳐서 상층액을 제거합니다. 세포를 200 µL의 신선한 배지에 재현탁하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 다시 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 상층액을 버린 후 펠릿을 50 µL의 PBS에 재현탁합니다. 라벨링된 세포의 일부를 데이터 분석 시 비전이 컨트롤(non-transfer controls)용으로, 그리고 입양 전이(adoptive transfer)를 위한 유세포 분석기 실행용으로 따로 보관합니다.

마우스당 저농도 CFSE 표지 세포 한 웰을 고농도 CFSE 표지 세포 한 웰에 추가합니다. 이렇게 하면 결과적으로 0.1 milliliter 내에 50%의 특이적 표적 세포와 50%의 비특이적 세포로 구성된 주입액이 됩니다. 입양 전이를 용이하게 하기 위해 펩타이드가 면역된 마우스를 마취시킨 후, 표지된 표적 세포 0.1 milliliter를 수신자의 안와 후 경로로 주입합니다.

6시간 후, 세포 수확을 위해 수용 쥐를 안락사시키고, 쥐의 비장을 적출한 후 앞서 사용한 것과 동일한 프로토콜로 세포군을 정제합니다. 표적 비장 세포를 준비할 때, 96-웰 라운드 바텀 조직 배양 플레이트의 웰당 100만 개의 세포를 분주하고, 회수된 비전이 세포를 파라포름알데히드로 고정한 후, 유세포 분석기로 샘플을 분석하여 데이터를 도출합니다. 세포 특이적 살상 결과의 전형적인 제시 방식은 두 가지 형태로 묘사됩니다.

fax 히스토그램에서 에피토프 특이적 피크의 감소와 그 계산값이 세포 특이적 용해를 나타냅니다. 여기서 숫자는 PBS를 면역한 수용체 마우스에서 회수된 CFSE 표지 비이식 대조군 세포와 두 종류의 서로 다른 펩타이드 특이적 수용체 마우스에서 회수된 CFSE 표지 세포 중 high 또는 low CFSE 표현형 세포의 백분율을 나타냅니다. 세포 특이적 살상을 나타내는 에피토프 특이적 피크의 감소에 유의하십시오.

또는, 각 마우스 그룹(PBS, 펩타이드 A, 펩타이드 B)에 대한 세포 특이적 용해도를 나타내기 위해 결과를 그래프로 제시할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 마우스를 이용한 자신만의 in vivo CTL 살상 분석법을 개발하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.