Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - _{L - 호모 시스테인 결합 단백질}

다음 실험의 전반적인 목표는 캡처 화합물 질량 분석법(capture compound mass spectrometry, CCMS)을 통해 복잡한 단백질 혼합물로부터 메틸전이효소(methyl transferases)의 프로파일을 분석하는 것입니다. 메틸전이효소는 세 가지 기능을 가진 캡처 화합물에 의해 기능적으로 분리되며, 이 화합물은 일반적인 메틸전이효소 생성물 억제제인 S adenyl, L homocystine short, SAH를 선택성 기능으로 포함합니다. 여기에 제시된 워크플로에서 기능적 분리는 두 번째 단계로, 세포 용해물과 캡처 화합물을 함께 배양하여 캡처 화합물의 선택성 기능과 표적 단백질 사이에 가역적 결합 평형을 형성함으로써 이루어집니다. 이후 혼합물은 캡처 박스 내에서 UV 광선으로 조사됩니다.

조사된 광선은 포집 화합물의 반응성 기능을 활성화합니다. 이는 포집 화합물과 표적 단백질 사이에 비가역적인 공유 가교 형성을 유도합니다. 다음으로, 포집 화합물 단백질 접합체를 용해물로부터 분리하고 충분히 세척한 뒤 고체 지지체에서 해리시키고, 트립신 처리하여 질량 분석법을 통한 펩타이드 분석으로 포집된 단백질을 식별합니다. 그 결과, 포집 화합물 질량 분석법을 기반으로 Escherichia coli 세포 용해물로부터 메틸전이효소를 간단하게 분리하고 식별할 수 있음을 보여줍니다.

안녕하세요, 생화학과의 CaTECH 연구소 소속 Thomas Lentz입니다. 저 또한 CapTech 생화학 연구소의 Mathias Rega입니다. 분석 부서의 Mer Linsky입니다.

오늘은 균질화된 세포 용해물에서 메틸 전이효소를 온비드(on-bead) 캡처링하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 소분자-단백질 상호작용을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이 절차를 통해 키나아제, 메탈로프로테이나제, GTPase 등과 같은 기능적 서브 프로테옴을 분리하고 식별할 수 있습니다.

우리는 또한 이 접근 방식을 약물 표적 발굴에 사용합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 캡처 실험을 위해 snail L homocystine caper kit short SAH caper kit가 사용됩니다.

본 키트에는 SAH 캡처 화합물과 경쟁물질인 유리 SAH가 포함되어 있습니다. 또한, 직경 1µm의 스트렙타비딘 코팅 자성 비드, 5배 농축 캡처 버퍼 및 5배 농축 세척 버퍼가 포함되어 있습니다. 200µL PCR 튜브 스트립의 각 튜브에 10mg/mL 스트렙타비딘 코팅 자성 비드 50µL와 100µM SAH 캡처 화합물 25µL를 혼합하고 격렬하게 섞어 SAH 캡처 화합물이 부착된 스트렙타비딘 코팅 자성 비드를 준비하십시오.

결과물인 현탁액을 상온에서 2분 동안 흔들어 캡처 화합물의 biotin 모이어티가 자성 비드 표면의 streptavidin에 결합하도록 합니다. 그 후 capra mag을 사용하여 PCR 튜브 캡에 capra 비드를 자기적으로 수집하고, 상층액을 제거한 다음 결과물인 capra 비드를 200 µL의 1배 세척 버퍼에 재현탁합니다. 다시 PCR 튜브 스트립 캡에 capra 비드를 자기적으로 수집하고 상층액을 제거합니다.

그 다음, 비드의 건조를 방지하기 위해 튜브를 닫습니다. 이어서 캡처 분석 및 경쟁 대조군을 포함한 필수 대조군을 위한 새 튜브에 라벨을 붙입니다. 풀다운 경쟁 대조군과 풀다운 및 결합 캡처 분석 풀다운 튜브를 준비하여, 온도를 0~4°C로 조절하는 캡라(capra) 박스에 라벨이 붙은 튜브들을 넣습니다.

그 다음 최종 반응 부피가 100 µL가 되도록 계산된 양의 milli Q water와 5배 농축 캡처 버퍼 20 µL를 피펫으로 분주합니다. 각 반응당 E. coli DH5α 전세포 용해물(whole cell lysate) 0.26 mg을 각 튜브에 넣고 부드럽게 뒤집어 섞어줍니다. 경쟁 대조군 및 풀다운(pull down) 경쟁 대조군의 경우, 10 mM SAH 경쟁자 용액 20 µL를 추가합니다.

캡처 분석 및 캡처 분석과 풀다운의 결합 실험의 경우, SAH 용액 대신 20 µL의 milli Q water를 첨가하고, 모든 튜브를 반전시켜 부드럽게 혼합한 후 짧게 원심분리합니다. 그런 다음 각 용해물에 capra beads를 현탁시키고 4 °C에서 3시간 동안 배양합니다. SAH 결합 단백질이 SAH 캡처 화합물의 SAH 선택성 기능에 가역적으로 결합할 수 있도록 회전을 통해 비드를 현탁 상태로 유지합니다.

배양 후, 짧게 원심분리하고 현탁액을 capra box에 넣습니다. 튜브를 분리하여 pull down 및 pull down의 경쟁 대조군용 현탁액을 얼음 위에 꺼내둡니다. 나머지 현탁액은 캡처 분석 경쟁 대조군 및 결합 캡처 분석을 위해 그대로 둡니다.

그 다음, 샘플을 냉각하는 동시에 UV 광선을 조사하기 위해 capra box의 손잡이를 아래로 당깁니다. 0~4°C 사이의 온도에서 밀폐된 튜브 상태로 2.5분 간격으로 총 30분 동안 샘플을 조사합니다. 이 과정을 통해 SAH 캡처 화합물의 반응성 작용기와 SAH 결합 단백질 사이에 공유 결합 가교가 형성됩니다.

2.5분 간격의 조사를 마친 현탁액을 Capra 박스에서 꺼냅니다. 얼음물에서 약 15초 동안 냉각시킨 후, 여러 번 뒤집어 섞어줍니다. 그 다음, 샘플을 짧게 원심분리하여 뚜껑에 남아 있는 현탁액을 제거하고 다음 조사 간격을 위해 다시 Capra 박스에 넣습니다.

다음으로, 풀다운(pull down) 및 풀다운 경쟁 대조군을 위한 현탁액을 포함시키고, 경쟁 대조군용 캡처 분석(capture assay)에는 10 millimolar SAH 용액 20 microliters를 첨가하며, 풀다운 경쟁 대조군 및 캡처 분석과 풀다운 결합 분석에는 milli Q water 20 microliters를 첨가합니다. 캡처 분석에서는 비즈와 현탁액이 섞이도록 회전시키며 4 degrees Celsius에서 10분 동안 현탁액을 배양합니다. 이렇게 하면 SAH 캡처 화합물에 교차 결합되지 않은 SAH 결합 단백질들이 대체됩니다.

배양 후, capra mag을 사용하여 현탁액에서 capra beads를 수집하고 상층액은 제거합니다. 그런 다음 1배 세척 완충액 200 µL에 beads를 다시 현탁하고 자기 분리를 통해 beads를 수집함으로써 세척합니다. 이 세척 과정을 5회 반복한 후, milli Q water 200 µL에 다시 현탁하고 자기 분리를 통해 beads를 수집합니다.

비드를 200 µL의 60% acetonitrile에 재현탁하고 capri mag을 사용하여 비드를 수집합니다. 이 acetonitrile 세척 과정을 2회 반복합니다. 비드가 쉽게 재현탁되지 않을 경우 초음파 처리를 수행합니다.

다음으로, 갓 제조한 60% acetonitrile, 0.2% Trifluoroacetic acid 200 µL를 첨가하고 실온에서 강하게 흔들어주며 10분간 배양하여 비드로부터 포획된 단백질을 용출시킵니다. 비드가 쉽게 재부유되지 않을 경우 다시 초음파 처리를 수행하십시오.

마지막으로 비드를 자성으로 수집하여 제거합니다. 튜브 스트립을 개별 튜브로 분리하고, 뚜껑에 구멍을 낸 후 상층액을 완전히 건조될 때까지 증발시킵니다. 이 단계에서 원심 증발기를 사용하며, 포집된 단백질은 SDS page를 수행하거나 다음 섹션에서 설명하는 질량 분석법으로 처리할 수 있습니다. 자성 비드에서 분리되어 포집된 단백질을 10 µL의 50 mM 탄산수소암모늄에 녹입니다.

샘플을 초음파 세척기에 넣은 다음, 샘플을 볼텍싱합니다. 이어서 1 mM HCl에 녹인 0.5 µg/µL trypsin 1 µL를 첨가하고 짧게 원심 분리한 뒤, 용액을 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 제조사의 지침에 따라 ProxiOn Biosystems의 20 µL 스테이지 팁과 같은 C 18 재료를 사용하여 캡처된 단백질의 트립신 소화 펩타이드가 포함된 용액을 탈염합니다. 50% methanol, 5% formic acid 10 µL로 펩타이드를 두 번 용출합니다.

그런 다음 원심 증발기를 사용하여 용매를 증발시켜 탈염된 펩타이드를 건조시킨 후, 초음파 세척기에서의 초음파 처리와 볼텍싱을 통해 0.1% formic acid 5.5 µL에 펩타이드를 용해시킵니다. 마지막으로 서면 프로토콜에 설명된 대로 탠덤 질량 분석법과 결합된 나노 흐름 액체 크로마토그래피를 사용하여 샘플을 분석합니다. MS/MS 데이터를 분석하려면 BioWorks 브라우저 버전 3.3 0.1에 구현된 SEQUEST, SPone 및 Scaffold 3 소프트웨어에 구현된 X!Tandem과 같은 단백질 식별 알고리즘을 사용하십시오.

자동 데이터베이스 검색은 최신 범용 단백질 자원 지식 베이스를 대상으로 수행됩니다. 조사 대상 생물체의 Swiss Pro 데이터베이스는 www x pai. org에서 제공됩니다.

본 연구에 사용된 데이터베이스는 coli 균주 K12 release 57 dash 11입니다. Seaquest를 사용하여 5 ppm의 전구체 허용 오차, 1 amu의 단편 이온 허용 오차, 그리고 최대 2회의 미세절단을 허용하는 full trypsin 특이성을 설정하여 자동 데이터베이스 검색을 수행하였습니다.

serine, threonine, tyrosine의 인산화, methionine의 산화, asparagine과 glutamine의 탈아미드화, lysine과 serine의 아세틸화, lysine의 포르밀화, 그리고 arginine, lysine, serine, threonine, asparagine의 메틸화가 가능하도록 가변 수식(variable modifications)을 설정하십시오. 데이터베이스 검색 시 고정 수식(fixed modifications)은 사용하지 마십시오. Seaquest에서 생성된 DTA 또는 SRF 파일을 Scaffold 3 소프트웨어로 로드하십시오. 이 소프트웨어는 Seaquest와 X!Tandem 데이터베이스 검색 결과를 결합하여 펩타이드 할당 및 단백질 식별의 확률 평가를 수행합니다. Scaffold는 여러 샘플에서 얻은 단백질 목록을 쉽게 비교, 검증 및 시각화하는 데 유용합니다.

Scaffold three 소프트웨어 내의 파라미터를 단백질 식별만 허용하고 개별 히트로 보고하도록 설정하십시오. 히트에는 확률 검증을 통과한 판별 펩타이드가 최소 하나 이상 포함되도록 설정하십시오. Scaffold three 분석에 따라, Scaffold 내의 peptide prophet 알고리즘에 의해 지정된 확률이 95% 이상인 펩타이드만 고려하십시오.

단백질 프로핏(protein profit) 알고리즘에 따라, 다중 펩타이드 할당에 대한 단백질 식별 확률을 95% 이상으로 설정한 소프트웨어는 세 가지였습니다. 단일 펩타이드 단백질 식별의 경우, 단백질 확률을 임의로 50% 이상으로 설정하고 해당 펩타이드를 수동으로 검토하였습니다. MS/MS 분석만으로는 구분이 불가능하고 유사한 펩타이드로 구성된 MS/MS 스펙트라 단백질들은 절약의 원칙(principles of parsimony)을 충족하기 위해 소프트웨어에 의해 그룹화되었습니다.

펩타이드 식별의 추정 위양성률(false discovery rate)은 역단백질 데이터베이스(reversed protein database) 접근법을 사용하여 결정할 수 있으며, 1% 미만이어야 합니다. 캡처 분석에서는 캡처된 온전한 단백질의 SDS page 및 실버 염색 분석 결과가 나타나 있습니다. 광반응 기능에 의해 캡처 화합물이 공유 결합된 단백질만 분리되도록 하기 위해 UV 조사 단계 이후에 과량의 유리 SAH를 첨가했습니다.

Ingel Triptych Digest 후 절단된 단백질 겔 밴드로부터 MS를 통해 단백질을 확인하였습니다. 비교를 위해, 가장 왼쪽 레인은 캡처 분석에서 단백질을 분리한 대상인 e coli DH five alpha 전세포 용해물의 0.25%를 보여줍니다. 이 비교는 캡처 화합물 기술을 통해 달성한 샘플 복잡성의 극적인 감소를 보여줍니다.

대조군은 겔의 중앙에서 실행되었으며, 여기에는 분석의 경쟁 대조군이 포함됩니다. 이 대조군은 UVI 조사 단계 이전에 경쟁제로 과량의 유리 SAH를 포함하여, SAH 선택성 기능을 통해 단백질이 SAH 캡처 화합물에 결합하는 것을 방지합니다. 경쟁 대조군은 SAH에 결합하지 않는 비특이적으로 캡처된 단백질을 판별하는 데 필수적입니다.

따라서 캡처 분석에서는 확인되었으나 경쟁 대조군에서는 확인되지 않은 단백질들이 특이적인 SAH 결합 단백질입니다. 또한 UV 조사와 유리 SAH 첨가를 모두 수행하지 않은 풀다운 실험 결과도 포함되어 있습니다.

풀다운(pull down)의 경쟁 대조군 또한 조사하지 않으나, 경쟁자로 SAH를 포함합니다. 마지막으로, 캡처 분석과 풀다운을 결합한 실험은 UV 조사를 수행하며, 워크플로우 동안 자유 SAH를 추가하지 않았습니다. 광가교 결합(photo cross linking)이 실험의 수율과 민감도를 높인다는 점이 분명하며, SDS page를 통해 포획된 온전한 단백질을 분석하는 대신 과량의 자유 SAH를 사용하는 경쟁 실험을 통해 특이성을 용이하게 검증할 수 있습니다.

Triptych Digest 이후, 포획된 단백질 혼합물 전체를 탠덤 질량 분석법과 결합된 나노 흐름 액체 크로마토그래피를 통해 한 번에 분석할 수 있습니다. 이것이 실제 CCMS 접근 방식이며, SDS page 분석보다 훨씬 더 민감합니다. CCMS 실험을 통해 확인된 METHYLTRANSFERASES 및 기타 선택된 단백질들이 이 표에 나와 있습니다.

제시된 수치는 단백질당 가중치를 적용하지 않은 펩타이드 스펙트럼 수를 나타내며, 풀다운(pull down) 방식에 비해 캡처 분석(capture assay)에서 훨씬 더 많은 메틸전이효소 및 기타 SAH 결합 단백질이 식별되었습니다. 또한, 경쟁 대조군(competition control)에서 이러한 단백질들이 거의 완전히 결여된 것을 통해 SAH 특이성이 입증되었습니다. CCMS 런(run)에서 식별된 총 단백질 수와 런 간의 단백질 중복도가 표로 정리되었습니다.

최소 두 개의 펩타이드로 확인된 단백질의 수는 괄호 안에 표시되어 있습니다. 비교 실험 간에 주로 비특이적 단백질들에서 나타나는 높은 단백질 중첩도, 특히 여기서 최소 두 개의 펩타이드로 견고하게 확인된 단백질들에서의 중첩도를 통해 이 방법의 높은 재현성을 추론할 수 있습니다. 벤 다이어그램은 캡처 분석, 경쟁 대조군 및 풀다운에서 확인된 단백질의 중첩도를 나타내며, 확인된 모든 단백질의 수는 오른쪽에 표시되고 최소 두 개의 펩타이드로 확인된 단백질의 수는 괄호 안에 표시되어 있으며, 메틸 전이효소 및 SAH 뉴클레아제의 수는 왼쪽에 표시되어 있습니다.

지금까지 포획 화합물 질량 분석법(capture compound mass spectrometry, CCMS)을 통해 E. coli 세포 용해물 또는 다른 조직 및 세포 용해물로부터 메틸 전이효소나 기타 기능적 서브 프로테옴(sub proteomes)을 분리하고 식별하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 샘플을 냉각 상태로 유지하고 포획 화합물이 가시광선에 장시간 노출되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 또한, 자성 비드에서 포획된 단백질을 분리하는 데 사용되는 TFA 아세토니트릴 용액을 새로 조제하고, 먼지나 실험자로부터 유래된 케라틴과 같은 외부 단백질원에 의해 실험이 오염되지 않도록 해야 합니다.

또한, 비정형 구성(offbeat configuration) 즉, 사전 포획 화합물과 단백질 및 용액 사이에서 광가교 구성이 일어나는 방식과 현재 설명한 정형 구성(on beat configuration) 중 어느 것이 더 효율적인지는 구체적인 설정에 따라 달라진다는 점을 확인했습니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.