동적 클램프 기법을 사용 랫 Midbrain Dopaminergic 뉴런에서 NMDA 수용체의 전도의 응용

신경과학자들은 뇌의 뉴런들이 어떻게 소통하는지 조사함으로써 뇌의 기능을 연구합니다. 여기서는 다이내믹 클램프(dynamic clamp) 기술을 사용하여 실험적으로 제어된 전도도를 적용함으로써 단일 뉴런의 전기적 활동 변화를 유도합니다. 먼저 얇게 절편화된 뇌 슬라이스를 제작하여 인공 뇌척수액이 채워진 배양 챔버에 보관합니다.

그 다음 슬라이스를 패치 클램프 기록 장치로 옮깁니다. 뉴런을 선택한 후, 기록 증폭기에 연결된 다이내믹 클램프 컴퓨터를 사용하여 기록 전극으로 패치합니다. 세포 내에 NMDA 수용체 전도도를 적용합니다.

결과 기록은 활동 전위의 버스트(burst)를 보여주며, 이는 NMDA 수용체의 활성화가 도파민성 뉴런이 버스트를 생성할 수 있게 하는 하나의 세포 기전임을 시사합니다. 직접 전류 주입이나 약물 처리와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 실험적으로 정의된 수용체의 활성화가 살아있는 뉴런의 전기적 활성에 미치는 영향을 정밀하게 결정할 수 있다는 점입니다. 마취된 Bragg dolly 쥐의 뇌를 빠르게 적출한 후, 진동 마이크로톰을 사용하여 240 µm 두께의 수평 뇌 절편을 제작합니다.

절편을 자르는 대로 전이 피펫을 사용하여 기록 실험을 수행할 때까지 인공 뇌척수액이 채워진 32 °C 배양 챔버에 넣습니다. 세포 내 기록 장치는 경사 조명 대비 영상을 위해 설정된 대물렌즈가 장착된 현미경, 모니터, perfusion 시스템, multi clamp 700 B 증폭기, 아날로그-디지털 변환기, 마이크로 조절기 및 헤드 스테이지로 구성됩니다. Mac Pro 컴퓨터에서 데이터 획득 소프트웨어인 Axo Graph X와 multi clamp commander 소프트웨어를 실행합니다. 세포 내 기록 장치 및 Mac Pro 컴퓨터 옆에는 실시간 Linux가 실행되는 Sun Microsystems 컴퓨터와 아날로그-디지털 변환기가 있으며, 이는 다이내믹 클램프 기술에 사용됩니다.

세포 내 기록 장치는 약 35°C의 인공 뇌척수액을 관류시켜야 합니다. 기록할 슬라이스가 수평으로 준비된 경우, 전송 피펫을 사용하여 이를 인공 뇌척수액이 담긴 페트리 접시에 옮기고, 절단 도구를 사용하여 슬라이스를 중앙선에 따라 이등분합니다. 그다음, 전기생리학적 기록을 수행하기 위해 피펫을 사용하여 슬라이스를 세포 내 기록 장치로 옮깁니다.

40 x 대물렌즈를 사용하여 여기에서 표적 뉴런을 시각화하면, 개별 흑질 도파민성 뉴런이 관찰됩니다. 두 개의 가지돌기가 뻗어 나온 타원형의 세포체를 확인하십시오. 전자식 P 97 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 팁 저항이 4에서 10 mega ohms인 전극을 제작합니다.

다음으로, 마이크로필 시린지 바늘을 사용하여 전극에 내부 용액을 채웁니다. 짧은 튜브로 반세포(half cell)와 연결된 시린지를 사용하여, 앰플리파이어의 헤드 스테이지에 연결된 반세포에 채워진 전극을 삽입합니다. 기록 전극에 소량의 양압을 가합니다.

시각적 가이드에 따라 전극을 표적 뉴런 위로 내립니다. 세포 표면에 딤플(dimple)이 형성된 것이 관찰될 것입니다. 소량의 음압을 가하여 원하는 뉴런에 기가실(giga seal)을 형성합니다.

입으로 흡입하여 씰(seal)을 파괴합니다. 이로써 전체 세포 기록(whole cell recording) 상태가 됩니다. 씰이 파괴된 후, multi clamp commander 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 앰플리파이어를 전류를 주입할 수 없는 전류 클램프(current clamp) 모드로 설정합니다.

이 세포에 NMDA 전도도를 적용하려면, 먼저 다이내믹 클램프 컴퓨터에서 RTXI 소프트웨어를 실행하십시오. 그런 다음 NMDA 수용체가 포함된 사용자 정의 모델을 메모리에 로드합니다. 모델이 RTX 메모리에 로드되면, G-N-M-D-A를 0 nS로 설정한 상태에서 여기 표시된 식을 사용하여 세포에 주입할 전류를 실시간으로 계산하겠습니다.

기본적으로 Semens에서 MG는 마그네슘 농도를 의미합니다. E-N-M-D-A는 0 mV로 설정된 NMDA 수용체의 역전 전위이며, VM은 증폭기에서 측정된 세포의 막 전위(mV)입니다. 이제 표준 BNC 케이블을 사용하여 다이내믹 클램프 컴퓨터의 출력을 아날로그-디지털 변환기가 연결된 증폭기의 커맨드 입력단에 연결하십시오.

Multi Clamp Commander 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 앰플리파이어를 표준 전류 클램프 모드 ic로 설정합니다. RTXI는 Axo Graph X 데이터 수집 소프트웨어의 전압 신호로부터 원하는 컨덕턴스 GFT를 수신하도록 설정되었습니다. 여기서는 세포에 1초 동안 40 nano Siemens 컨덕턴스 스텝을 가하는 간단한 AXO Graph X 프로토콜을 실행합니다.

본 동영상에서 설명한 설정을 사용하여 전도도 단계(conductance step)에 반응하여 일련의 활동 전위를 유발하였으며, 중뇌 흑질 치밀부(substantial nire pars compacta)에 있는 도파민 작동성 뉴런으로부터 전체 세포 체세포 기록(whole cell somatic recording)을 수행하였습니다. 도파민 작동성 세포는 일반적으로 페이스메이커와 유사한 패턴으로 낮은 빈도로 자발적으로 발화합니다. 다이내믹 클램프를 이용해 NMDA 수용체 전도도를 위상성으로 적용함으로써 일련의 활동 전위를 유발할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 분리된 뇌 절편 내의 살아있는 도파민성 뉴런에 NMDA 전도도를 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 그러나 이 기술은 표준 전기생리학적 기법으로 기록 가능한 모든 세포 유형에 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 다이내믹 클램프(dynamic clamp)를 확장하여 광범위한 수용체 유형의 전기적 효과를 모사할 수 있습니다.

이 영상이 다이내믹 클램프(dynamic clamp) 기술이 무엇인지, 그리고 저희 실험실에서 이를 어떻게 활용하는지 보여드리는 데 유용했기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사합니다.