유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 Allele 특정 유전자 발현 분석

다음 실험의 전반적인 목적은 질환과 연관된 것과 같은 특정 DNA 변이가 특정 유전자의 발현에 영향을 미치는지 테스트하는 것입니다. 이는 해당 변이와 관심 유전자의 코딩 snip 모두에 대해 이형접합체인 세포주를 선택함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 세포에서 DNA와 RNA를 추출한 후 이를 대립유전자 특이적 1차 신장 반응(allele specific primary extension reaction)의 템플릿으로 사용합니다.

다음으로, 두 대립유전자의 상대적 함량을 정량화하기 위해 질량 분석법으로 1차 연장 산물을 분석합니다. 이를 통해 질량 분석법을 이용한 정량적 대립유전자 특이적 측정 결과, 질병과 관련된 원래의 DNA 변이가 유전자 발현의 차이와도 연관되어 있는지 확인하는 결과를 얻습니다. 이 기술의 주요 장점은 루시페라제 리포터 유전자 분석과 달리 분자적 조작이 필요하지 않으며, 내인성 유전자 발현 수준을 측정할 수 있다는 점입니다.

또한, 두 대립유전자 간의 발현 수준을 내부 대조 방식으로 비교할 수 있어 실험적 변동성을 일부 제거할 수 있습니다. 이 방법은 유전적 연관성의 기초가 되는 분자적 기전과 같이 인간 유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 저희는 세 개의 유전자에 걸친 유전적 연관성을 확인했으나 신호를 단일 유전자로 좁힐 수 없었을 때 이 방법의 아이디어를 처음 설정했습니다.

추가적인 유전자 매핑을 통해 수행합니다. 이 분석에 사용되는 세포는 관심 유전자를 발현해야 하며 두 가지 기본적인 유전형 요건을 충족해야 합니다. 질병과 연관된 DNA 서열과, 염색체 기원에 따라 전사체를 구분할 수 있는 DNA 마커 모두에 대해 이형접합체여야 합니다. 여기에 제시된 세포주 선택 전략에서, 삼각형으로 표시된 전사 코딩 마커에 대해 이형접합체인 세포주 A와 B를 사용합니다.

하지만, Omnicell 라인 A는 원으로 표시된 위험 DNA 변이체라고 불리는 질병 관련 DNA 서열에 대해 이형접합체입니다. 위험 변이체의 파란색 대립유전자는 더 낮은 수준의 전사와 관련이 있습니다. 공급업체의 사양에 따라 플라스크 내의 세포주 배양물을 선택한 후, 본 시연에서는 섬유아세포를 사용하겠습니다. 이 분석법은 일차 세포를 포함한 다른 세포 유형에도 동일하게 적용 가능하지만, DNA 및 RNA 추출을 위해 각각 두 개의 10 centimeter 페트리 접시를 준비하십시오.

세포의 밀도가 80% 합류도(confluence)에 도달하면, 선택한 세포 유형에 적합한 시판 키트를 포함한 표준 방법을 사용하여 DNA 및 RNA 추출을 위해 세포를 수확할 수 있습니다. 이 분석을 수행하기 전에, 각 DNA 마커에 대해 두 쌍의 PCR 프라이머를 설계합니다. 한 쌍은 게놈 DNA 증폭용으로, 다른 한 쌍은 cDNA 증폭용으로 사용합니다. 게놈 DNA 오염을 방지하기 위해 cDNA 증폭용 정방향 및 역방향 프라이머를 서로 다른 엑손(exon)에 배치하십시오. 각 세포주에 대해 100에서 500 base pairs 범위의 PCR 산물을 얻을 수 있도록 프라이머를 설계합니다. 8 μL 용량의 PCR 반응액을 준비합니다. 매회 게놈 DNA 증폭을 위한 4개의 독립적인 반응과 cDNA 증폭을 위한 4개의 독립적인 반응을 수행합니다.

PCR 반응과 관련된 마이크로 튜브에는 MLA's tack dn, NTPs 프라이머, 염화 마그네슘, 그리고 genomic DNA 또는 cDNA가 포함되어 있습니다. 각 프라이머 쌍에 최적화된 조건으로 PCR 반응을 수행하며, 사이클 횟수는 증폭의 선형 단계 내로 유지합니다. PCR 반응이 완료되면, 각 PCR 생성물에 exonuclease one과 shrimp alkaline phosphatase SAP를 첨가하고 37 °C에서 20분간 배양한 후, 85 °C에서 15분간 배양하여 PCR 프라이머와 과잉의 dNTPs를 제거합니다.

각 PCR 생성물을 384웰 플레이트에 두 번씩 점적하여, 각 샘플당 8회의 측정이 가능하도록 합니다. 기본 신장 분석(primary extension assay)을 위해 총 16개의 점적 지점을 준비합니다. 게놈 및 cDNA PCR 생성물 모두에 동일한 프라이머를 사용할 수 있도록 분석 설계 소프트웨어를 사용하여 신장 프라이머를 설계하십시오.

프라이머 길이를 14에서 18 base pairs 범위로 지정하십시오. 세 종류의 deoxy nucleotide terminator와 한 종류의 deoxy nucleotide가 적절히 혼합된 용액으로 1차 신장 반응을 수행합니다. 일반적인 1차 신장 반응은 94 °C에서 2분간 진행하는 시작 단계 이후, 94 °C에서 5초, 52 °C에서 5초, 72 °C에서 5초로 구성되는 사이클을 40회 반복하는 과정으로 이루어집니다.

마지막으로, 연장된 올리고뉴클레오타이드는 spectro reader 질량 분석기를 이용한 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry)으로 정량 분석합니다. 이 프로토콜의 핵심은 실험적 노이즈를 제어하여 아티팩트(artifact) 발생을 방지하기 위해 여러 전략을 사용하는 것입니다. 실험을 최소 3회 반복하는 것이 매우 중요합니다.

실험을 위한 최선의 대조군은 1차 신장 분석을 위한 코팅 snip 분석에 대해 이형접합체이지만, 질환 관련 대립유전자를 보유하지 않은 세포주를 사용하는 것입니다. 또한, 대체 DNA 전사 코딩 마커에 대한 분석을 설계하십시오. 이를 사용할 수 없는 경우, 1차 신장 분석을 위해 서로 다른 엑손을 타겟팅하는 대체 PCR 프라이머 쌍을 통해 추가 대조군을 제공할 수 있습니다.

내부 대조군은 정방향 및 역방향 가닥 모두에 결합하도록 설계된 연장 프라이머를 통해 제공될 수 있습니다. 질량 분석 트레이스 예시와 함께 대립유전자 특이적 발현 분석의 예가 여기에 제시되어 있습니다. 이 그림은 네 가지 서로 다른 템플릿에서 수행된 네 가지 대립유전자 특이적 1차 연장 생성물 분석 결과를 보여줍니다.

상위 두 그래프는 전사 코딩 다형성에 대해 모두 이형접합체인 두 가지 서로 다른 세포주의 게놈 DNA 분석 결과를 나타냅니다. 하지만 세포주 A만이 위험 DNA 변이에 대해 이형접합체입니다. 하위 두 그래프는 실험적 아티팩트의 결과로 동일한 세포주에서 생성된 cDNA 분석을 통해 얻은 결과를 나타냅니다.

게놈 분석에서도 첫 번째 피크는 항상 두 번째 피크보다 높게 나타납니다. 따라서 게놈 분석 결과는 cDNA 데이터를 정규화하는 데 사용됩니다. 통계 분석은 mass array 타입 소프트웨어 내에서 모든 ELO 타이핑 리포트를 추출하여 수행합니다.

본 보고서는 피크 면적에 관한 데이터를 제공하며, 여기서는 코딩 단일염기다형성(snip)에 대해 이형접합성인 두 세포주(세포 A와 세포 B)의 예시를 보여줍니다. 이 중 세포 A만 질환 관련 마커에 대해 이형접합성을 나타냅니다. 회색으로 표시된 열은 소프트웨어에서 직접 생성된 것이며, 녹색으로 표시된 열은 각 세포에 대해 수동으로 도출된 값입니다. cDNA와 게놈 DNA 모두에 대해 8회의 측정이 수행되었습니다.

소프트웨어가 각 스펙트럼 피크의 아래 면적을 계산하며, 이는 두 대립유전자 각각의 상대적 양을 나타냅니다. 대립유전자 비율은 각 cDNA 및 게놈 샘플에 대해 대립유전자 1의 면적을 대립유전자 2의 면적으로 나누어 계산합니다. 8회 측정값 전체에 대해 평균과 표준 오차를 산출합니다.

0.1보다 큰 높은 표준 오차는 측정값이 일관되지 않음을 나타내며, 이는 무시해야 합니다. 마지막으로, 대립유전자 특이적 발현에 차이가 없을 때 예상되는 비율인 1에서의 편차를 추정하기 위해, gDNA 평균 비율을 사용하여 cDNA 평균 비율을 정규화합니다. 정규화된 비율이 세포 A에서는 1과 다르지만 세포 B에서는 1에 가까운 경우, 해당 데이터는 세포주 A가 두 번째 피크로 측정된 대립유전자와 위상이 일치하는 DNA 변이를 가지고 있으며, 이것이 분석 대상 유전자의 발현을 감소시킴을 시사합니다.

세포주 B는 매우 편리한 음성 대조군을 제공합니다. 이 절차를 시도하는 것은 유용한 유전 변이를 정의하고 적절한 실험 대조군을 설정하는 데 매우 중요합니다. 이 절차 외에도 하플로타입 특이적 크로마틴 면역침강법과 같은 다른 방법들을 사용할 수 있으며, 이는 전사 마커가 없어 대립유전자 특이적 유전자 발현을 분석할 수 없는 유전 변이가 어디에 존재하는지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 됩니다.

이 영상을 시청한 후에는 대립유전자 특이적 방식으로 RNA를 분석하는 방법과 이를 통해 유전적으로 중요한 기능적 변이를 이해하는 방법에 대해 충분히 파악하시게 될 것입니다.