유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 Allele 특정 유전자 발현 분석

다음 실험의 전반적인 목적은 질병과 관련된 것과 같은 특정 DNA 변이가 특정 유전자의 발현에 영향을 미치는지 테스트하는 것입니다. 이는 해당 변이와 관심 유전자의 코딩 스닙(coding snip) 모두에 대해 이형 접합성(heterozygous)을 보이는 세포주를 선택함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 세포에서 DNA와 RNA를 추출한 후 이를 대립유전자 특이적 일차 신장 반응(allele specific primary extension reaction)의 템플릿으로 사용합니다.

다음으로, 두 대립유전자의 상대적 풍부도를 정량화하기 위해 1차 연장 생성물을 질량 분석법으로 분석합니다. 질량 분석법을 통한 정량적 대립유전자 특이적 측정을 통해, 질병과 관련된 원래의 DNA 변이가 유전자 발현의 차이와도 관련이 있는지 여부를 보여주는 결과를 얻습니다. 이 기술의 주요 장점은 루시페라제 리포터 유전자 분석과 달리 분자적 조작이 필요하지 않으며, 내인성 유전자 발현 수준을 측정할 수 있다는 점입니다.

또한, 내부 대조 방식을 통해 두 대립유전자 간의 발현 수준을 비교할 수 있어 실험적 변동성을 일부 제거할 수 있습니다. 이 방법은 유전적 연관성의 기저에 있는 분자적 메커니즘과 같이 인간 유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 우리는 세 개의 유전자에 걸친 유전적 연관성을 확인했으나 신호를 단일 유전자로 좁힐 수 없었을 때 이 방법의 아이디어를 처음 설정했습니다.

추가적인 유전자 매핑을 통해 수행합니다. 이 분석에 사용되는 세포는 관심 유전자를 발현해야 하며, 두 가지 기본적인 유전형 요건을 충족해야 합니다. 질환과 관련된 DNA 서열과, 염색체 기원에 따라 전사체를 구별할 수 있는 DNA 마커 모두에 대해 이형 접합체여야 합니다. 여기에 제시된 세포주 선택 전략에서, 세포주 A와 B는 삼각형으로 표시된 전사 가능한 코딩 마커에 대해 이형 접합체입니다.

하지만 Omnicell 라인 A는 원으로 표시된 질병 관련 DNA 서열인 위험 DNA 변이에 대해 이형접합체입니다. 위험 변이의 파란색 대립유전자는 낮은 수준의 전사와 관련이 있습니다. 공급업체의 사양에 따라 플라스크 내의 세포 라인 배양물을 선택한 후, 본 시연에서는 섬유아세포를 사용하겠습니다. 이 분석법은 일차 세포를 포함한 다른 세포 유형에도 동일하게 적용 가능하지만, DNA 및 RNA 추출을 위해 각각 두 개의 10cm 페트리 접시를 준비하십시오.

세포의 밀도가 80% confluence에 도달하면, 선택한 세포 유형에 적합한 시판 키트를 포함한 표준 방법을 사용하여 DNA 및 RNA 추출을 위해 세포를 수확할 수 있습니다. 이 분석을 수행하기 전에 각 DNA 마커에 대해 두 쌍의 PCR 프라이머를 설계하십시오. 한 쌍은 게놈 DNA 증폭용이고 다른 한 쌍은 cDNA 증폭용입니다. 게놈 오염을 방지하기 위해 cDNA 증폭용 정방향 및 역방향 프라이머를 서로 다른 엑손에 배치하십시오. 각 세포주에 대해 100~500 base pairs 길이 범위의 PCR 산물을 얻을 수 있도록 프라이머를 설계하십시오. 8 µL의 PCR 반응액을 준비하십시오. 매회 게놈 DNA 증폭을 위한 4개의 독립적인 반응과 cDNA 증폭을 위한 4개의 독립적인 반응을 수행합니다.

PCR 반응과 관련된 마이크로 튜브에는 MLA의 tack dn, NTPs 프라이머, 염화마그네슘, 그리고 게놈 DNA 또는 cDNA가 포함되어 있습니다. 각 프라이머 쌍에 최적화된 조건에서 PCR 반응을 수행하며, 사이클 횟수를 증폭의 선형 단계 내로 유지합니다. PCR 반응이 완료되면, 각 PCR 생성물에 exonuclease one과 shrimp alkaline phosphatase (SAP)를 첨가하고 37 °C에서 20분간, 이어서 85 °C에서 15분간 배양하여 PCR 프라이머와 과잉 DNTPs를 제거합니다.

각 PCR 산물을 384-웰 플레이트에 두 번씩 점적하여, 샘플당 8회의 측정이 가능하도록 합니다. 1차 신장 분석(extension assay)을 위해 총 16개의 점적을 수행합니다. 분석 설계 소프트웨어를 사용하여 게놈 및 cDNA PCR 산물 모두에 동일한 프라이머를 사용할 수 있도록 신장 프라이머를 설계하십시오.

프라이머 길이를 14에서 18 base pairs 범위로 지정하십시오. 3종의 deoxy nucleotide terminator와 1종의 deoxy nucleotide가 포함된 적절한 혼합물을 사용하여 1차 신장 반응을 수행합니다. 일반적인 1차 신장 반응은 94 °C에서 2분간의 초기 단계를 거친 후, 94 °C에서 5초, 52 °C에서 5초, 72 °C에서 5초로 구성된 과정을 40회 반복하는 방식으로 진행됩니다.

마지막으로, 연장된 올리고뉴클레오타이드는 spectro reader 질량 분석기를 이용한 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry)으로 정량 분석합니다. 이 프로토콜의 핵심은 실험 노이즈를 제어하여 아티팩트를 배제하기 위해 여러 전략을 사용하는 것입니다. 실험을 최소 3회 반복하는 것이 매우 중요합니다.

실험을 위한 최선의 대조군은 1차 연장(primary extension)을 위한 코팅 snip 분석에 대해 이형접합(heterozygous)이지만 질병 관련 대립유전자는 보유하지 않은 세포주를 사용하는 것입니다. 또한, 대안적인 DNA 전사 코딩 마커를 위한 분석법을 설계하십시오. 이를 사용할 수 없는 경우, 1차 연장 분석을 위해 서로 다른 엑손(exon)을 표적으로 하는 추가적인 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 추가 대조군을 제공할 수 있습니다.

내부 대조군은 정방향 및 역방향 가닥 모두에 결합하는 연장 프라이머의 설계를 통해 제공될 수 있습니다. 대립유전자 특이적 발현 분석의 예가 질량 분석 트레이스 예시와 함께 여기에 제시되어 있습니다. 이 그림은 네 가지 서로 다른 템플릿에서 수행된 네 가지 대립유전자 특이적 1차 연장 생성물의 분석 결과를 보여줍니다.

상단 두 그래프는 전사되는 코딩 다형성에 대해 모두 이형접합체인 두 가지 서로 다른 세포주의 게놈 DNA 분석 결과를 나타냅니다. 그러나 세포주 A만이 위험 DNA 변이에 대해 이형접합체입니다. 하단 두 그래프는 실험적 아티팩트의 결과로 동일한 세포주에서 생성된 cDNA 분석을 통해 얻은 결과를 나타냅니다.

유전체 분석에서도 첫 번째 피크는 항상 두 번째 피크보다 높게 나타납니다. 따라서 유전체 분석 결과를 사용하여 cDNA 데이터를 정규화합니다. 통계 분석은 mass array 유형 소프트웨어 내에서 모든 ELO 타이핑 리포트를 추출하여 수행합니다.

이 보고서는 피크 면적에 관한 데이터를 제공하며, 여기서는 코딩 단일염기다형성(snip)에 대해 이형접합성을 띠는 두 세포주인 세포 A와 세포 B의 예시를 보여줍니다. 다만, 세포 A만이 질환 관련 마커에 대해 이형접합성을 나타냅니다. 회색으로 표시된 열은 소프트웨어에 의해 직접 생성된 것이며, 녹색으로 표시된 열은 각 세포에 대해 수동으로 도출된 것입니다. cDNA와 게놈 DNA 모두에 대해 8회의 측정이 이루어졌습니다.

소프트웨어가 각 스펙트럼 피크 아래의 면적을 계산하며, 이는 두 대립유전자의 각각의 풍부도를 나타냅니다. 대립유전자 비율은 각 cDNA 및 게놈 샘플에 대해 대립유전자 1의 면적을 대립유전자 2의 면적으로 나누어 계산합니다. 8회 측정값 전체에 대해 평균과 표준오차를 계산합니다.

0.1보다 큰 높은 표준 오차는 측정값이 일관되지 않음을 나타내며, 이러한 결과는 무시해야 합니다. 마지막으로, 대립유전자 특이적 발현에 차이가 없을 때 기대되는 비율인 1에서의 편차를 추정하기 위해, genomic DNA 평균 비율을 사용하여 cDNA 평균 비율을 정규화합니다. 정규화된 비율이 세포 A에서는 1과 다르지만 세포 B에서는 1에 가까운 경우, 해당 데이터는 세포주 A가 두 번째 피크로 측정된 대립유전자와 위상이 일치하는 DNA 변이를 보유하고 있으며, 이것이 분석 대상 유전자의 발현을 감소시킨다는 것을 시사합니다.

세포주 B는 매우 편리한 음성 대조군을 제공합니다. 유용한 유전 변이체와 적절한 실험 대조군을 정의하기 위해서는 이 절차를 시도하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차 외에도, 대립유전자 특이적 유전자 발현을 분석하기 위해 사용할 전사 마커가 없는 유전 변이체의 위치와 같은 질문에 답하는 데 도움이 되는 haplotype 특이적 염색질 면역침전법과 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 대립유전자 특이적 방식으로 RNA를 분석하는 방법과 이를 통해 유전적으로 중요한 기능적 변이를 이해하는 방법에 대해 충분히 파악하시게 될 것입니다.