Name: 유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 Allele 특정 유전자 발현 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 학습하세요 MALDI-TOF 질량분석법을 이용한 대립유전자 특이적 유전자 발현 분석 방법으로, 질병 관련 DNA 변이가 유전자 발현에 미치는 영향을 정량적으로 측정하는 기술입니다. 이 방법은 내인성 유전자 발현 수준을 직접 측정하며 실험 변이성을 최소화합니다.

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이 작품은 부여를 통해 웰컴 트러스트에 의해 투자되었다 APM [076566/Z/05/Z] JCK [074318]와 인간 유전학에 대한 웰컴 트러스트 센터의 핵심 수상 [075491/Z/04].

1) 세포 배양 <ol><li> 관심있는 유전자를 표현 셀 유형을 선택합니다. </li><li> 두 DNA 위험 변종과 관심의 유전자 (그림 1) 이내 베꼈는데 코딩 다형성에 대한 heterozygous 세포 라인을 선택합니다. </li><li> 문화 공급자의 사양에 각각 DNA와 RNA 추출 2 X 10cm 배양 접시를 준비 따라 선택한 셀 라인. </li><li> 세포는 80 % 합류는 아래에 설명된 절차를 수행하거나 상용 키트를 사용하거나 수확 세포에 대한 절차를 시작하고 DNA와 RNA를 분리 도달했을 때. </li></ol> 2) DNA 추출 <ol><li> 접시에서 미디어를 제거, PBS로 세척하고 용해 용액 (0.6 % SDS, 100 MM NaCl, 50 MM 트리스, 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 50 μg / ML RNase A)의 접시 500 μL에 추가할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 20 분 동안 부드럽게 접시를 록. </li><li> ° C 야간 37 microcentrifuge 관과 부화에 세포 lysate을 다쳤어요. </li><li> 100 μg / ML의 최종 농도 proteinase K를 추가하고 37 ° C 하룻밤에 품어. </li><li> 페놀 - 클로로포름 산도 8, 반복의 동일한 볼륨으로 DNA를 추출 후, 클로로포름 / isoamyl 알콜의 동일한 볼륨 압축을 풉니다. </li><li> 10분의 1 일 제 3 M NaCl 및 100 % 에탄올 2.5 볼륨으로 DNA를 침전. </li><li> 4 30 분 13,000 rpm으로 회전 후 5 분 얼음에두고 ° C. </li><li> 70 % 에탄올로 DNA를 와시, 공기 건조하고 TE 200 μL에 resuspend 수 있습니다. </li><li> 65 품어 ° C 후 10 분 및 실온에서 2 일간 휴가. </li><li> 4 스토어에서 -20 ° C 또는 장기 ° C. </li></ol> 3) RNA 추출 <ol><li> 접시에서 미디어를 제거, PBS로 씻어 상온에서 10 분 TRIzol과 부화 1 ML를 추가합니다. </li><li> 스크 레이프 세포는 microcentrifuge 관에 몇 번, 전송 피펫 5 분 알을 품다. </li><li> 4 10,000 RPM 10 분 스핀 ° C. </li><li> 새로운 튜브에 뜨는를 전송하고 클로로포름 200 μL를 추가합니다. </li><li> 흔들 4 10,000 RPM 10 분 스핀 ° C. </li><li> 새로운 튜브에 수성 단계를 전송하고 70 % 에탄올의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 1 또는 2 (볼륨에 따라 다름) 최대 속도 30 초에 대한 RNeasy 컬럼과 스핀에 대한 솔루션을로드합니다. </li><li> 여기에서 RNeasy 키트 (Qiagen)의 지침을 따르십시오. </li></ol> 4) 핵산 샘플 준비 <ol><li> NanoDrop 분광 (써모 과학)을 사용하여 DNA와 RNA의 농도를 정량. </li><li> 제조 업체의 지시에 따라 임의의 decamers과 어깨 III 거꾸로 Transcriptase (Invitrogen)를 사용하는 RNA의 cDNA 500-1000 NG에서 준비합니다. </li></ol> 5) PCR 및 프리머 확장 분석 <ol><li> 각각의 DNA 마커에 대한 PCR의 primers, 한 게놈 DNA의 증폭을위한 쌍 및 cDNA 증폭에 대한 다른 쌍 (그림 2)의 디자인 이쌍합니다. 앞으로 장소와 게놈 오염을 피하기 위해 다른 exons의 cDNA 증폭을위한 프라이머를 역방향. 100-500 BP의 길이의 범위에 PCR 제품을 얻기 위해 디자인 입문서. </li><li> 0.5 U Immolase DNA 형성 촉매 (Bioline) 0.8 MM의 dNTPs, 2 MM MgCl 2, 0.2 M 각각의 프라이머와 cDNA 또는 DNA 중 20 NG 포함하여 10 μL PCR 반응을 준비합니다. 네 독립 반응의 각 샘플을 확대. </li><li> 증폭의 선형 사이클 단계에 번호를 유지 각 프라이머 쌍을위한 최적의 조건에서 PCR 반응을 실행합니다. </li><li> exonuclease와 PCR 제품을 잠복기로 여분의 PCR 프라이머 및 dNTPs를 제거 I 및 37 새우 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (SAP) · 20 분 C. </li><li> 384 잘 접시에 두 번 각 PCR 제품을 스팟, 8 측정 각 샘플에 대해 사용할 수 있도록. </li><li> 같은 뇌관은 게놈과 cDNA PCR 두 제품에 사용할 수 있도록 분석 설계 (Sequenom) 소프트웨어와 확장 뇌관을 디자인합니다. 3ddNTPs의 조합 (그림 2)을 포함하여 14-18 BP 및 확장 믹스의 범위에서 뇌관의 길이를 지정합니다. </li><li> 제조 업체의 지시에 따라 MassARRAY 시스템 (Sequenom)를 사용하여 뇌관 확장 반응과 MALDI-TOF/MS 분석을 수행합니다. </li><li> 전형적인 프라이머 확장 반응 94에 시작하는 단계 ° C 2 분, 5 초, 52도 ° C 5 S와 72는 ° C를위한 94 ° C의 40주기에 의해 다음 5 S. 위해 포함 </li><li> 프라이머 확장 제품은 SpectroCLEAN 수지로 청소하고 SpectroPOINT nanolitre 자동 지급기에서 microarray (칩)에 전송됩니다. </li><li> 확장 oligonucleotides는 SpectroREADER 질량 분석기를 사용하여 든 - TOF에 의해 계량입니다. </li></ol> 6) 통계 분석 <ol><li> 실험의 일반적인 품질 MassARRAY의 Typer 소프트웨어 MALDI-TOF/MS 결과를 확인합니다. </li><li> 정상 영역 데이터를 포함하는 Allelotyping 보고서를 추출합니다. </li><li> 각 스펙트럼은을 계산을 위해allele 1 allele 2 (최대 면적 비율)의 피크 영역 사이의 비율. </li><li> 각 cDNA 샘플의 경우 8 측정에 걸쳐, Excel에서 해당 함수를 사용, 최대 면적 비율 의미 및 표준 편차를 도출. </li><li> 게놈 DNA를 8 측정에서 동일한 의미 피크 면적 비율을 도출. </li><li> 예상 1시 1분 비율에 편차를 평가하기 위해 게놈 의미의 비율에 의해 cDNA 의미 비율을 나누십시오. </li></ol> 7) 실험 컨트롤 <ol><li> 실험 유물을 배제하기 위해 적어도 세 번 실험을 반복합니다. </li><li> 추가 DNA 마커에 대해 가능하다면, 디자인 assays. </li><li> 순방향 및 역방향 모두 가닥을 어닐링 여러 PCR 프라이머 쌍 및 확장 primers을 디자인합니다. </li><li> 때마다 DNA 마커에 대한 heterozygous 있지만 표현형과 관련된 DNA 위험 변종 다니지 말고 부정적인 제어 세포 라인을 최대한 시험 (그림 1과 그림 3.) </li></ol> 8) 대표 결과 allele 특정 표현 분석의 예제는 질량 분석계의 흔적을 예제와 함께 그림 3에 표시됩니다. 그림은 4 가지 템플릿에서 실시 4 allele 특정 뇌관 확장 제품의 분석 결과를 보여줍니다. 상단 그래프 베꼈는데 코딩 다형성에 대한 heterozygous 모두 두 가지 세포 라인의 게놈 DNA의 분석에서 얻은 결과를 나타냅니다. 단, 셀 라인은 위험 유전자 변형 (그림 1) heterozygous입니다. 하단 그래프는 동일한 세포 라인에서 생성된 cDNA의 분석에서 얻은 결과를 나타냅니다. 실험 유물의 결과로 첫 번째 정상은 항상도 게놈 분석에서 두 번째로 정상보다 높은 것입니다. 따라서 게놈 분석의 결과는 cDNA 데이터를 정상화하는 데 사용됩니다. 정규화 후, allele 비율이 세포 라인 1에서 크게 다른 (두 번째 정상가 다른 스펙트럼에 비해 낮은 나타나는 위치) 데이터를 그 세포 라인을 제안 B. 그것이 세포 라인에 1 매우 가까운 동안 운반 분석에서 유전자의 표현을 줄여 두 번째 정상에 의해 측정 allele와 단계에서 DNA의 변형. 셀 라인 B는 매우 편리한 부정적인 제어를 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 세포주 선택 전략. 셀 라인은 A와 B는 오직 세포 라인은 위험 유전자 변형 (동그라미)에 대한 heterozygous입니다 베꼈는데 코딩 마커 (삼각형)에 대한 heterozygous 있습니다. 위험 변종의 푸른 allele은 전사의 낮은 수준 (실제 작동 변종에 가까운 상관 관계에 직접적인 영향이나하기 때문에)를 연결됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Allele 특정 뇌관 연장 분석.이 그림은 cDNA (왼쪽)와 게놈 DNA (오른쪽) 템플릿 모두에 대해 수행 실험 절차의 업무 흐름을 보여줍니다. PCR primers (회색 사각형)를 heterozygous 코딩 다형성 (삼각형)를 증폭하도록 설계되었습니다. 게놈 오염 PCR primers가 증폭이 cDNA 템플릿에서 수행됩니다 다른 exons (하늘색 막대)에 배치 순서를 어닐링 피하기 위해. PCR 제품은 다음 다형성에 다음 기지 어닐링, 확장 프라이머와 함께 진행 프라이머 확장 반응에 대한 템플릿으로 사용되고, 세 dideoxynucleotide의 적절한 믹스 (ddNTPs)는 터미네이터 (광장) 한 deoxynucleotide (동그라미)가 확장 각각 하나 또는 두 개의 기초의 기본 이지요. 그 결과 프라이머 확장 제품 든 - TOF 질량 분광법에 의해 분리 및 부량 수 있도록 다양한 대중 있습니다. DNA 마커의 푸른 allele에 해당하는 제품의 수량은 붉은 allele 상대적으로 낮습니다. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. allele 특정 표현 분석의 결과. 그림은 게놈 DNA를 수행 분석에서 질량 분석계 결과 및 세포주의 cDNA를 표시하고 셀 라인 B (그림 1).

<ol><li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li>
<li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 방법은 사본 수준의 생체내 allele 특정 차이 평가에 의해 유전자 발현에 질병 관련 유전자 변종의 효과의 평가를 수 있습니다. 이 프로토콜의 상대적인 대본 풍부한이 든 - TOF하지만 같은 TaqMan 6,7와 같은 allele 특정 부량을 수 있도록 다른 기술에 의해 측정, 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 제한은 베꼈는데 코딩 마커의 가용성이다. 원칙에 따라 방법은 여기에 설명된하지만, polymorphisms 다른 클래스의 활용, 설명되었습니다. haploChip 분석은 transcriptional 시작하거나 II 8 효소를 RNA 특정 항체와 격리 염색질 immunoprecipitated 자료에있는 것입니다 유전자의 최종 사이트의 1킬로바이트 내에 위치한 마커를 사용하여 allele 특정 표현을 측정합니다. 템플릿 RNA 9 헤테로핵 때 또는 intronic SNPs를 사용할 수 있습니다. 특정 프로토콜은 haploChip 분석과 함께, 여기에 설명된 dyslexia에 대한 후보 유전자 (또는 읽기 장애)를 식별하기 위해 성공적으로 사용되었습니다. 처음에는 유전자 협회 연구 dyslexia 세 유전자 10 스패닝되었습니다과 관련된 DNA 순서 확인. allele 특정 유전자 발현 분석은 dyslexia - 관련 DNA 변종 표현 변동의 존재에 세 유전자 중 하나만에 대한 관찰하지만 다른 두 11 것으로 나타났다.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR international</td><td>27788.366</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Phenol: chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR international</td><td>100777C</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Immolase Taq</td><td>Bioline</td><td>BIO-21048</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNTP100A</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z</td><td></td></tr><tr><td>SpectroCLEAN resin</td><td>Sequenom</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>MassEXTEND ddNTP/dNTP mix </td><td>Sequenom</td><td></td><td>어세이 설계에 따라 다름</td></tr><tr><td>MassEXTEND thermosequenase </td><td>Sequenom</td><td>10052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;장비&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉각 마이크로원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 분광광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectroPOINT 나노리터 디스펜서</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectroREADER 질량 분석계</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 allele 특정 유전자 발현 분석

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

일반 복잡한 특징과 중요한 유전자 협회의 수가 지속적으로 증가하고있다. 그러나 이러한 단체의 대부분은 분자 수준에서 이해되지 않았습니다. phenotypes에 DNA 변종의 효과를 중재하는 메커니즘 중 하나는 복잡한 특성 1 특히 관련성이 높은 것으로 표시되었습니다 유전자 표현입니다. 이 방법의 휴대폰 컨텍스트 유전자 발현에서 특정의 DNA 시퀀스의 효과를 테스트합니다. 원리는 질병 (위험 변종) 2,3과 관련된 DNA 시퀀스 중 하나 사본을 가지고 세포를 분석, 유전자의 두 대립 유전자에서 발생하는 성적의 상대적 풍부한을 측정하는 것입니다. 따라서,이 방법에 사용되는 전지는 두 근본적인 genotypic 요구 사항을 충족해야합니다 그들은 DNA의 위험 변종에 대한 그들의 염색체 기원 (그림 1)에 따라 기록을 구별할 수있는 DNA 마커, 일반적으로 코딩 polymorphisms, 모두를위한 heterozygous해야합니다. DNA 위험 변종과 DNA 마커는 동일한 allele 주파수를 필요 아니지만 유전자 마커의 단계 (haplotypic) 관계를 이해해야합니다. 관심있는 유전자를 표현하는 세포 유형을 선택하는 것도 중요합니다. 이 프로토콜은 섬유아 세포에서 핵산을 추출 채택 절차를 구체적으로 참조되지만 이러한 방법은 기본 세포 등 다른 세포 유형에 동일하게 적용됩니다. DNA와 RNA가 선택한 셀 라인에서 추출하고 cDNA가 생성됩니다. DNA와 cDNA는 코딩 DNA 마커 사를 대상으로 설계된 프라이머 확장 분석과 함께 분석하고 있습니다. 뇌관 연장 분석은 제조 업체의 사양에 따라 MassARRAY (Sequenom) 5 플랫폼을 사용 수행됩니다. 프라이머 확장 제품은 다음 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 질량 분석계 (MALDI-TOF/MS) 비행의 이온화 시간에 따라 분석됩니다. 선택 마커가 heterozygous 있기 때문에 그들은 MS의 프로필에 두 개의 봉우리를 생성합니다. 각 피크의 면적은 사본의 풍요에 비례하고 all​​elic 비율 (allele 1 : allele 2) 생성하는 MassARRAY의 Typer 소프트웨어의 기능을 측정할 수 계산합니다. cDNA에 대한 획득 allelic 비율은 allelic 비율이 1시 1분 기술 아티팩트에 대한 올바른 될 예정입니다 게놈 DNA에서 측정되는을 사용하여 표준입니다. 1 크게 다른 표준 allelic 비율로 표식은 표현형와 관련된 유전자 변종은 유전자 발현에 영향을 미칠 것을 제안, 동일한 셀에 두 개의 염색체에서 발생하는 성적 증명서의 양이 다르다는 것을 나타냅니다. 실험 컨트롤이 결과를 확인하는 데 사용해야합니다.

유전자 단체는 종종 기능 수준에서 설명할 남아있다. 이 방법은 베꼈는데 SNPs에 대한 heterozygous 세포를 분석하여 유전자 발현에 대한 표현형 - 관련 유전자 마커의 효과를 평가하는 것을 목표로하고있다. 이 기술은 allele 특정 뇌관 확장 제품을 수치 든 - TOF 질량 분석법에 의해 정확한 측정이 가능합니다.

유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 Allele 특정 유전자 발현 분석

일반적인 복합 형질과 연관된 유의미한 유전적 연관성의 수는 지속적으로 증가하고 있습니다. 그러나 이러한 연관성 대부분은 아직 ...

다음 실험의 전반적인 목적은 질병과 관련된 것과 같은 특정 DNA 변이가 특정 유전자의 발현에 영향을 미치는지 테스트하는 것입니다. 이는 해당 변이와 관심 유전자의 코딩 스닙(coding snip) 모두에 대해 이형 접합성(heterozygous)을 보이는 세포주를 선택함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 세포에서 DNA와 RNA를 추출한 후 이를 대립유전자 특이적 일차 신장 반응(allele specific primary extension reaction)의 템플릿으로 사용합니다.다음으로, 두 대립유전자의 상대적 풍부도를 정량화하기 위해 1차 연장 생성물을 질량 분석법으로 분석합니다. 질량 분석법을 통한 정량적 대립유전자 특이적 측정을 통해, 질병과 관련된 원래의 DNA 변이가 유전자 발현의 차이와도 관련이 있는지 여부를 보여주는 결과를 얻습니다. 이 기술의 주요 장점은 루시페라제 리포터 유전자 분석과 달리 분자적 조작이 필요하지 않으며, 내인성 유전자 발현 수준을 측정할 수 있다는 점입니다.또한, 내부 대조 방식을 통해 두 대립유전자 간의 발현 수준을 비교할 수 있어 실험적 변동성을 일부 제거할 수 있습니다. 이 방법은 유전적 연관성의 기저에 있는 분자적 메커니즘과 같이 인간 유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 우리는 세 개의 유전자에 걸친 유전적 연관성을 확인했으나 신호를 단일 유전자로 좁힐 수 없었을 때 이 방법의 아이디어를 처음 설정했습니다.추가적인 유전자 매핑을 통해 수행합니다. 이 분석에 사용되는 세포는 관심 유전자를 발현해야 하며, 두 가지 기본적인 유전형 요건을 충족해야 합니다. 질환과 관련된 DNA 서열과, 염색체 기원에 따라 전사체를 구별할 수 있는 DNA 마커 모두에 대해 이형 접합체여야 합니다. 여기에 제시된 세포주 선택 전략에서, 세포주 A와 B는 삼각형으로 표시된 전사 가능한 코딩 마커에 대해 이형 접합체입니다.하지만 Omnicell 라인 A는 원으로 표시된 질병 관련 DNA 서열인 위험 DNA 변이에 대해 이형접합체입니다. 위험 변이의 파란색 대립유전자는 낮은 수준의 전사와 관련이 있습니다. 공급업체의 사양에 따라 플라스크 내의 세포 라인 배양물을 선택한 후, 본 시연에서는 섬유아세포를 사용하겠습니다. 이 분석법은 일차 세포를 포함한 다른 세포 유형에도 동일하게 적용 가능하지만, DNA 및 RNA 추출을 위해 각각 두 개의 10cm 페트리 접시를 준비하십시오.세포의 밀도가 80% confluence에 도달하면, 선택한 세포 유형에 적합한 시판 키트를 포함한 표준 방법을 사용하여 DNA 및 RNA 추출을 위해 세포를 수확할 수 있습니다. 이 분석을 수행하기 전에 각 DNA 마커에 대해 두 쌍의 PCR 프라이머를 설계하십시오. 한 쌍은 게놈 DNA 증폭용이고 다른 한 쌍은 cDNA 증폭용입니다. 게놈 오염을 방지하기 위해 cDNA 증폭용 정방향 및 역방향 프라이머를 서로 다른 엑손에 배치하십시오. 각 세포주에 대해 100~500 base pairs 길이 범위의 PCR 산물을 얻을 수 있도록 프라이머를 설계하십시오. 8 µL의 PCR 반응액을 준비하십시오. 매회 게놈 DNA 증폭을 위한 4개의 독립적인 반응과 cDNA 증폭을 위한 4개의 독립적인 반응을 수행합니다.PCR 반응과 관련된 마이크로 튜브에는 MLA의 tack dn, NTPs 프라이머, 염화마그네슘, 그리고 게놈 DNA 또는 cDNA가 포함되어 있습니다. 각 프라이머 쌍에 최적화된 조건에서 PCR 반응을 수행하며, 사이클 횟수를 증폭의 선형 단계 내로 유지합니다. PCR 반응이 완료되면, 각 PCR 생성물에 exonuclease one과 shrimp alkaline phosphatase (SAP)를 첨가하고 37 °C에서 20분간, 이어서 85 °C에서 15분간 배양하여 PCR 프라이머와 과잉 DNTPs를 제거합니다.각 PCR 산물을 384-웰 플레이트에 두 번씩 점적하여, 샘플당 8회의 측정이 가능하도록 합니다. 1차 신장 분석(extension assay)을 위해 총 16개의 점적을 수행합니다. 분석 설계 소프트웨어를 사용하여 게놈 및 cDNA PCR 산물 모두에 동일한 프라이머를 사용할 수 있도록 신장 프라이머를 설계하십시오.프라이머 길이를 14에서 18 base pairs 범위로 지정하십시오. 3종의 deoxy nucleotide terminator와 1종의 deoxy nucleotide가 포함된 적절한 혼합물을 사용하여 1차 신장 반응을 수행합니다. 일반적인 1차 신장 반응은 94 °C에서 2분간의 초기 단계를 거친 후, 94 °C에서 5초, 52 °C에서 5초, 72 °C에서 5초로 구성된 과정을 40회 반복하는 방식으로 진행됩니다.마지막으로, 연장된 올리고뉴클레오타이드는 spectro reader 질량 분석기를 이용한 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry)으로 정량 분석합니다. 이 프로토콜의 핵심은 실험 노이즈를 제어하여 아티팩트를 배제하기 위해 여러 전략을 사용하는 것입니다. 실험을 최소 3회 반복하는 것이 매우 중요합니다.실험을 위한 최선의 대조군은 1차 연장(primary extension)을 위한 코팅 snip 분석에 대해 이형접합(heterozygous)이지만 질병 관련 대립유전자는 보유하지 않은 세포주를 사용하는 것입니다. 또한, 대안적인 DNA 전사 코딩 마커를 위한 분석법을 설계하십시오. 이를 사용할 수 없는 경우, 1차 연장 분석을 위해 서로 다른 엑손(exon)을 표적으로 하는 추가적인 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 추가 대조군을 제공할 수 있습니다.내부 대조군은 정방향 및 역방향 가닥 모두에 결합하는 연장 프라이머의 설계를 통해 제공될 수 있습니다. 대립유전자 특이적 발현 분석의 예가 질량 분석 트레이스 예시와 함께 여기에 제시되어 있습니다. 이 그림은 네 가지 서로 다른 템플릿에서 수행된 네 가지 대립유전자 특이적 1차 연장 생성물의 분석 결과를 보여줍니다.상단 두 그래프는 전사되는 코딩 다형성에 대해 모두 이형접합체인 두 가지 서로 다른 세포주의 게놈 DNA 분석 결과를 나타냅니다. 그러나 세포주 A만이 위험 DNA 변이에 대해 이형접합체입니다. 하단 두 그래프는 실험적 아티팩트의 결과로 동일한 세포주에서 생성된 cDNA 분석을 통해 얻은 결과를 나타냅니다.유전체 분석에서도 첫 번째 피크는 항상 두 번째 피크보다 높게 나타납니다. 따라서 유전체 분석 결과를 사용하여 cDNA 데이터를 정규화합니다. 통계 분석은 mass array 유형 소프트웨어 내에서 모든 ELO 타이핑 리포트를 추출하여 수행합니다.이 보고서는 피크 면적에 관한 데이터를 제공하며, 여기서는 코딩 단일염기다형성(snip)에 대해 이형접합성을 띠는 두 세포주인 세포 A와 세포 B의 예시를 보여줍니다. 다만, 세포 A만이 질환 관련 마커에 대해 이형접합성을 나타냅니다. 회색으로 표시된 열은 소프트웨어에 의해 직접 생성된 것이며, 녹색으로 표시된 열은 각 세포에 대해 수동으로 도출된 것입니다. cDNA와 게놈 DNA 모두에 대해 8회의 측정이 이루어졌습니다.소프트웨어가 각 스펙트럼 피크 아래의 면적을 계산하며, 이는 두 대립유전자의 각각의 풍부도를 나타냅니다. 대립유전자 비율은 각 cDNA 및 게놈 샘플에 대해 대립유전자 1의 면적을 대립유전자 2의 면적으로 나누어 계산합니다. 8회 측정값 전체에 대해 평균과 표준오차를 계산합니다.0.1보다 큰 높은 표준 오차는 측정값이 일관되지 않음을 나타내며, 이러한 결과는 무시해야 합니다. 마지막으로, 대립유전자 특이적 발현에 차이가 없을 때 기대되는 비율인 1에서의 편차를 추정하기 위해, genomic DNA 평균 비율을 사용하여 cDNA 평균 비율을 정규화합니다. 정규화된 비율이 세포 A에서는 1과 다르지만 세포 B에서는 1에 가까운 경우, 해당 데이터는 세포주 A가 두 번째 피크로 측정된 대립유전자와 위상이 일치하는 DNA 변이를 보유하고 있으며, 이것이 분석 대상 유전자의 발현을 감소시킨다는 것을 시사합니다.세포주 B는 매우 편리한 음성 대조군을 제공합니다. 유용한 유전 변이체와 적절한 실험 대조군을 정의하기 위해서는 이 절차를 시도하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차 외에도, 대립유전자 특이적 유전자 발현을 분석하기 위해 사용할 전사 마커가 없는 유전 변이체의 위치와 같은 질문에 답하는 데 도움이 되는 haplotype 특이적 염색질 면역침전법과 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 대립유전자 특이적 방식으로 RNA를 분석하는 방법과 이를 통해 유전적으로 중요한 기능적 변이를 이해하는 방법에 대해 충분히 파악하시게 될 것입니다.

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