유전자 협회의 기능 기초를 테스트하는 Allele 특정 유전자 발현 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 질병과 관련된 것과 같은 특정 DNA 변이가 특정 유전자의 발현에 영향을 미치는지 여부를 테스트하는 것입니다. 이는 이 변이와 관심 유전자의 코딩 싹둑 모두에 대해 이형접합적(heterozygous)인 세포주를 선택함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 세포에서 DNA와 RNA를 추출한 다음 대립유전자 특이적 1차 확장 반응을 위한 주형으로 사용합니다.

다음으로, 1차 확장 산물은 두 대립유전자의 상대적 풍부도를 정량화하기 위해 질량 분석법으로 분석됩니다. 질병과 관련된 원래 DNA 변이가 질량 분석법에 의한 정량적 대립유전자 특이적 측정을 기반으로 유전자 발현의 차이와도 관련이 있는지 여부를 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 이 기술의 주요 장점은 루시퍼라아제에서 보고된 유전자 분석과 달리 분자 조작이 필요하지 않으며 유전자 발현의 내인성 수준을 측정한다는 것입니다.

또한, 내부적으로 제어된 방식으로 두 대립유전자 간의 발현 수준을 비교할 수 있어 실험적 변동성을 일부 제거할 수 있습니다. 이 방법은 유전적 연관성의 기저에 있는 분자 메커니즘과 같은 인간 유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 우리는 세 개의 유전자에 걸친 유전적 연관성을 확인하고 신호를 단일 유전자로 정제할 수 없었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 설정했습니다.

더 멀리 유전자 매핑으로. 이 분석에 사용되는 세포는 관심 유전자를 발현해야 할 뿐만 아니라 두 가지 기본적인 유전형 요구 사항을 충족해야 합니다. 그들은 질병과 관련된 DNA 염기서열과 염색체 기원에 따라 전사체를 구별할 수 있는 DNA 마커 모두에 대해 이형접합적이어야 합니다 여기에 표시된 세포주 선택 전략에서 세포주 A와 B, 삼각형으로 표시되는 전사된 코딩 마커에 대한 A는 이형접합적입니다.

그러나 옴니셀 라인 A는 원으로 표시되는 위험 DNA 변이체라고 하는 질병과 관련된 DNA 염기서열에 대해 이형접합적입니다. 위험 변이체의 파란색 대립유전자는 낮은 수준의 전사와 관련이 있습니다.공급자의 사양에 따라 플라스크의 세포인 세포주 배양을 선택한 후 이 데모에서는 섬유아세포를 사용할 것입니다. 이 분석은 일차 세포를 포함한 다른 세포 유형에도 동일하게 적용할 수 있지만, DNA 및 RNA 추출을 위해 각각 10cm 페트리 접시 2개를 준비합니다.

세포가 80% confluence에 도달하면 선택한 세포 유형에 적합한 상용 키트를 포함한 표준 방법을 사용하여 DNA 및 RNA 추출을 위해 세포를 수확할 수 있습니다. I 수행하기 전에 각 DNA 마커에 대한 두 쌍의 PCR 프라이머, 게놈 DNA 증폭을 위한 한 쌍, CDNA 증폭을 위한 다른 한 쌍, 게놈 오염을 피하기 위해 다른 엑손에서 CDNA 증폭을 위한 앞뒤로 프라이머를 배치하고, 게놈 오염을 피하기 위해 각 세포주에 대해 100-500 염기쌍 범위의 PCR 산물을 얻기 위한 프라이머를 설계하고, 8개의 마이크로리터 PCR 반응을 준비합니다. 4개는 게놈 DNA 증폭을 위한 독립 반응이고 4개는 매번 CDNA 증폭을 위한 독립 반응입니다.

PCR 반응과 관련된 마이크로에는 MLA의 tack dn, NTP 프라이머, 염화마그네슘 및 게놈 DNA 또는 CD NA가 포함됩니다. 각 프라이머 쌍에 최적화된 조건에서 PCR 반응을 실행하여 증폭의 선형 상에서 사이클 수를 유지합니다. PCR 반응이 완료되면. 각 PCR 산물에 엑소뉴클레아제 1과 새우 알칼리성 포스파타제 SAP를 첨가하고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양한 후 섭씨 85도에서 15분 동안 배양하여 PCR 프라이머와 과량의 DN TPS를 제거합니다.

각 PCR 산물을 384웰 플레이트에 두 번 스폿하여 각 샘플에 대해 8개의 측정을 사용할 수 있습니다.1차 확장 분석을 위해 총 16개의 스팟. 유전체 및 C-D-N-A-P-C-R 제품 모두에 동일한 프라이머를 사용할 수 있도록 분석 설계 소프트웨어로 확장 프라이머를 설계합니다.

프라이머 길이를 14 - 18 염기쌍 범위에서 지정합니다. 3개의 deoxy nucleotide terminator와 1개의 deoxy nucleotide를 적절하게 혼합하여 1차 확장 반응을 수행합니다. 일반적인 1차 확장 반응에는 섭씨 94도에서 2분 동안 시작 단계를 거친 다음 5초 동안 섭씨 94도, 5초 동안 섭씨 52도, 5초 동안 섭씨 72도의 40회 주기가 포함됩니다.

마지막으로, 확장된 올리고뉴클레오티드는 분광 판독기 질량 분석기를 사용하여 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석기로 정량화됩니다. 이 프로토콜의 핵심은 여러 전략을 사용하여 실험 노이즈를 제어하여 아티팩트를 롤아웃하는 것입니다. 적어도 세 번 이상 실험을 반복하는 것이 정말 중요합니다.

실험을 위한 최선의 대조군은 1차 확장을 위한 코팅 싹둑 분석을 위해 세포주 이형접합체를 사용하는 것이지만, 이는 질병 관련 대립유전자를 운반하지 않습니다. 또한 대체 DNA 전사 코딩 마커에 대한 설계 분석. 이를 사용할 수 없는 경우, 1차 확장 분석을 위해 다른 엑손을 표적으로 하는 선택적 PCR 프라이머 쌍에 의해 추가 대조군을 제공할 수 있습니다.

내부 제어는 확장 프라이머의 설계와 전방 및 후방 가닥 모두에 무릎을 꿇음으로써 제공될 수 있습니다. 대립유전자 특이적 발현 분석의 예가 질량 분석 추적의 예와 함께 여기에 나와 있습니다. 이 그림은 4개의 서로 다른 템플릿에서 수행된 4개의 대립유전자 특이적 1차 확장 산물의 분석 결과를 보여줍니다.

맨 위의 두 그래프는 두 개의 서로 다른 세포주의 게놈 DNA를 분석하여 얻은 결과를 나타내며, 둘 다 전사된 코딩 다형성에 대해 이형접합적입니다. 그러나 세포주 A만이 위험 DNA 변이에 대해 이형접합적입니다. 아래의 두 그래프는 실험 인공물의 결과로 동일한 세포주에서 생성된 CDNA를 분석하여 얻은 결과를 나타냅니다.

첫 번째 피크는 게놈 분석에서도 항상 두 번째 피크보다 높습니다. 따라서 게놈 분석 결과는 CDNA 데이터를 정규화하는 데 사용됩니다. 통계 분석은 대량 배열 유형의 소프트웨어 내에서 모든 ELO 입력 보고서를 추출하여 수행됩니다.

이 보고서는 피크 면적에 대한 데이터를 제공하며, 여기서는 코딩 캡처를 위한 두 개의 세포주, 세포 A와 세포 B 이형접합체와 관련된 예를 보여주지만, 질병 관련 마커의 경우 세포 A만 이형접합적입니다. 회색으로 놓인 나무는 소프트웨어에 의해 직접 생성되고 녹색으로 놓인 나무는 각 셀에 대해 수동으로 파생됩니다. CDNA와 게놈 DNA에 대한 8가지 측정이 있습니다.

소프트웨어는 각 스펙트럼 피크 아래의 면적을 계산하며, 이는 두 대립유전자 각각의 존재량을 나타냅니다. 대립유전자 비율은 각 CDNA 및 게놈 샘플에 대해 대립유전자 1의 면적을 대립유전자 2의 면적으로 나누어 계산합니다. 평균 및 표준 오차는 8개의 측정에서 계산됩니다.

0.1보다 큰 높은 표준 오차는 측정값이 일관되지 않으므로 무시해야 함을 나타냅니다. 마지막으로, genomic DNA mean ratio를 사용하여 cDNA mean ratio를 정규화하여 1의 비율로부터의 편차를 추정하며, 이는 대립유전자 특이적 발현에 차이가 없을 때 예상됩니다. 정규화된 비율은 세포 A의 비율과 다르지만 세포 B의 비율에 가까운 이 데이터는 세포주 A가 두 번째 피크에 의해 측정된 대립유전자와 함께 위상적으로 DNA 변이를 가지고 있으며, 이는 분석 중인 유전자의 발현을 감소시킨다는 것을 시사합니다.

세포주 B는 매우 편리한 음성 대조군을 제공합니다. 이 절차를 시도하는 것은 유익한 유전 변이를 정의하고 적절한 실험 대조군을 정의하는 데 매우 중요하지만 이 절차를 따릅니다. 하플로타입(haplotype), 특이 염색질 면역침전(specific chromatin immunoprecipitation)과 같은 다른 방법을 사용할 수 있으며, 이는 대립유전자 특이적 유전자 발현을 분석하는 데 사용할 전사된 마커가 없는 유전적 변이가 있는 위치와 같은 질문에 답하는 데 도움이 됩니다.

이 비디오를 시청한 후에는 대립유전자 특이적 방식으로 RNA를 분석하는 방법과 이를 사용하여 유전적으로 중요한 기능적 변이를 이해하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.