꿀벌의 코 확장 응답 클래식 컨디셔닝에 Behavioural 약리학 ( 아피스 mellifera)

본 실험 절차의 전반적인 목적은 학습 및 기억 형성의 기저에 있는 분자적 기전을 연구하는 것입니다. 꿀벌의 경우, 첫 번째 단계는 벌통에서 자유롭게 비행하는 벌들을 채집하는 것입니다. 그다음으로, 벌들을 플라스틱 튜브에 고정합니다.

절차의 세 번째 단계는 고전적 조건형성을 수행하는 것입니다. 학습 및 기억 형성에 미치는 영향을 연구하기 위해 조건형성 전후의 특정 시점에 약물을 주입할 수 있습니다. 절차의 마지막 단계는 기억 유지력을 테스트하는 것입니다.

궁극적으로, 약물 처리 후의 행동 변화는 학습 및 기억 형성의 근저에 있는 분자적 메커니즘을 밝혀낼 수 있습니다. 꿀벌의 경우, 이 방법은 기억 형성의 분자적 메커니즘을 규명함으로써 학습 및 기억 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 조건 형성 및 기억 회상 과정 중 자극 제시 타이밍이 매우 정확해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 또한, 급이 체계 또한 매우 중요합니다. 이 절차는 저희 실험실의 대학원생인 cutting gearing와 Johannes faberg를 통해 시연될 예정입니다. 실험 전날 오후 2시에서 4시 사이에 UV 광투과성 플렉시글라스 피라미드를 사용하여 벌을 수집하십시오.

실험실로 돌아오면 피라미드를 바닥면에 세우고, 꼭대기 부분만 노출시킨 채 벽면을 수건으로 가려 어둡게 만듭니다. 꼭대기 부분을 열고 개구부 위에 유리 바이알을 든 채로 벌 한 마리가 바이알 내부로 이동할 때까지 기다린 후 다시 닫습니다. 가을과 겨울철에 모든 벌이 유리 바이알로 옮겨질 때까지 이 과정을 반복합니다.

벌이 외부로 날아가지 않을 때, 온실 내 망 속에 벌집을 보관하며, 망에서 개별 벌을 직접 포획합니다. 벌 한 마리당 유리 바이알 하나를 사용하여, 바이알을 얼음 위에 2.5분에서 3.5분 동안 두어 냉각시킴으로써 벌을 고정합니다. 벌의 상태를 주의 깊게 관찰하고, 움직임이 멈추는 즉시 얼음에서 제거합니다.

부동화된 벌을 점착 테이프를 사용하여 작은 플라스틱 튜브에 고정하십시오. 이때 벌의 입틀은 자유롭게 움직일 수 있어야 하며, 머리, 가슴, 다리는 움직이지 않도록 주의하십시오. 또한 목 부분이 압박되지 않도록 하는 것이 중요합니다.

벌의 준비가 완료되면, 취급 및 식별을 용이하게 하기 위해 번호가 매겨진 랙의 보어홀에 튜브를 넣습니다.

튜브는 항상 동일한 보어홀로 되돌립니다. 처리 후, 컨디셔닝 장소와 분리된 곳에서 오후 4시에서 6시 사이에 벌에게 먹이를 공급합니다. 벌과 촉각을 자극하여 확률적 주둥이 신장 반응(Proboscis extension response) 또는 PER을 유도합니다.

자당 용액을 사용하여 벌이 약 4 µL의 SRA 용액 한 방울을 섭취하도록 합니다. 이때 벌의 촉각, 구강 부속물 또는 플라스틱 튜브에 용액이 묻지 않도록 주의하십시오. 벌이 더 이상 섭취하지 않을 때까지 각각 먹이를 줍니다.

안테나가 용액에 닿았을 때 빠르고 확실한 PER(확장 반응)을 보이는지 확인합니다. 실험의 다음 날들에는 각 벌에게 설탕 용액 한 방울을 네 번 급여합니다. 높이가 약 0.5에서 1cm인 플라스틱 그릇에 수돗물을 채웁니다.

리사 플레이트(lysa plates)를 플랫폼으로 사용하여 고정된 벌들이 담긴 랙을 볼에 넣습니다. 볼을 판지로 덮고 상온에서 하룻밤 동안 보관합니다. 벌들은 수집 다음 날 오전 10시경에 후각 조건화 과정을 거칩니다.

실험 시작 30분 전. 하네스 벌이 담긴 랙을 조건 형성 장소 근처에 두되, 벌들이 훈련받게 될 배기 파이프 입구에서는 떨어진 곳에 배치하십시오. 다음으로, 후드 내에서 조건 자극제를 준비하십시오.

필터 팁을 사용하여 정향유 4 µL를 원형 필터 페이퍼 위에 피펫팅합니다. 향이 배어든 필터 페이퍼를 20 mL 시린지에 넣고 플런저를 삽입합니다. 실험자에게 음향 신호를 전달할 오디오 플레이어를 설정합니다.

이를 통해 자극의 시작, 자극의 종료, 지속 시간 및 배치 타이밍을 정확하게 조절할 수 있습니다. 조건 형성 과정 전반에 걸쳐 벌의 행동을 기록할 준비를 하십시오. 조건 자극의 시작부터 무조건 자극의 제시 사이에 벌이 SSIS를 확장하면 양수 점수를 부여합니다.

벌린 큰턱 사이의 가상선을 통과합니다. 습득 훈련을 시작하려면 훈련시킬 벌을 선택하여 배기구 앞에 10초 동안 배치합니다. 이 10초의 간격이 끝나기 직전에, 냄새가 포함된 주사기를 벌의 더듬이로부터 3cm 거리에 둡니다. 주사기를 통해 공기 20mL를 밀어내어 5초 동안 냄새를 제시합니다.

3초 후, 젖은 이쑤시개에 sucrose 용액을 묻혀 양쪽 촉각 원위 편모의 복측 부위를 터치하여 무조건 자극을 제공합니다. 벌과 촉각에 용액이 묻지 않도록 주의하며, 벌이 이쑤시개를 핥도록 합니다. 이 복합 자극은 4초 동안 지속되며, 이후 벌들을 훈련 환경에서 제거하여 다시 랙에 배치합니다.

조건 자극을 제시한 후 13초가 지나면 한 번의 훈련 시행은 28초 동안 지속됩니다. 시행 간 간격인 10분이 지난 후 벌을 훈련 장소로 되돌려 보냅니다. 앞서 설명한 것과 같이 세 번의 시행 중 두 번째 시행을 수행하고, 마지막 짝짓기를 수행하기 전 10분을 추가로 기다립니다.

당일 훈련이 완료되면 랙을 다시 볼에 넣습니다. 오후 4시에서 6시 사이에 각 벌에게 4 µL의 설탕 용액 한 방울을 네 번 급여하는 것을 잊지 마십시오. 앞서 시연한 바와 같이, 유지 테스트는 훈련 후 몇 분에서 며칠 사이의 어느 간격으로든 수행할 수 있습니다. 벌 랙을 조건 형성 장소 근처에 30분 동안 두어 기억력 테스트를 준비하십시오.

벌을 배기구 앞에 10초 동안 두어 테스트를 시작합니다. 조건 자극을 5초 동안 제시하고 PER 발생 여부를 기록합니다. 해당 일의 테스트가 완료되면 랙을 다시 보울에 넣습니다.

앞서 시연한 바와 같이 오후 4시에서 6시 사이에 각 벌에게 4 µL의 설탕 용액 한 방울씩 총 4회 급여하는 것을 기억하십시오. 전체 실험이 끝난 후, 분석에 포함될 SRAs 용액으로 촉수를 터치하여 벌이 여전히 구강인두(proboscis)를 확장할 수 있는지 확인하십시오. 벌은 전체 실험 과정 동안 생존해야 하며 PER이 온전해야 합니다. 일부 연구에서는 약리학적 개입이 후각 기억에 미치는 영향을 연구하기 위해 전신 주사가 사용됩니다. 이러한 주사는 실험 설계에 따라 서로 다른 시점에 투여될 수 있습니다.

먼저 일회용 피하 주사 바늘을 사용하여 비행근 상단 S scootle fissure 근처의 S scootin 후방 큐티클에 작은 구멍을 냅니다. 다음으로 유리 모세관에 테스트할 용액 1 µL를 채웁니다. 이 모세관을 큐티클의 구멍에 삽입하고 비행근에 용액을 주입합니다.

숙련된 실험자는 30초마다 한 번씩 B를 주입할 수 있으며, 이를 통해 주입 및 조건 형성의 정밀한 타이밍 조절이 가능합니다. 여기서는 두 가지 실험을 제시합니다. 첫 번째 실험은 훈련 전 생리식염수의 전신 주입이 기억 학습에 미치는 영향을 조사합니다.

본 연구에는 처리군이 없는 A 그룹, 1 µL의 인산완충생리식염수를 전신 주입한 그룹, 또는 가짜 처리(sham) 그룹의 세 그룹이 있습니다. 이러한 처리는 왼쪽에서 보여주는 훈련 시작 30분 전에 수행되었습니다. 습득 과정 중 조건 반응을 보이는 동물의 비율은 세 차례의 훈련 회차에 걸쳐 증가하였으며, 그룹 간의 차이는 나타나지 않았습니다.

오른쪽의 막대 그래프는 PBS 주입과 가짜 손상 모두 기억 유지에 영향을 미치지 않았음을 보여줍니다. 두 번째 실험의 훈련 24시간 후, 훈련 후 40분에 주입이 이루어졌으며, 벌들은 식염수를 투여받은 그룹과 단백질 합성 억제제인 anisomycin 1 µL를 투여받은 그룹으로 나누어졌습니다. 오른쪽의 막대 그래프는 anisomycin을 투여받은 벌들의 기억 유지가 뚜렷하게 감소했음을 보여줍니다. 이러한 결과는 후각 기억 형성에 있어 단백질 합성의 중요성을 강조합니다.

이 절차를 마친 후, 발달 이후 학습 및 기억 형성의 신경생리학적 기초는 무엇인가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 전기생리학적 기록을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 학습 및 기억 연구 분야의 연구자들이 꿀벌의 기억 형성 과정에 관여하는 분자 및 신경생리학적 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.