개발하고 성인 단계에서 중개 신진 대사 플럭스 안정 원소 프로파일 Caenorhabditis 엘레간스

다음 실험의 전반적인 목표는 개별 대사 경로, 유전적 변형 및/또는 약물 치료에 의해 유발되는 해당작용, 피루브산 대사 및 트리카르복실산 주기 내에서 전체 동물 수준에서 실시간 대사 변화를 비침습적으로 모니터링하는 것입니다. 이는 살아있는 선충에 안정 동위원소를 공급하여 더 많은 대사 산물에서 충분한 동위원소 농축을 제공하여 중간 대사 경로에서 유전적 또는 약리학적 변화를 정량화할 수 있도록 함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 대기 및 용존 이산화탄소의 동위원소 혼입은 가스 비율 질량 분석법으로 측정되며, 이는 단기간에 걸쳐 중간 대사 플럭스를 보다 직접적으로 평가합니다.

다음으로 HPLC를 사용한 전체 벌레가 없는 아미노산 분석을 위해 샘플을 처리하고, 선충의 대사 플럭스 변화를 정량화하기 위해 GCMS에 의한 아미노산 및 유기산의 동위원소 농축을 통해 시료를 처리합니다. 안정 동위원소 노출 후, 중간 대사 산물에서 동위원소 풍부도를 조사하기 위해 야생형 웜에서 동위원소 노출 기간의 다양한 기간, 박테리아 제거 및 대체 벌레 파괴의 효과를 보여주는 결과를 얻었습니다. 방법과의 전쟁은 중간 신진대사에 대항하는 항해에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 포유류 세포주 및 조직과 같은 시스템에 적용할 수 있습니다. HPLC에 의한 유리 기생충 아미노산 분석에서 원발성 호흡기 변화 기능에서 중간 대사 플럭스의 손상된 것을 암시하는 일관된 이상을 관찰했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 이 절차를 시작합니다.

발달 과정 또는 성인기에 대사 전구체로 표지된 안정 동위원소에 노출된 기생충은 1.5ml 플라스틱 원심분리기 튜브에 수집됩니다. 우리는 일반적으로 벌레를 1밀리리터당 1000마리의 농도로 희석합니다. 엡실론 아미노카프로산을 내부 표준물로 함유하는 염소산 당 60%를 웜에 최종 농도 4%와 내부 표준물질 20나노몰로 추가합니다.

웜이 5분 동안 중력에 의해 가라앉도록 한 다음 상층액을 제거하여 다른 튜브에 저장합니다. 다음 단계는 이 절차의 가장 중요한 측면 중 하나입니다. 유리 대사 산물 분석 전에 스크리닝을 통해 웜을 완전히 파괴해야 합니다.플라스틱 균질화기와 전동 드릴을 사용하여 웜 샘플을 15초 동안 분쇄합니다.

광학 현미경으로 웜 중단을 육안으로 확인하고 필요한 경우 분쇄를 반복합니다. 이 이미지에서 패널 A와 B는 연삭 전의 웜을 보여줍니다. 분쇄 후 웜이 나타나는 패널 C와 D와 달리, 이전에 저장한 상등액을 웜 균질성 원심분리기를 사용하여 1.5ml 플라스틱 원심분리기 튜브로 전달합니다.

2, 250 RPM, 1300 Gs에서 5 분 동안 샘플. 원심분리 후 상층액을 새 7ml 유리관으로 옮깁니다. 나중에 단백질 농도 분석에서 사용할 수 있도록 펠릿을 보관하십시오.

이제 샘플의 pH 범위가 7-8 원심분리기가 될 때까지 SUPERNAT에 4개의 일반 수산화칼륨을 추가합니다. 7 밀리리터 유리관의 중화 된 샘플을 2, 250 RPM, 1300 Gs에서 5 분 동안 염을 제거하려면 각 샘플의 상등액을 새로운 7 밀리리터 유리관으로 옮깁니다. 중화된 시료는 이제 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC 및 가스 크로마토그래피, 질량 분석 또는 HPLC용 GCMS를 통해 대사 산물 정량화를 위해 준비할 수 있습니다.

HPLC에 직접 주입하기 위해 각 중화된 시료를 50마이크로리터씩 분리합니다. 유리 아미노산 정량화는 알 알데히드 및 형광 검출을 통한 precal 유도체화를 사용하여 수행됩니다. 앞서 설명한 바와 같이, 나머지 중화된 샘플은 다음 섹션과 같이 아미노산 및 유기산의 동위원소 농축을 결정하기 위해 GCMS용 이온 교환 수지를 사용하여 추출됩니다.

비드를 준비하려면 G 1 및 G 50 비드에 일반 염산 1개를 별도로 추가합니다. 1리터 비커에 각 플라스크를 자석 교반으로 30분 동안 저어줍니다. 그 후, 세척제의 pH가 물의 pH와 같을 때까지 탈이온수로 비드를 10회 세척합니다.

다음으로, 유리 피펫을 사용하여 맞춤형 저비용 컬럼을 준비하는 방법을 보여 드리겠습니다. 미리 만들어진 컬럼도 상업적으로 이용 가능합니다. 컬럼을 준비하려면 집게를 사용하여 목초지 피펫 팁의 가장 좁은 부분 바로 위에 면 플러그를 삽입하고 유기산 추출을 위해 G one 비드를 사용하고 G 50 비드를 사용합니다.

아미노산 추출의 경우 각 열을 열 높이의 약 1/3까지 채웁니다. 샘플이 이미 중성 pH에 있는 경우, AG one column에 적용하기 전에 샘플에 아무 것도 추가되지 않습니다. 아미노산을 추출하기 위해 유기산을 추출하려면 AG 50 컬럼에 적용하기 전에 0.1 일반 염산 1ml를 샘플에 첨가합니다.

이제 이전에 준비된 중화된 샘플을 각 컬럼에 적용합니다. 세척이 중성이 될 때까지 각 기둥을 물로 10회 세척합니다. 세척이 완료된 후 각 컬럼을 라벨이 부착된 새로운 4밀리리터 유리 샘플 바이알로 용리합니다.유기산 추출을 위해 3밀리리터의 3개의 일반 염산을 AG 1 컬럼에 추가합니다.

이를 통해 3개의 탄소종, 4개의 탄소종, 5개의 탄소종, 6개의 탄소종에 걸쳐 표지된 탄소의 총 수에 대한 동위원소 농축을 분석할 수 있습니다. 아미노산 추출을 위해 G 50 컬럼에 3밀리리터의 일반 수산화암모늄을 첨가합니다. 이를 통해 3개의 탄소 종과 5개의 탄소 종 사이에서 표지된 탄소의 총 수에 대한 동위원소 농축을 분석할

유기산과 아미노산 추출이 모두 완료되면 샘플 바이알을 반응성 앱 3개의 증발기에 넣고 마를 때까지 밤새 놓습니다. 그런 다음 프로토콜 텍스트에 자세히 설명된 대로 GCMS에 의해 샘플이 dert 및 분석됩니다. 이 절차를 시작하여 1,000마리의 어린 성충을 보편적으로 표지된 탄소 13 포도당과 대장균이 포함된 실험용 35mm NGM 농업 플레이트로 옮깁니다.

다음으로 덮개가 없는 실험용 NGM 플레이트를 놓습니다. 정확한 분위기 샘플링 및 교체를 허용하기 위해 잘 밀봉된 3방향 스톱 콕이 장착된 맞춤형 유리 챔버에서. 광학적으로 투명한 유리 디스크가 플레이트에 놓인 씰을 고진공 그리스로 덮습니다.

유리 디스크로 챔버를 밀봉합니다. 시간을 기록하십시오. 30분 후 시간이 0이 되면 20ml 주사기를 사용하여 3방향 스톱 콕으로 유리 챔버에서 10ml의 대기를 샘플링합니다.

스톱 콕을 챔버에 닫습니다.샘플링 후, 샘플을 0.1 몰 수산화나트륨에 1 밀리리터의 중탄산 나트륨이 들어있는 빨간색 욕조 진공 청소기 유리관으로 옮깁니다. 다음으로, 3방향 스톱 콕을 통해 유리 챔버에 10ml의 공기를 주입합니다. 20 밀리리터 주사기를 사용하여 스톱 콕을 챔버에 닫습니다 분위기를 재주입 한 후 배양을 재개하기 전에 60, 90 및 120 분에 유리 챔버에서 대기의 샘플링을 반복합니다.

의정서 텍스트에 설명된 대로 가스 비율 질량 분석기를 사용하여 표시된 탄소 농축에 대한 이러한 대기 중 이산화탄소 샘플을 분석하고, 안정적인 동위원소는 대기 중 이산화탄소에서 측정된 라벨링된 탄소와 살아있거나 자외선에 조사된 죽은 OP 50 e coli에서 용해된 지렁이 이산화탄소에 의해 입증된 바와 같이 2시간 후에 젊은 성인 벌레에 잘 통합됩니다. 탄소 13 이산화탄소와 탄소 12 이산화탄소의 비율은 방출된 대기 중 이산화탄소에 비해 용존 지렁이 이산화탄소 분율에서 더 컸다. 유충 기간부터 안정 동위원소에 장기간 노출된 후 박테리아 없이 NGM Aate에서 기생충을 제거하면 어린 성충에서 유리 글루타메이트의 동위원소 농축이 증가하는 것이 관찰되었습니다.

이 그래프에서 L 1은 L 1 유충 단계에서 959 세포 청년 단계까지 보편적으로 표시된 탄소 13 포도당과 OP 50 박테리아를 먹인 기생충을 나타내며, YA는 알을 낳는 젊은 성인 단계의 첫날에 도달한 시점부터 48시간 동안 탄소 13 포도당과 OP 50 박테리아를 먹인 기생충을 나타냅니다. x축은 각 글루타메이트 종에서 표지된 탄소 원자의 총 수를 나타내고 Y축은 농축 비율을 나타냅니다. 모든 동물은 다운스트림 샘플 준비 전에 과도한 동위원소 표지를 제거했습니다.

GCMS 분석의 경우, 녹색 막대는 PCA 추출 전 2시간 동안 NGM 플레이트에 OP 50 E coli를 공급하여 동위원소 노출 후 제거된 기생충을 나타냅니다. 파란색 및 회색 막대는 동위원소 노출 시간 경과에 관계없이 PCA 추출 전에 각각 2시간 또는 6시간 동안 박테리아가 없는 NGM 플레이트에 동위원소에 노출된 후 제거된 기생충을 나타냅니다. 중간 대사 산물에서 동위원소 농축의 유의미한 차이는 동물을 2시간 또는 6시간 동안 플레이트에서 세척했을 때 관찰되지 않았습니다.

두 동위원소 노출 과정 모두에서, 표지되지 않은 박테리아를 2시간 동안 먹이로 동물을 제거했을 때 중간 대사 산물에서 동위원소 농축이 덜 관찰되었습니다. 따라서 동위원소가 있는 박테리아 확산 N GM 플레이트에서 성장한 웜에 대한 최적의 정화 프로토콜은 중간 대사 산물의 농축 비율을 최적화하기 위해 확산되지 않은 NGM 플레이트에서 2시간 동안 투명화하는 것으로 결정되었습니다. 박테리아없이 하나의 6 개의 탄소 13 포도당으로 액체 배양에서 24 시간 동안 처리하십시오.

이 그림과 같이 초음파 처리 단독 또는 초음파 처리와 분쇄에 의해 파괴 된 웜 샘플을 비교했습니다. Sonication과 분쇄에 의해 파괴 된 웜은 Sonication에 의해서만 파괴 된 샘플보다 동위 원소 농축이 더 컸으며, 플레이트의 L 한 단계에서 발달하는 동안 또는 알의 첫날부터 시작하여 액체 배양에서 24 시간 동안 젊은 성인으로 산란하는 동안 살아있는 벌레에게 안정한 동위 원소 전구체를 공급했습니다. 해당과정을 통한 플럭스, 개발 후 트리카르복실산 주기에서 피루브산 대사를 나타내는 대사 산물 중 동위원소 농축에 대한 민감한 분석을 허용합니다.

이 기술은 미토콘드리아 질환의 길을 열었으며, 바다의 우아함에서 중간 대사 흐름을 탐구하기 위한 연구를 진행하고 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 안정적인 동위원소를 수행하는 방법, 선충의 중간 대사 및 대사 플럭스 프로파일링, 우아함을 잘 이해하게 될 것입니다.