Name: 성인 모기 (A. gambiae)에서 RNAi의 Assays을위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 배우세요 Anopheles gambiae 모기에서 RNAi를 이용한 유전자 침묵화 기법을 통한 말라리아 매개체 저항성 연구 방법을. 이 프로토콜은 흉부 주사를 통해 유전자 기능을 탐구하는 데 활용됩니다.

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모기에 RNAi - 중재 유전자 입을 관심의 유전자를 대상으로 특정 dsRNAs의 사전 준비 및 정화가 필요합니다. dsRNA 합성을 위해, 우리는 T7 RNA 시험 관내 전사 반응에서 효소 - 중재의 사용을 만드는 앰비온의 Megascript 키트를 권장합니다. dsRNA 정화를위한, 우리는 Qiagen RNeasy 키트를 권장합니다. dsRNA의 샘플은 계량 3 μg / 물 μL 조정해야합니다. 당신이 필요합니다 다른 자료는 다음과 같습니다 미세 밀고 포셉, 유리 슬라이드, 유리 microcapillary 바늘, microinjector (우리가 드루먼드의 Nanoject II를 사용하여), 감기에 블록, 커버 유리 페트리 접시, 종이 타월과 얼음 양동이 위에 장착 가벼운 현미경 . 당신은 또한 10 %의 자당에 배어 목화 공을 같은 음식 소스와 함께 모기 그들에 적합한 컨테이​​너를 수집하는 방법이 필요합니다. <ol><li> 당신의 모기를 수집합니다. 배터리 구동 흡인기를 사용하면 삽입하고자하는 모기를 수집합니다. 종이 타월이나 면으로도 모기가 저수지 탈출하지 않고 제거할 수있는 노즐​​을 꽂습니다. 추운 기온이 모기를 마취 때문에, 얼음 양동이에있는 저수지 매장 및 이동 막기 위해 모기에 대한 50-10분을 기다립니다. Anesthetization도 감기 방이나 냉장고에 저수지를 삽입하거나 CO 2를 사용하여 얻을 수 있습니다. 이러한 5-10분 동안 다음 단계를 계속합니다. </li><li> 작업 영역을 준비합니다. 2 평평한 표면 감기에 블록을 설정 ° C와 거기에 유리 슬라이드를 놓으십시오.이 이것은 당신이 주사로 모기가 나머지됩니다 곳입니다. microinjector에 유리 바늘을 첨부하고 원하는 너비로 바늘의 팁을 휴식에 집게를 사용합니다. 넓이가 액체에 대한 충분한 공간이 적당한 속도로 흐르는 수 있도록 충분히 큰지만 주입하는 동안 최소한의 상처를 입힐 수있을만큼 좁고 것이 중요합니다. 좋은 바늘 끝이 약간 구부 정도로 좁은 수 있지만 휴식하지 않습니다. 원하는 출력 볼륨 (RNAi을 위해, 우리는 69 NL을 사용)로 분사 장비를 설정합니다. 잠수함은 샘플에 바늘의 팁 및 제조 업체의 지침을 사용하여 바늘에 액체 샘플을 그립니다. 액체 시료는 dsRNA 솔루션 세균 정지 또는 기타 수 있으며, 사출 과정은 모두에 대해 동일합니다. 접시의 바닥이 완전히 얼음을 연락되도록 얼음 양동이에 유리 페트리 접시를 삽입할 수 있습니다. 당신이 그들을 주입 준비가 될 때까지 당신은 모기를 놓습니다 곳입니다. </li><li> 당신의 모기를 준비합니다. 전송 50-100 모기 유리 페트리 접시에 저수지에서. 대부분의 그들이 anesthetized 유지하는 요리의 차가운 바닥과 접촉했는지 확인하고, 단일 레이어로 얇은 위해 집게를 사용하십시오. 사용하지 않을 때는 커버 접시 이러한 모기 커버. 모기의 나머지 anesthetized 유지하는 얼음 양동이에 저수지를 반환합니다. </li><li> 추운 블록에 모기를 탑재합니다. 접시에서 빛을 현미경 추위 블록에 장착된 유리 슬라이드에 한 번에 모기를 전송하여 미세 밀고 집게를 사용하십시오. 낫게 다리에 의해 부드럽게 모기를 처리할 수 있습니다. 서 슬라이드 많은 30 모기 나란히, 당신이 microinjector 각 하나를 얻을 각 하나가 감기 슬라이드와 접촉하게 확인하고 확신하고. 당신의 모기가 당신이 따라가는대로하고 주입되지 않은 어떤 알 수 있도록 질서 줄지어 있는지 확인합니다. 냉장 페트리 접시에 나와 다른 모기를 남겨주세요. </li><li> 모기의 첫 번째 그룹을 주사. 한 손으로에서 미세 스쳐 스쳐 집게를 잡고 연필처럼 한편의 microinjector를 개최. 필요로 모기를 이동 (부상을 피하기 위해 다리하여 처리) 및 주사로 모기가 안정 유지하기 포셉을 사용합니다. 당신은 다른 측면에서 주사로이 모기의 한쪽을 지원하는 포셉을 사용하는 경우가 최상의 상태로 작동합니다. 조심스럽게 모기의 흉부에 그냥 바늘 끝부분을 삽입합니다. 부상을 최소화하기 위해 표피의 긴장 늦추지 아직 얇은 부분에 주입하는 것이 좋습니다. 또한, 너무 깊이 주입하지 않도록, 당신은 흉부 내부로 끝에만 원하는, 깊은 주사는 생존을 위해서야 큰 상처의 원인이됩니다. 일단 바늘 끝이 위치에, 언론과 dsRNA의 사전 설정된 볼륨을 제공합니다 microinjector 장치의 발을 페달을 놓습니다. 두 번째 또는 두 기다려하고 모기에서 바늘을 제거합니다. 액체 한 방울의 상처 사이트 외부 나타나면 그것이 상처로 흡수 될 수있는 몇 초 정도 기다리십시오. 그것은 몇 초 내에 흡수하지 않는 경우, 그 모기를 버리고 다시 시도하십시오. 당신의 유리 슬라이드에있는 모든 모기에 대한 사출 과정을 계속합니다. </li><li> 당신의 모기를 저장합니다. 작업이 완료되면 표시 용기 안에 주입 모기 플레이스 (우리는이 적용 한 파인트 왁스 늘어선 종이 컵을 선호) 그물 및 고무 밴드 및 판지 뚜껑과 보안을 메쉬. </li><li> 완료까지 주사를 계속합니다., 슬라이드에 모기를 게재할 계속 주사하고 여러분이 원하는 샘플 크기를 때까지 컵을 전송할 수 있습니다. 어떤 죽음 - 초보자를위한 계정은 많은 모기가 주사의 외상에서 죽게됩니다. 당신의 모기의 거의 100 %가 주사를 살아남을 때까지이 연습 향상됩니다. </li><li> 완료되면, 음식 소스와 함께 한잔으로 접으면, 젖은 종이 타월을 장소와 같은 플라스틱 랩 또는 플라스틱 페트리 뚜껑으로 수분을 유지하기 위해 뭔가 컵을 커버. 주입 모기는 젖은 수건으로 제공하고 플라스틱으로 유지 수분이되지 않도록 도움이 될 것입니다 그러니 건조하는 경향이 있습니다. </li><li> 배양을위한 환경 제어 챔버에서 모기를 놓습니다. </li></ol> 참고 : 유전자 입을의 효율성이 높은 변수이며 세포와 기관에 의해 증명서 및 단백질 턴 오버 요금 및 dsRNA의 이해 효율을 포함한 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 우리는 입을는 1 일 게시 주입처럼 일찍 시작 것을 발견 가지고 있고, 최대 6 일 게시 주입에 마지막으로하실 수 있습니다. 입을를 확인하기 위해 모래 바닥 같은 양적 PCR과 서양 등 증명서와 단백질 검출 방법을 사용합니다. 참고 : 모기 주사와 RNAi - 중재 유전자 입을 기술의 여러 단계에 대한 몇 가지 변형이 있습니다. 일부 변형에 의해 설명되어 있습니다 : Boisson, 외 (2006)와 블랜딘, 외 (2002)...

<ol><li>Boisson,, et al. , (2006).</li>
<li>Blandin,, et al. , (2002).</li>
</ol>

유전자 입을의 효율성은 매우 다양하고 세포와 기관에 의해 증명서 및 단백질 턴 오버 요금 및 dsRNA의 이해 효율을 포함한 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 우리는 입을는 이르면 1로 일 게시 주사를 시작하고 최대 6 일 게시 주입 지난 수있는 것으로 나타났습니다. 입을를 확인하기 위해 모래 바닥 같은 양적 PCR과 서양 등 증명서와 단백질 검출 방법을 사용합니다.

<table><tbody><tr><td>Megascript</td><td>키트</td><td>Ambion</td><td></td><td>dsRNA 합성을 위한; T7 RNA polymerase 매개 인 비트로(in vitro) 전사 반응</td></tr><tr><td>RNeasy</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td>dsRNA 정제를 위한</td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td></td><td>정량 후 증류수에서 3 &amp;#x03BC;g/ &amp;#x03BC;L로 농도를 조절해야 함</td></tr><tr><td>미세 핀셋</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 글라스</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 미세모세관 바늘</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로인젝터</td><td></td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoject II</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td></td><td></td><td></td><td>콜드 블록 위에 설치됨</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td></td><td></td><td></td><td>뚜껑이 있는 유리제</td></tr><tr><td>종이 타월</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% sucrose</td><td>식품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. gambiae</td><td>동물</td><td></td><td></td><td>모기</td></tr></tbody></table>

성인 모기 (a. gambiae)에서 rnai의 assays을위한 프로토콜

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

역방향 유전자 접근 방법은 모기에 벡터 병원균하는 유전자 underly 저항을 결정하는 매우 유용하게 입증했습니다. 이 비디오 프로토콜은 말라리아 기생충을 항구 아노 펠 레스 모기 gambiae로 dsRNA를 주입하기 위해 Dimo​​poulos 연구실에서 사용하는 방법을 보여줍니다. 사출 설정을 조작하고 흉부에 dsRNA를 주입 기술은 그림이다.

성인 모기 (A. gambiae)에서 RNAi의 Assays을위한 프로토콜

역유전학적 접근법은 모기에서 매개체 병원체에 대한 저항성의 기초가 되는 유전자가 무엇인지 결정하는 데 매우 유용함이 입증되었습니다. 이 영상은 ...

저는 Johns Hopkins 공중보건대학원의 George Dimopoulos 박사님 연구실에서 공부하고 있는 박사 과정 학생 Lindsay Garver입니다. 이번 시간에는 주입 기술을 이용한 RNAi 매개 유전자 억제 방법을 보여드리겠습니다. 첫 번째 단계는 주입 대상이 될 모기들을 수집하는 것입니다.이들은 일반적인 가비(Gabi) 개체들입니다. 암컷과 수컷이 섞여 있습니다. 그리고 이것은 배터리로 작동하는 흡입기입니다.내부에 팬이 있어 흡입력을 생성하며, 이를 통해 모기들을 이 노즐을 거쳐 저장조로 끌어들입니다. 이제 플러그를 뽑습니다. 보통 모기가 밖으로 나가지 못하도록 테이프로 붙여놓은 작은 출입문이 있는데, 이 문을 열고 노즐을 삽입한 뒤 전원을 켜서 포집하는 데 사용합니다.모기들을 내부로 유인한 후, 노즐 상단을 막아 저장소에 모기들이 있는 것을 확인합니다. 그다음 모기들을 마취시켜야 하므로, 이 저장소를 얼음 바스켓에 넣고 얼음으로 덮은 뒤 모기들이 진정될 때까지 기다립니다.이제 다음 단계인 모기 주입 과정입니다. 이를 위해 nano jet two를 사용하겠습니다. 이 기기는 제가 잡고 있을 완드 부분으로 구성되어 있으며, 여기에는 모기에게 액체를 주입할 바늘이 포함되어 있습니다.채우기 및 비우기 버튼이 있으며 바늘로 액체를 흡입하거나 배출하는 역할을 하는 컨트롤 패널입니다. 그리고 이것은 풋스위치입니다. 이것은 바닥에 놓이게 됩니다.발로 이를 밀면 적절한 부피의 한 방울이 모기에게 분사됩니다. 모기를 얼음 위에 두는 동안, 콜드 블록을 0°C에서 2°C로 설정하여 워크스테이션을 준비합니다. 이 콜드 블록에는 평평한 어댑터가 있으며, 그 위에 유리 슬라이드가 장착되어 있습니다.이렇게 하면 모기들을 조작하는 동안 움직이지 않게 고정할 수 있습니다. 또한, 이러한 유리 모세관 바늘 하나를 준비하겠습니다. 이것은 일반적인 유리 모세관 튜브를 가열하고 중간 부분을 당겨서 바늘 형태로 만든 것입니다.그리고 이것은 액체를 담는 용기입니다. 그리고 이것은 모기에게 액체를 주입하고 분배하는 데 사용할 도구입니다. 다음으로 해야 할 일은 주입용 완드에 모세관 바늘을 장착하는 것입니다.노즈피스(nose piece)를 분리합니다. 내부 링이 제조사의 지침에 따라 배치되었는지 확인하십시오. 유리 니들의 팁이 부러지지 않도록 주의하며 노즈피스 안으로 밀어 넣습니다.고정이 완료되면, 완드(wand)의 바늘을 모세관 바늘

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 실험실에서 뒤쪽 아노 펠 레스 gambiae하는 데 사용되는 일반적인 기법을 보여줍니다. 실험실 모기를 돌보는위한 방법은 혈액 먹이 어른 pupae에 애벌레에서 유기체의 생명주기의 모든 단계를 통해 증명하고 있습니다.

모스키토 리어링 (A. gambiae)에 대한 프로토콜

이 프로토콜에서 우리는 함께 RNAi - 중재 유전자 입을를...

RNAi - 중재 유전자 최저 및<em&gt; VIVO에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; 모기

RNA-Seq 분석은 비모델 유기체에서 적응 형질의 분자 토대를 식별하는 데 점점 더 중요해지고 있습니다. 여기에서는 모기 사육에서 RNA 염기서열 분석 및 RNA-Seq 데이터의 생물정보학 분석에 이르기까지 diapause와 non-diapause Aedes albopictus 모기 사이에 차등적으로 발현된 유전자를 식별하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

아시아 타이거 모기에 Photoperiodic 휴면의 RNA-서열 분석을위한 실험 및 생물 정보학 프로토콜, Aedes albopictus

말라리아 전염 모기는 분자 기술을 통해서만 감지할 수 있는 역학적으로 중요한 여러 가지 특성을 가지고 있습니다. MALDI-TOF 기반 SNP 유전형 분석 플랫폼을 활용하여 말라리아 매개체의 여러 주요 특성(종, 살충제 내성, 기생충 감염 및 숙주 선택)을 동시에 검출할 수 있는 분석을 개발했습니다.

말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석

여기서 우리는 유충 섭취 RNA 나노 입자 / 키토산의 사용을 통해 질병 벡터 모기 유전자 기능을 억제 간섭하는 절차를 설명한다.

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

RNA interference (RNAi)는 유전자 기능을 밝히는 데 매우 유용한 도구입니다. 그러나 성체 이전 단계에서 RNAi를 사용하여 유전자를 표적으로 하는 능력은 주요 인간 말라리아 매개체인 Anopheles gambiae에서 제한됩니다. 번데기 발달 중 직접 주입을 통해 유전자 기능을 감소시키는 RNAi 프로토콜에 대해 설명합니다.

에 RNAi의 트리거 배달<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt; 번데기

이 프로토콜 우리가 표준화 하 고 몇 년 동안 모기와 집 파리의 hemolymph를 직접 핵 산의 특정 수량을 제공 하는 데 사용 하는 microinjection 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 최소 주입 죽음 귀착되 고 통치의 복용량 상관 측정을 허용 한다.

재현할 수 dsRNA Microinjection 및 산란 검정 집 파리 모기에

이 양파르트 갈4-UAS 시스템은 Anopheles 감비아에서 기능성 유전 분석을 허용하는 제어된 스파티오 측량 방식으로 유전자 발현을 수정하기 위한 다목적 도구입니다. 이 시스템을 사용하기 위해 설명된 절차는 형광 단백질 마커 및 배아 고정을 위한 pupae의 반 표준화된 복제 전략, 섹스링 및 검열입니다.

Anopheles 감비아에서 기능 유전학을 위한 GAL4-UAS 시스템을 이용하십시오

이 프로토콜은 gRNA 유도 Cas9 분열 및 DNA 수리 에 따른 표적 부위에서 비균성 최종 결합(NHEJ) 이벤트의 식별 및 정량화를 위한 분석을 포함하여 디지털 물방울 PCR(ddPCR)에 대한 실험용 설정에 DNA 추출에서 단계를 제공합니다. 이 방법의 그밖 용도는 다형성 검출 및 유전자 편집 이체 확인과 같은 응용을 포함합니다.

유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR

이 문서에서는 CRISPR/Cas9에 의해 유도된 인델의 신속한 식별을 위한 프로토콜과 고해상도 용융 분석을 사용하여 모기 Aedes aegypti 의 돌연변이 라인을 선택하는 것에 대해 자세히 설명합니다.

모기 Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/ Cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출

세균에 의해 생산된 dsRNA의 경구 투여는, 예쁜꼬 마선충에서 일상적으로 사용되는 RNA 간섭(RNAi)에 대한 전달 방법으로서, 성인 모기에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 주사를 사용하지 않고도 강력한 역 유전학 연구 및 전송 차단 벡터 연구를 가능하게합니다.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

배우세요 Anopheles gambiae 모기에서 RNAi를 이용한 유전자 침묵화 기법을 통한 말라리아 매개체 저항성 연구 방법을. 이 프로토콜은 흉부 주사를 통해 유전자 기능을 탐구하는 데 활용됩니다.

성인 모기 (A. gambiae)에서 RNAi의 Assays을위한 프로토콜

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