Name: 의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 배우세요 GFP 발현 마우스 배아의 전지형 슬라이스 제작법으로 말초 신경 성장을 실시간 형광 현미경으로 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 발달 신경생물학 연구에 활용됩니다.

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저자는 마우스 배아 5시 슬라이스 문화를 수행할 수있는 아이디어의 원본 소스를 인정합니다. 우리는 촬영하는 동안 우리의 심부름꾼 역할에 대한 관대한 과학 지원과 안나 Degen에 대한 요아킴 커쉬을 인정하고 싶습니다. 그리고 하이 델베르크 (우수 클러스터 셀룰러 네트워크)의 대학이 작품은 독일 연구 재단 (Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9 도이치 Forschungsgemeinschaft)에 의해 재정 지원되었다.

1 부 : 깔끔히 및 culturing 준비. <ol><li> 매체 (DMEM, 25 % 1X HBSS, 25 % 태아 소 혈청, 0.5 % 포도당, 1 ㎜의 글루타민, 2.5 MM HEPES, 산도 7.3) 및 3 - cm Millicell - CM 0.4 - μm의 문화를 깔끔히 10 - cm 조직 문화 플레이트 준비 멤브레인 삽입하고 37 인큐베이터에 보관 ° C와 5% CO 2. </li><li> 그것이 약 37 숙박 있도록 전자렌지에 PBS에 4% 낮은 용융 점 아가로 오스를 가열하고 가열 접시에 보관 ° C. </li><li> PBS (140 MM NaCl, 2.7 KCl MM 10 MM 나 2 HPO 4, 1.8mM KH 2 PO 4) 얼음에 장소 10 cm 세균 배양 접시를 채우십시오. </li><li> 마이크로톰 냉각 장치를 설정하거나 버퍼 트레이 및 냉각 요소가 사전에 냉각 그것에 냉장고에 저장됩니다 보장합니다. </li></ol> 2 부 : 엠브료 포함. <ol><li> 자궁에서 배아를 해부하다하여 GFP 발현을 확인하기 위해 거꾸로 형광 현미경으로 그들을 검사합니다. </li><li> 거꾸로 10 cm 페트리 접시와 동양 그들 플레이스 배아 과도한 PBS를 제거하는 왓먼 종이 스트립을 사용합니다. </li><li> 이 자리에서 문제를 해결하기 위해 배아에서 아가로 오스를 적용합니다. 아가로 오스는 고체화하자. </li><li> 면도날로 절단하여 배아를 둘러싼 지역을 제한한다. </li><li> 그 반대편에 포함된 배아를 회전합니다. </li><li> 배아가 완전히 내장된 수 있도록 배아 조직에 대한 추가 아가로 오스를 적용합니다. </li><li> Loctite 406, "Krazy의 접착제"와 유사한 특수 접착제를 사용하여 vibratome 척에 깨끗한 가장자리와 마운트와 아가로 오스 블록을 준비합니다. </li></ol> 파트 3 : 프로 시저를 칼자국. <ol><li> precooled 버퍼 트레이 및 냉각 요소를 설정합니다. </li><li> 붙어 조직과 척을 넣고 1X HBSS를 (CA 2 + - MG 2 + 무료 HBSS, 10 MM의 HEPES 버퍼 산도 7.3, 500 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신)까지 커버 추가합니다. </li><li> 삽입 및 precleaned (70 % 에탄올) 마이크로톰 블레이드를 수정. </li><li> 350을 준비 - 450 μm의의 조각들을 조직 문화 접시에 단축 유리 파스퇴르 pipettes를 사용하여 전송 얼음이 있었죠. </li><li> 포셉 한 켤레를 사용하여주의 깊게 각 슬라이스 문화 세포막을 Millicell로 전송에서 아가로 오스를 제거합니다. 약 4 조각은 문화 매체 6 ML 가득한 10 cm 조직 문화 판에서 한 막에서 교양 수 있습니다. </li><li> 37 조각 품어 ° C와 5% CO 2 (문화 매체 : DMEM, 25 % 1X HBSS, 25 % 태아 소 혈청, 0.5 % 포도당, 1mM 글루타민, 2.5 MM HEPES, pH를 7.3). 한 시간 경과 영상 시리즈를 수행하는 경우 한 매체 상수의 볼륨을 유지합니다. 짧은 시간 프레임에 대한 시간 초과 이미징 시리즈의 경우에는 그것이 같은 매체를 떠나 충분하다. 더 이상 문화 기간 변경에 대한 이후 12~20시간 것이 좋습니다. </li></ol> 파트 4 : 현미경에서 이미징 척추 신경 가지. <ol><li> 직립 형광 현미경으로 슬라이스와 Millicell 문화 세포막을 포함, 10 cm 조직 문화 플레이트를 삽입 이미지 척수 신경. </li><li> 다음 이미징 시점 동안 올바르게 위치에 현미경의 무대에서 Millicell 문화 점막의 방향을 라벨. </li><li> 사용하는 이미지 척추 신경 가지 4X (숫자 조리개 [NA] 0.1), 10X (NA 0.3), 또는 20x (NA 0.5) 목표. </li></ol> 그림 1은 4X와 10X 목표와 문화를 20 시간 동안 척추 신경 가지를 묘사한 영상 시리즈를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2309/2309fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> homozygous tauGPF 배아의 가로 통에 척수 신경 가지의 그림 1 이미징 시리즈. * 복부 척수, 화살표 = DRG의 = 모터 뉴런. 슬라이스의 지느러미 (D) - 복부 (V) 축에 표시됩니다. Scalebars : 200 μm의.

<ol><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).</li>
<li>Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+of+identified+projection+neurons+in+cat+visual+cortex+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices.</a> J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).</li>
</ol>

중간 회임 마우스 배아의 배아 슬라이스 문화 (E10 - E12)를 준비하는 방법의 광범위한 비교에서, 우리는 vibratome가 문제없이 문화의 전반적인 생존과 재현성 모두와 관련하여 가장 신뢰할 수있는 결과를 생산하는 것을 관찰했습니다 신경 가지 패턴. 반대로, 조각이 맥일웨인 조직 헬기 3 완전히 inviable 것으로 판명을 사용하여 준비 하였다. 우리는 원래 배아의 전체 쓰레기가 동시에 400 μm의 섹션 1을 생산하는 화격자 절단 주변에 순차적으로 싼 텅스텐 와이어로 깔끔히 준비한 수있는 단두대 방법 4, 고용. 이 기술은 준비 속도의 장점을했다지만, 그것은 배아마다 대부분의 한 가능한 부분을 굴복하고 가지 매개 변수의 변화의 큰 금액을 보여주었다. 이러한 이유로, 우리는 vibratome 기반 방식은 준비에 긴 시간에도 불구하고 우수한 선택이라고 생각합니다. 필요에 의해이 솔루션은 vibratome 필요하지만, 결과는 다른 &quot;낮은 기술&quot;방...

<table><tbody><tr><td>HBSS 10x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14180</td><td></td></tr><tr><td>해부 도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>L.M.P. 아가로스</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann 종이</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>길이를 줄인 파이어 폴리싱 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 100x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>바이브라톰</td><td>Microm International</td><td>HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>analySIS</td><td>Soft Imaging System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM 인서트</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG 50</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 배양 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633171</td><td></td></tr><tr><td>LOCTITE 406</td><td>Henkel Corp</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>none</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9105.2</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>x4 대물렌즈</td><td>Olympus Corporation</td><td>PL series</td><td></td></tr><tr><td>x10 대물렌즈</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLFL &amp;#8211;PH series</td><td></td></tr><tr><td>필터</td><td>Olympus Corporation</td><td>U-MNIBA2</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Soft Imaging System</td><td>SIS F-View II</td><td></td></tr><tr><td>가열 챔버용 장비</td><td>Leica Microsystems</td><td>CTI-Controller 3700 및 인큐베이터 S #11531171</td><td></td></tr></tbody></table>

의 organotypic 슬라이스 문화 gfp - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

다양한 목적을 위해, organotypic 조각으로 마우스 배아의 전의 생체내의 재배가 바람직합니다. 예를 들어, 우리는 모두 영화의 innervation에 가능성을 허용, 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 향상된 버전이 독점적으로 개발 중심과 주변 신경계 하나의 뉴런에서 표현되는 유전자 변형 마우스 라인 (tauGFP)를 채택 forelimb가와 약리과 유전 기법이이 과정을 조작합니다. 이러한 슬라이스 문화의 성공적인 재배에서 가장 중요한 매개 변수는 조각을 준비하는 방법입니다. 다양한 방법의 광범위한 테스트 후, 우리가 vibratome들이 일상적으로 몇 일 동안 생존하고, 가장 중요한을 보여 문화에 따라서 그러한 배아를 슬라이스하는 최선의 장치는 것을 발견, 시대에 발전 특정 방식. 중반에 태동하고 배아의 경우, 이것은 척수와 지느러미 루트 신경의 주변과 골격 및 근육 조직의 적절한 판단에 자신의 목표에 척수 신경의 정상적인 파생물이 포함되어 있습니다. 슬라이스 준비 후 2 일을 위해 공부를 할 수있는 표준 조직 문화 인큐베이터에서 재배 400 마이크로 미터 조각 -이 작품에서 우리는 300로 (E) E10 E12에 배아 일 전체 배아를 처리하는 방법을 제시. 이 방법의 성공을 위해 중요 각각의 아가로 오스 - 임베디드의 배아를 슬라이스하는 vibratome의 사용입니다. 이 인터페이스 문화 기술에서 발생하는 중간의 작은 볼륨에 배치 Millicell 문화 막 삽입,시 조각의 재배옵니다. 7 배아의 평균 한 쓰레기는 정기적으로 인해 태아의 나이뿐만 아니라, 조각의 두께에 약간 차이가 최소 14 조각 (태아 당 forelimb 영역로부터 2-3 조각)을 생산하고 있습니다. 교양 조각의 80 % 정도는 culturing 기간 2 througout 측정할 수 신경 가지를 보여줍니다. tauGFP 마우스 라인을 사용하는 대표적인 결과가 증명하고 있습니다.

우리는 주변 신경 가지의 재배와 시간 경과 영상을위한 중간 회임 마우스 배아의 organotypic 조각을 준비하는 방법을 제시한다.

의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

다양한 목적으로 마우스 배아를 장기형 절편으로 엑스비보(ex vivo) 배양하는 것이 유용합니다. 예를 들어, 본 연구에서는 ...에서 형질전환 마우스 라인(tauGFP)을 이용합니다.

이 절차의 전체적인 목표는 척수 신경의 성장을 이미지화하기 위해 GFP를 발현하는 생쥐 배아의 전지 부위에서 기관형 횡단 절편을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 배아를 저융점 agarose에 임베딩하고, 조직과 agarose의 영역을 관심 부위로 제한함으로써 달성됩니다. 그 후 agarose 블록을 슬라이싱을 위해 마운트합니다.그런 다음 블록에 내장된 배아를 진동 절편기로 절단합니다. 절차의 마지막 단계는 절편 주변의 agarose를 제거하고 절편을 배양 플레이트로 옮기는 것입니다. 이후 절편을 배양하면 말초 신경이 주변부로 성장하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 형광 현미경으로 관찰 가능합니다.길로틴이나 조직 절단기(tissue chopper)와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 슬라이스가 더 제어된 방식으로 생성되며 배양 시 생존력이 향상된다는 점입니다. 따라서 이 방법은 척수 신경의 유도 및 성장을 관찰하는 것과 같은 발달 신경생물학 연구에 도움이 될 수 있으며, 이 절차의 시연은 Isabel barman이 진행하겠습니다. 먼저 6 mL의 배양액이 담긴 10 cm 조직 배양 플레이트와 0.4 µm 배양 막 인서트가 포함된 3 cm Millicell-CM을 준비하여 이 절차를 시작하십시오.37°C, 5% carbon dioxide 조건의 인큐베이터에 보관하십시오. 다음으로, PBS에 희석한 4% low melting point agarose를 전자레인지로 가열한 후, 약 37°C로 유지되도록 가열판 위에 올려둡니다. 10 cm 세균학용 페트리 접시에 PBS를 채운 뒤 얼음 위에 놓아둡니다.그런 다음 Viome 냉각 장치를 설치합니다. 배아 매몰 작업을 수행하기 전까지 버퍼 트레이와 냉각 요소를 냉동고에 보관하여 완전히 얼립니다. 먼저 자궁에서 배아를 적출하십시오.도립 형광 현미경으로 관찰하여 GFP 발현 여부를 확인합니다. 다음으로, 왓만 종이 조각을 사용하여 배아의 방향을 잡은 뒤 10 centimeter 페트리 접시(뒤집힌 상태)에 놓고 과잉 PBS를 제거합니다. 배아를 고정하기 위해 aros를 적용합니다.방향이 잡힌 상태에서 aros가 굳을 때까지 기다린 후, 과도한 aros와 필요에 따라 배아의 중간 부분 주변 조직을 다듬습니다. 매립된 배아를 반대편으로 회전시킵니다. 배아가 완전히 매립되었는지 확인하기 위해 배아 조직에 aros를 추가로 도포합니다.aros가 응고될 때까지 기다립니다. 가장자리가 깨끗한 배아 매립 aros 블록을 준비합니다. 마지막으로, Loctite 4 0 6를 사용하여 샘플을 viome 척에 접착합니다.사전 냉각된 버퍼 트레이와 냉각 소자를 준비합니다. 접착된 조직이 있는 척(chuck)을 바이어옴(viome) 위에 놓습니다. 조직이 완전히 잠길 때까지 척에 X-H-B-S-S를 1회 추가합니다.미리 세척된 viome 블레이드를 블레이드 홀더에 삽입합니다. 다음으로, 두께 약 350에서 450 µm의 횡단면 절편을 준비합니다. 각 절편은 HM six 50 V 마이크로톰을 사용하여 절단합니다.길이를 짧게 자른 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이스를 조직 배양 플레이트로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오. 핀셋을 사용하여 모든 슬라이스에서 모세혈관(aros)을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음, 6 mL의 예열된 배지가 채워진 10 cm 배양 플레이트 내의 밀리셀 배양 막(milli cell culture membranes)으로 슬라이스를 옮기되, 각 막에 4개의 슬라이스가 배치되도록 하십시오.타임랩스 이미지 촬영 시작 전과 촬영 간격 사이에 절편을 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 절편이 놓인 Millicell 세포 배양 막이 포함된 조직 배양 플레이트를 정립 형광 현미경 아래에 두고, 4x, 10x 또는 20x 대물렌즈를 사용하여 척수 신경을 찾고 척수 신경의 성장을 촬영합니다. 온도와 CO2 농도가 일정하게 유지되는 장치가 없는 경우, 다음 촬영 시점에 정확하게 다시 배치할 수 있도록 현미경 스테이지 위 Millicell 세포 배양 막의 방향을 표시해 둡니다.여기에 표시된 환경은 tau GFP 동형접합체 배아의 횡단면 절편에서 24시간 배양하는 동안의 척수 신경 성장 이미징 시리즈입니다. 별표는 복측 척수의 운동 신경세포를 나타내며 화살표는 DRG를 나타냅니다. 상단 패널은 4배 대물렌즈를 사용하여 촬영되었으며 하단 패널은 10배 대물렌즈로 촬영되었습니다.이 영상을 시청한 후, 척수 신경 성장을 이미징하는 데 사용할 수 있는 생체 조직 모방 마우스 배아 횡단 절편을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

실시간 이미징 배아 조직은 오랜 기간 동안 도전합니다. 여기에서 우리는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 오랜 기간 동안 여자가 척수의 세포와 하위 세포 변화를 감시하기위한 분석을 제시. 이 기술은 신경계와 개발 배아의 다른 지역에 맞게 조정 할 수 있습니다.

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여기에서 우리는 필요한 도구를...

생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상

이 비디오는 형질전환 마우스 배아의 안구 운동 절편의 생체 외 배양 및 이미징을 보여줍니다. 배아는 분리되어 아가로스에 박혀 있습니다. 비브라톰을 사용하여 안구 운동 핵과 눈을 포함하는 절편을 얻습니다. 슬라이스는 배양에서 유지되고 형광 현미경을 사용하여 이미지화됩니다.

Transgenic Mouse Embryos의 안구 운동 절편의 Ex Vivo Culture and Imaging of Oculomotor Embryos

신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

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전뇌와 소뇌의 슬라이스 배양 시스템을 사용하여 NG2 세포와 희소돌기아교세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다.  이 방법을 사용하면 조직 세포 구조를 유지하면서 세포 외 환경을 쉽게 조작할 수 있는 희소돌기아교세포 계통 내에서 세포의 증식 및 분화 역학을 조사할 수 있습니다.

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

우리는 유전자 조작 마우스 개발에서 감각 축삭 성장 표현형을 평가하는 효과적인 방법으로 전체 동물에서 말초 통각 수용기 축삭돌기 이미징을 위해 태아 마우스를 유전형, 염색 및 준비하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

이 프로토콜은 방사형으로 이동하는 피질 뉴런의 직접 관찰에 대한 지침을 제공합니다. utero electroporation, organotypic 슬라이스 문화, 그리고 시간 경과 공 촛점 이미징은 결합 뉴런에 관심 유전자의 overexpression 또는 downregulation의 효과를 직접적이고 동적으로 연구하고 개발하는 동안 그들의 차별을 분석합니다.

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여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

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배아 GFP 발현 마우스에서 전 Vivo Oculomotor 슬라이스 배양 Oculomotor 신경 파생의 시간 경과 화상 진찰을 위한

이 프로토콜은 현장 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학 을 연구하는 간단하고 강력한 방법을 보여줍니다. 생체외 생리학적으로 관련된 급성 뇌 조각을 준비하는 방법을 설명하고 사용자 친화적인 분석 파이프라인을 제공합니다.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

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의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

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