크레이 레그 신근 근육에 높은 및 낮은 출력 NMJs의 생리 레코딩

이 실험 절차의 전반적인 목적은 가재의 신근(extensor muscle)에서 형태학적 염색과 전기생리학적 기록을 통해 위상성(phasic) 및 긴장성(tonic) 운동 말단을 노출시키고 구분하는 방법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 중간 크기 가재의 첫 번째 또는 두 번째 보행각을 떼어내고, meite 마디의 큐티클을 절개한 뒤 굴근(flexor muscle)을 제거합니다. 이렇게 하면 신근과 신경다발이 노출됩니다.

절차의 두 번째 단계는 axon과 신경 말단을 시각화하기 위해 4-ethyl amino sterile 및 methyl peritoneum iodide, 또는 4D2ASP로 표본을 염색하는 것입니다. 절차의 세 번째 단계는 tonic 및/또는 phasic 뉴런을 선택적으로 자극하는 동시에, 근섬유에서 유발된 EPSP의 세포 내 기록을 수행하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 국소 전극을 사용하여 말단으로부터 자발적 및 유발된 qu 이벤트를 기록하는 것입니다.

최종적으로, 면역형광 현미경 검사와 전기생리학적 방법을 통해 형태적 및 생리학적으로 긴장성(tonic) 말단과 위상성(phasic) 말단을 구분하는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 근육 피로, 시냅스 억제 및 시냅스 교차 간섭과 같은 분야의 시냅스 생리학 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 실험은 가재의 집게발에 집히지 않도록 주의하며 가재를 잡는 것으로 시작합니다.

이시아 포드(isia pod) 마디에서 다리를 몸체로부터 분리하십시오. 이시아 포드 마디를 강하게 집으면 가재가 첫 번째 보행 다리를 자절(automize)하거나 자연스럽게 떨어뜨리게 됩니다. 가재의 출혈이 멈추면 다시 보관 탱크에 넣습니다.

가재를 희생시키지 않습니다. 절개 시 표본을 쉽게 돌릴 수 있도록 다리를 티슈 페이퍼 위에 놓습니다. 가재 다리의 바깥쪽(외측)이 해부 접시의 위쪽을 향하도록 돌려 놓습니다.

일반적으로 아치형 부분이 위를 향하게 합니다. 메스 날 브레이커에 부착된 날카로운 면도날을 사용하여 그림에 표시된 패턴을 따라 메이트(meite) 분절 내의 큐티클을 식각합니다. 메이트-카포드(meite carpod) 관절을 따라 등쪽에서 배쪽으로 절개할 때 원위부로 너무 깊게 자르지 않도록 주의하십시오.

이 절개를 통해 하단의 다리 근육 위에 있는 메이테(meite)에 창이 형성됩니다. 큐티클은 현재 상태로 둡니다. 준비된 시료를 가재 생리식염수가 담긴 해부 접시에 놓습니다.

이 단계에서 미세 핀셋을 사용하여 carpod 마디의 중앙과 ischia pod 마디의 등쪽에 핀을 고정하고, 큐티클에 절개한 창을 원위단부터 약간 들어 올린 후, 면도날을 사용하여 굴근 섬유를 큐티클에서 분리하여 절단합니다. 원위단에서 근위단 방향으로 계속 절단한 다음, 마지막으로 큐티클의 창을 들어 올려 제거합니다. 신근을 노출시키려면 상부에 있는 굴근을 반드시 제거해야 합니다.

핀을 사용하여 굴근의 힘줄을 굴근으로부터 밀어내어 분리합니다. 그런 다음 Mari poddy carpod 관절 부위에서 힘줄을 절단합니다. 영상에 표시된 것처럼, 절단하기 전에 힘줄을 다리 강(cavity)에서 조심스럽게 끌어내어야 하며, 힘줄의 내측에 위치한 주 다리 신경이 아닌 힘줄만 절단하도록 각별히 주의하십시오.

핀셋으로 절단된 건 부위를 잡고, 굴곡근을 위쪽 방향으로 들어 올려 다리에서 분리합니다. 신전근으로 가는 신경을 노출시키기 위해, 주족신경을 중수지절 관절 부위에서 절단하고 주족신경을 신전근 너머로 조심스럽게 당겨 젖힙니다. 주족신경에서 신전근 신경을 분리할 때는 주족신경의 원위부 단단을 준비물 측면으로 부드럽게 당기면 더 효과적입니다. 주족신경을 신전근 너머로 젖혀 벗겨낼 때, 억제성 축삭의 작은 가지들을 절단해야 할 수도 있습니다.

신경 다발은 메틸렌 블루 염색으로 시각화할 수 있습니다. 하지만 위 이미지의 전기생리학적 기록에는 메틸렌 블루를 사용하지 않습니다. 빨간색 화살표는 관심 대상인 신경 경로를 표시합니다.

대상 신경다발은 메레포드(merepod)가 있는 근위단 근처에서 주 다리 신경으로부터 갈라져 나오는 더 큰 다발입니다. 축삭 분지와 신경 내에서 쉽게 확인되는 두 개의 축삭에 유의하십시오. 이제 신경과 근육이 노출되었으므로, 실험에 사용할 장치를 준비하십시오.

세포 내 및 세포 외 기록은 표준 헤드 스테이지와 증폭기를 사용하여 수행합니다. Axon Clamp 2B 증폭기와 1XLU 헤드 스테이지 모델을 사용합니다. 세포 내 전극 하나와 세포 외 전극 두 개를 포함하여 총 세 개의 전극이 필요합니다.

두 개의 세포외 전극은 신경을 자극하고 시냅스 유발 및 자발적 사건을 기록하는 데 사용됩니다. 국소 전극을 화염 연마(fire polish)하고 가열 장치 위에서 살짝 구부립니다. 국소 전극을 식염수로 채운 후, 자극 전극 홀더에 배치하고 자극기 와이어가 식염수에 닿도록 삽입합니다.

이 장치는 grass P 15 자극 분리 장치에 연결되어 있으며, 이는 다시 S 88 grass 자극기에 연결되어 있습니다. 전기생리학적 기록 중에, 축삭을 시각화하여 염색하기 위해 D two ASP 생체 염료를 사용합니다. 배양액을 5 µM의 four D two as per 염료가 포함된 식염수로 교체하여 5분 동안 처리합니다. 5분 후, 접시에 가재 생리식염수를 다시 채우고, 표본을 현미경 아래에 배치한 뒤 Forex 대물렌즈를 사용합니다.

10배 접안렌즈에서 자극 전극을 관심 영역으로 이동시킵니다. 다음 단계는 매크로 패치 자극 전극의 루멘을 위상성(phasic) 또는 강직성(tonic) 축삭 위에 배치하는 것입니다. 4가지 염료와 2가지로 염색된 표본의 이 사진을 보면, 강직성 축삭이 미토콘드리아 함량이 더 많아 더 밝게 보이는 것을 알 수 있습니다.

형광 현미경으로 관찰했을 때, tonic 말단은 수많은 정맥류(varicosities)를 나타내며 phasic 말단은 더 가느다란 특성을 보입니다. 20배 대물렌즈를 사용하여 전극을 tonic 또는 phasic 축삭 위에 배치합니다. 여기서는 전극을 tonic 축삭 위에 배치하고 있습니다.

세포 내 전극을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하고, 세포 내 전극을 신근 세포에 삽입합니다. 이는 세포 내 흥분성 돌발후전위(EPSP)를 기록하는 데 사용됩니다. 정성적 EPSP 기록을 위해 사용합니다.

두 번째 초점 전극을 마이크로 조작기에 장착합니다. 이는 기존의 세포 내 전극과 홀더를 제거하고 깨끗한 전극 홀더로 교체함으로써 수행합니다. 마이크로 조작기를 사용하여 두 번째 초점 전극의 루멘을 시냅스 정맥류(synaptic varicosity) 바로 위에 위치시킵니다.

전극과 씰 저항은 테스트 전류 펄스를 전극으로 통과시켜 측정합니다. 본 실험에서 씰 저항은 0.3에서 1 MΩ 범위였으며, 전극 저항은 0.5에서 1 MΩ 범위였습니다. 씰 저항은 기록 전 과정 동안 모니터링할 수 있습니다.

자극을 시작할 준비가 되면, scope 5.0 소프트웨어를 켜고 분리된 축삭에 자극을 가하기 시작합니다. 신경다발에서, 흡입 전극을 통해 강직성 축삭을 자극하고 근섬유의 EPSP를 세포 내 또는 세포 외 전극으로 기록합니다. EPSP는 power lab forest 인터페이스를 통해 컴퓨터로 기록됩니다.

긴장성 축삭(tonic axon)을 자극한 후, 자극 전극을 위상성 축삭(phasic axon)으로 이동시켜 신경 자극 후 실험을 반복할 수 있습니다. 세포 내 전극은 긴장성 및 위상성 운동 뉴런 활동 모두에 반응하여 생성된 EPSP를 기록합니다. 긴장성 신경근 접합부의 시냅스 촉진은 여기에서 60 hertz 주파수로 각각 약 20회의 자극이 연속적으로 가해지는 일련의 자극 훈련에서 보여주는 바와 같이 신경 자극의 빈도에 따라 달라집니다.

다중 자극 시 발생하는 촉진 현상에 주목하십시오. 이 그림은 파란색의 20 hertz, 초록색의 40 hertz, 빨간색의 60 hertz 빈도로 긴장성 신경을 자극했을 때 생성된 EPSP의 진폭을 비교한 것입니다. 자극 빈도가 높을수록 뚜렷한 촉진 현상이 나타남을 확인할 수 있습니다. 긴장성 말단은 시냅스 효율이 낮지만, 여기에서 나타난 바와 같이 극적인 촉진 반응을 보입니다.

여기서는 강성(tonic) EPSP만 나타냈으며, 이후 위상성(phasic) 반응을 동일한 척도로 겹쳐서 보여줍니다. 강성 말단과 대조적으로, 위상성 말단은 정량적 효능(quantal efficacy)이 높지만 고주파 자극 시 시냅스 억제(synaptic depression)를 보입니다. 위상성 말단의 시냅스 억제 또한 여기에서 보여주는 바와 같이 자극 빈도와 관련이 있습니다.

30분 동안 5 Hz로 지속적으로 자극하면 신경근 접합부의 반응이 억제됩니다. 자극 빈도가 더 높을 경우, 적절한 자극을 통해 더 빠르게 억제될 것입니다. 가재의 신경근 접합부는 스파이킹이 없는 EPSP를 생성합니다.

이러한 EPSP는 이 근육들의 등급 전기 신호를 구성하는 정량적 특성을 조사하는 데 사용될 수 있습니다. 여기에서는 tonic 말단의 정량적 시냅스 반응을 보여줍니다. 모든 자극 시도가 정량적 이벤트로 이어지는 것은 아니라는 점에 유의하십시오.

각 유발 반응에 대해 낮은 빈도의 자극을 주면 양자 이벤트의 직접적인 계수가 가능합니다. 강직성 말단의 경우 양자 이벤트의 수를 쉽게 결정할 수 있습니다. 양자 이벤트를 계수함으로써, 위상성 운동 뉴런으로부터의 시냅스 반응 또한 동일한 방식으로 기록할 수 있습니다.

하지만, 유발 반응은 본질적으로 다중 단위(multi qual)의 특성을 가집니다. 평균 단위 함량은 편향의 평균 진폭 또는 면적을 자발적 사건의 평균 피크 진폭 또는 면적과 함께 사용하여 추정합니다. 마지막으로, 신근을 기다리는 동안 신경이 손상되지 않도록 굴근을 제거할 때 주의하십시오.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.