Name: 크레이 피쉬 Hindgut와 생리 실험 : 학생 실험실 연습 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 학습하세요 가재 후장 분리 및 수축 측정을 통한 생리학 실험 방법. 약리학적 약물 적용으로 수축 강도 변화 메커니즘을 탐구하고, 수용체 기능과 신경전달물질 작용을 이해하는 학생 중심 실습 모델입니다.

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켄터키 대학, 생물 학부, 학부 연구과 예술 &amp; 과학 대학 사무실에서 지원됩니다.

1. 소개 크레이 피쉬 hindgut의 가장 최근의 포괄적인 개요는 serotonergic 변조 및 innervation (Musolf 외., 2009 주로 초점을 맞추고 박사 바바라 E. Musolf (2007 년, 조지아 주립 대학, 애틀랜타, 조지아, 미국)에 의해 논문으로 준수되었다 ). 갑각류의 hindguts 먼저 Alexandrowicz들이 innervation의 다양한 측면을 설명하는 비교 해부학의 선구자 (Alexandrowicz, 1909)에 의해 100여 년 전에 공부했다. 연구는 전체 동물 osmoregulation에 hindgut의 전반적인 기능을 해결하고, (Musolf, 2007 리뷰를 참조) 여러 화합물에 의해 hindgut 수축성의 modulatory 제어를 검토, 근육의 레이어와 건축의 유형을 식별, 년간 계속했다. 그것은 hindgut의 항문 부분이 대변을 추방하기 위해뿐만 아니라 osmoregulation을위한 환경에서 물을 갈뿐만 아니라 행위 점에 유의하는 흥미롭습니다. 창자의이 지역은 앞으로 받아야이나 동물의 필요에 따라 연동을 반대 수 있습니다. Alexandrowicz (1909)은 갑각류 hindgut, 내부 신경 얼기 나중에 신경 전달 물질을 식별하고 특성화에 대한 풍부한 소스 것으로 판명 외부 신경 얼기를 innervating이 신경 plexuses 확인. 1950 년대 박사 에른스트 플로리에서 크레이 피쉬 hindgut에 대한 약리 연구 시리즈를 시작하고 수축은 아세틸콜린 및 관련 화합물에 의해 또한 에피네프린과 norepinephrine (플로리 1954)에 의해 변조된 것을 보여주었다. 플로리로 알려진 억제 물질의 발견자 "팩터 - I은"왕새우의 GI 시스템 (플로리, 1961) 등 다양한 준비,이 물질의 효과를 공부했습니다. 팩터 - 내가 나중에 GABA로 표시되었다. 따라서, 왕새우 hindgut은 시냅스 억제의 초기 연구에 중요한 역할을했습니다. GABA의 발견에 따라 다른 putative 송신기도 hindgut의 plexuses와 관련된 것으로 표시되었으며 생리 반응을 이끌어내는 수 있습니다. 이 orcokinin의 펩티드를 (NFDEIDRSGFGFN 및 AFDEIDRSGFGFN; Bungart 외 1994;.. Dircksen 외 2000), (머시 외 1,997 RYLPG - 오.) proctolin, 이러한 트랜스 미터는 도파민 (. Elofsson 외 1968. Elekes 외 1988) 포함 , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen 외 2000.) 및 myosuppressin의 펩타이드 (머시 외 1997;... 대부분 pQDLDHVFLRFamide, CF Stemmler 외 2007). 이러한 물질들은 각각 자연 hindgut의 수축을 modulates하고, GABA를 제외한 모든이 흥분성의 것으로 나타납니다. hindgut는 글루 탐 산염과 quisqualate (. 존스, 1962; 외 2,003 롱)에 대응하지만, glutamatergic innervation에 대한 명확한 증거는보고되지 않았습니다. 다양한 송신기의 효과를 중재 세포내 메신저는 대부분 미개척지만, 수축 (Knotz &amp; 머시, 1995)을 향상시키기 위해 도파민의 능력에 캠프의 참여에 대한 증거가 있습니다. 갑각류의 hindgut가 denervation 다음과 같은 자발적 계약 있지만, 이러한 수축은 일반적으로 연약하고 (; Winlow &amp; 라베락, 1972a 웨일스, 1982) 비계 획 있습니다. 연동 운동은 분명히 지난 복부 신경절 (Winlow &amp; 라베락, 1972a, B, C)에서 발생, 중추 신경 시스템에서 조정 모터 출력을 필요로합니다. 크레이 피쉬에서는, 모터 출력은 세포 기관은 지난 복부 신경절 (Kondoh &amp; 히사다, 1986)에서 현지화된 아르 75 axons를 포함하는 7 일 복부 루트를 통해 hindgut으로 수행됩니다. 적어도 펩티드 중 일부는 지난 복부 신경절 (..; 머시 외 1991b; Dircksen 외 2,000 Siwicki &amp; 비숍, 1986)에서 발생하는 뉴런에서 hindgut 신경 얼기에 공급되는 나타나지만 도파민이 더의 뉴런에 의해 제공됩니다 앞쪽에 신경 (머시 외. 1991a). 7 회 복부 루트를 통해 모터 출력이 큰 조정 수축에 필요한 있기 때문에, 그것은 위에 나열된 putative 송신기의 일부 또는 전체가 연동하는 어떤 방법으로 기여할 가능성이 높습니다. 그들의 상대적인 기여도 그러나, 알려져 있지 않습니다. 어떤 통찰력은 별도로 원형과 세로 근육 (머시 &amp; 리, 2002) 그들의 효과를 연구하여 얻은 수 있습니다. 소화되지 않은 음식의 움직임을 제어뿐만 아니라, 갑각류 hindgut과 관련된 신경 얼기는 털갈이과 관련된 중요한 내분비 기능을 게임에 나타납니다. 게, Carcinus maenas의 hindgut 물의 이해에 역할을 제안하고 털갈이과 관련된 부종, 탈피 (웹스터 외. 2000) 중 갑각류의 hyperglycemic 호르몬 및 관련 전구체 펩타이드를 공개 내분비 세포가 포함되어 있습니다. 따라서, 갑각류 hindgut 몇 가지 중요한 생리 과정에 참여하고 있습니다. 이 보고서는 주로 고급 고등학교와 실험에 참가 생리 과정에 학부 학생들을위한 교육 도구입니다. 의미뿐만 아니라 hindgut 계약과 기능은 학생들이 해결될 수있는 방법을 뒤에 잠재적인 메커니즘. 약리 대리인, 신경 전달 물질, 그리고 neurohormones 사용되며, 투약 - 반응 곡선은 생리 및 약리 데이터를 수집하고 해석하는 방법에 학생들을 참여되는 건설 것입니다. agonists 및 antagonists에 관한 수용체 기능의 일반적인 이해도 형성될 수 있습니다. 학생들은 또한 통계 분석을 위해 그래픽 형태의 데이터를 제시 배우게됩니다. 크레이 피쉬 hindgut에서 수축을 해부하다하고 기록하는 것은 매우 쉽습니다. 해부 준비에 창자가 쉽게 외인성 물질에 노출됩니다. 연동 활동의 변경은 시각이나 또한 수축의 힘을 확인할 수 있습니다 힘 변환기와 모니터링할 수 있습니다. 때문에 bioassay 준비로서 단순하고 신뢰성, 크레이 피쉬 hindgut 아직도 연동, 모터 출력 및 근육 수축의 변조 및 수용체 기능의 메커니즘에 대해 많은 연구 질문 조사에 매우 유용합니다. hindgut는 행동의 구체적인 메커니즘에 대한 검사 살충제, crustaceancides 및 오염 물질에도 유용합니다. 2. 방법 2.1) 자료 <ul><li> 왕새우 </li><li> 크레이 피쉬 살린 </li><li> 절개 장비 (거친 &amp; 고급 가위, 굵은 &amp; 멋진 포셉) </li><li> Sylgard 바닥 페트리 접시 </li><li> 스틸 해부 핀 </li><li> 비커 (화학 솔루션을 개최) </li><li> parafilm (솔루션을 다루는 및 믹싱을위한) </li></ul> 2.2) 해부 <ol><li> 신체 길이 크레이 피쉬 (Procambarus clarkii) 측정 6-10센티미터는 절개가 시작하기 전에 동물을 마취시킬 수 5-10분 위해 얼음에 배치해야합니다. </li><li> 한손으로 발톱 뒤에서 anesthetized 왕새우를 잡아. 신속, 눈 소켓에서 양쪽 머리의 중간에 잘라 다음 왕새우 (참고 : 준비에서 혈액이 완료되었을 때 그것이 마르면 때문에 도구를 씻어 쓰는 것입니다)을 참수 형에 처하다. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 왕새우 목베기 </li><li> chelipeds 걷는 다리를 잘라. </li><li> 단지 중간 tailfin (uropod)를두고, 왼쪽과 오른쪽 tailfins를 잘라. </li><li> 왕새우 등의 측면에있는 등 지느러미 표피의 왼쪽과 오른쪽 모두에 ventrally 했네요. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 도설 표피 제거 </li><li> 상처가 다음 등의 복부 표피의 아래 부분을 제거 GI 손상을 방지하기 위해 얕은되어 있는지 확인하고, 표피의 지느러미 측면에 transversely 잘라. </li><li> Sylgard 늘어선 요리로 해부 왕새우를 놓습니다. </li><li> tailfin의 끝에 접시에 왕새우를 핀. 시체를 잡아 필요에 따라 하나는 GI의 양쪽에 대한 자세한 핀을 사용할 수 있습니다. </li><li> GI 계속 피펫을 사용하여 호수로 GI 꺼 있는지 확인하십시오 커버 크레이 피쉬 호수와 함께 요리를 입력합니다. 5.3 MM KCl,, 13.5 MM CaCl 2 2 시간 2 O, 2.45 MM MgCl 2 6H 2 O, 호수가 205 MM NaCl로 만든 수정 반 Harreveld의 솔루션 (1936)입니다 5 MM의 HEPES 및 산도 7.4로 조정. 해부 크레이 피쉬는 그림 3과 같이 나타납니다. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 : 손상 GI와 해부하는 왕새우. </li></ol> 2.3) 실험 동물의 2.3.1) 진통 <ol><li> 준비 해수욕장 호수 같은 온도에서 테스트하는 화합물의 솔루션을합니다. 켜기 세로토닌의 개별 솔루션 (100 NM, 1microM), 글루 탐 산염 (1microM) 및 테스트되기 시작 물질로 크레이 피쉬 호수에서 만들어진 도파민 (1microM)을 사용할 수 있습니다. </li><li> 10 분 정도에 대한 왕새우 솔루션에 앉아 해부 왕새우 그것이 해부 및 생리 노출의 충격을 조정할 수 있도록 허용합니다. hindgut에서 느린 연동의 수축이 발생하기 시작한다. </li><li> 수축이 시작되면 30 초 (즉, 연동 유형, 또는 경련, 및 연동 파도의 방향 발생하는 수축의 종류를 참고)에서 발생하는 수축의 수를 기록합니다. 표 1 : 크레이 살린에서 진통 <table border="1"><tbody><tr><td> 수축 번호 </td><td> 진통의 종류 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> PI를 사용pette은 왕새우의 노출 복부의 캐비티 내에 호수를 제거하고, hindgut에 직접 검사하는 물질을 포함하는 호수를 적용합니다. </li><li> 즉시 솔루션을 추가한 후 30 초 이후에 발생하는 수축의 수를 기록하고 (즉 연동, 또는 뇌성 마비 환자) 발생하는 수축의 종류를 확인합니다. 표 2 : 화합물에 대한 노출과 진통 <table border="1"><tbody><tr><td> 컴파 운드 테스트 </td><td> 집중 </td><td> 수축 번호 </td><td> 진통의 종류 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> 즉시 시험 물질에 대한 응답을 녹음 후 정상 크레이 피쉬 호수와 GI 여러 번 씻어. 크레이 피쉬 식염수에 30 초마다 약 rinsing 동안 준비가 5 분 동안 서 보자. </li><li> 피펫을 사용하여 검사 또는 마지막으로 물질의 다양한 농도가 hindgut에 직접 테스트하기 위해 다음 화합물을 포함하는 식염수를 넣으십시오. 그것은 낮은 농도와 높은 농도하기 위해 노력하다의 방법으로 시작하는 것이 좋습니다. </li><li> 바로 각각의 새로운 물질이나 새로운 각 농도를 삽입한 후 30 초 이후에 발생하는 수축의 수를 기록하고 수축의 종류를 확인합니다. </li></ol> 2.3.2) excised 준비에 수축의 기록 세력 <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 : 설정 <ol><li> 다리 포드에 변환기를 부착합니다. </li><li> PowerLab 26T에 다리 포드를 연결합니다. </li><li> 컴퓨터의 USB 포트에 PowerLab의 26T를 연결합니다. </li><li> 바탕 화면에 labchart7 아이콘을 클릭하여 엽니다 LabChart7. <ul><li> LabChart 웰컴 센터 상자가 열립니다 나타납니다. 그것을 닫습니다. </li><li> 설정을 클릭하십시오 </li><li> 채널 설정을 클릭합니다. 확인을 누르면 1 (상자의 왼쪽 하단)에 채널 번호를 변경합니다. </li><li> 차트의 맨 왼쪽에 2K 약 초당 사이클로 설정합니다. 500 또는 200 뮤직 비디오에 볼트 (Y 축)을 설정합니다. </li><li> 차트의 오른쪽에 채널 1을 클릭합니다. 입력 앰프를 클릭하십시오. 않도록 설정 : AC 결합, 단일 종단, 그리고 반전 (필요한 경우 신호를 전도), 그리고 안티 - 별칭, 확인합니다. </li><li> 기록 프레스 시작를 시작합니다. </li></ul></li><li> 준비를 선택하고 흉부와 복부 사이의 시점에서 GI 트랙트를 잘라. 그런 다음 조심스럽게 꼬리 텔슨 부분 주위 컷. 해부 크레이 피쉬에서 GI 트랙트를 제거하고 Sylgard 요리에 넣습니다. GI 트랙트의 지느러미 부분을 따라 실행하는 혈관이 있습니다. 조심스럽게 GI 트랙트 멀리 이것을 가져옵니다. 준비에 신선한 크레이 피쉬 호수 붓고. </li><li> 해부 크레이 피쉬 근처 클램프의 힘 변환기를 배치합니다. </li><li> 그림 5에 표시된 왕새우 GI의 힘 변환기를 연결. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5 : 힘 변환기의 갈고리에 연결된 호수에서 왕새우 절연 hindgut </li><li> LabChart7에서 시작 GI가 계약에 시작할 때까지 기다려, 그리고 밀고. </li><li> 약 20 초 동안 실행 프로그램을 보자. "오직 살린", "그만"와라는 코멘트를 추가하십시오. 푸시 표 4를 입력하십시오. 표 4 : 관심의 화합물로 진통 <table border="1"><tbody><tr><td> 수축 번호 </td><td> 수축 진폭 (MV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> 관심의 테스트 화합물을 추가하고, 즉시 LabChart7에서 "시작"푸시. </li><li> 약 20 초 동안 실행 프로그램을 보자. "중지"를 눌러 직접 차트 파일을 추가했던 물질과 그 농도로 코멘트를 추가하십시오. 아래의 테이블을 작성하십시오. 표 5 : _________ 화합물과 진통 <table border="1"><tbody><tr><td> 수축 번호 </td><td> 수축 진폭 (MV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> 피펫을 사용하여 크레이 피쉬 호수와 준비를 씻어 내 버리지. </li><li> 비슷한 방법으로 다른 물질이나 여러 가지 농도를 추가합니다. 바로 LabChart7에서 "시작"푸시. </li><li> 약 20 초 동안 실행 프로그램을 보자. 푸시는 "중지"및 C를 나타내는 직접 차트 파일에 주석 및 레이블을 추가사용 농도 ompound. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 실험 그래프 각 솔루션 (호수, 세로토닌, 글루 탐 산염) 대부터 수축의 수를 2.3.1에서. 어떤 경향을 설명합니다. </li><li> 실험, 그래프의 각 솔루션의 수축의 수를 (호수, 세로토닌, 글루 탐 산염) 대 뮤직 비디오에서 수축의 진폭의 2.3.2에서. 어떤 경향을 설명합니다. </li></ol> 3.1) 수축의 속도와 힘을 측정 인덱스에 수축의 속도 한 편향의 처음부터 다음의 시작 시간을 측정하거나 분만을 통해 총 deflections을 계산합니다. 값은 다음 그들이 발생하는 방법에 따라 신속하게 분 당 초당 수축의 관점에서 넣어 수 있습니다. 색인에 ​​수축의 힘이 상대적인 조치는 여러 조건을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 저장된 파일을 하나 마커 "M"을 사용할 수 있으며 그 선에로 이동합니다. 그러면 커서를 사용하여 이동 편향의 정상과 델타 값 (정상에 M의 차이)와 같은 화면의 오른쪽 상단에 나와있는 값을 기록해 둡니다. 커서가 변화의 측정을위한 정지 보관해야합니다. 그렇다면 관심의 다음 물결 양식으로 M을 이동하고 조치를 반복합니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

관련 동영상과 텍스트로 제공되는 세부 사항은 현장에서뿐만 아니라 체외에서 왕새우 hindgut의 활동을 기록하는 데 필요한 주요 단계를 설명합니다. 우리의 보고서 중 하나 목표는 생리학과 약리학의 기본 개념을 가르쳐 조사 연구소를 학생 실행이 준비의 잠재력에 대한 인식을 높일 수 있습니다. 이러한 준비는 hindgut의 생리 기능의 더 나은 이해를 이끌 실험 질문 숫자를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 연동 파도와 그 반전의 규정을 기본 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. 전체 GI 트랙트 높은 제어를위한 메커니즘도 완전히 이해되지 않습니다. 높은 센터 직접 GI 시스템을 제어하는 자율 출력 그들의 활동을 통합하는 방법의 문제는 조사의 빈 공간 (Shuranova 외., 2006) 남아 있습니다. 또한, 갑각류 hindgut과 털갈이 및 환경 스트레스 동안 osmoregulation의 기능의 osmoregulatory 기능을 완전히 elucidated되지 않았습니다. 이 준비 답변을 기다리는 많은 질문이있을 수 있습니다.

<ol><li> 크레이 피쉬 (Procambarus clarkii). 아차 팔 라야 생물학 공급 주식 레이스 랜드, LA. 미국. </li><li> 표준 크레이 피쉬 호수 : 반 Harreveld의 ​​솔루션 (1936)에서 수정. (MM)를 205 NaCl, 5.3 KCl, CaCl 2 13.5 2 시간 2 O, 2.45 MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES 및 산도 7.4로 조정. 세로토닌, 글루 탐 산염과 도파민은 크레이 피쉬 호수에서 만들어집니다. 모든 화학 물질은 시그마 화학 회사 (세인트 루이스, MO)에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 해부 도구 : 좋아요 # 5 핀셋, 고급 가위, 나이프 블레이드 홀더, # 26002-20 곤충 핀 (모든 파인 과학 도구 (미국), 주식 회사, 373 - G 빈티지 파크 드라이브, 포스터 시티, CA 94404-1139에서 얻은) </li><li> Sylgard 바닥 페트리 접시 </li><li> 비커 (화학 솔루션을 개최) </li><li> 전기 신호는 컴퓨터 (ADInstruments, 콜로라도 스프링스, CO, 미국)에 PowerLab 26T 인터페이스 라인에 기록됩니다. 우리는 차트 또는 범위 이름을 ADInstruments에서 표준 소프트웨어를 사용합니다. <li> 힘 변환기 (다른 브릿지 포드가 강제로 트랜스 듀서의 다른 유형을 위해 필요합니다)에 대한 브릿지 포드. </li><li> MLT0402 (2g) 힘 변환기는 동영상에 나타난 연구 등급입니다. MLT 0210 / D (10 MG - 25g) 및 MLT 500 / A (0~500그램) 교육 성적의 트랜스 듀서 (ADInstruments)입니다. </li></ol>

크레이 피쉬 hindgut와 생리 실험 : 학생 실험실 연습

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

보고서의 목적은 크레이 피쉬 hindgut 준비를위한 해부 기술을 설명하고 수축의 강도를 모니터하는 힘 변환기와 생리 녹음을하는 방법을 보여줍니다하는 것입니다. 또한, 우리는 시각적으로 다양한 펩티드, biogenic 아민과 신경 전달 물질의 bioassay로 사용할 수있는 연동 활동을 모니터하는 방법을 보여줍니다. 이 준비는 생리학과 학생들에게 약리 개념을 보여주는 학생의 실험실 의무가 있습니다. 이 준비는 100 년 이상 사용되고 있으며, 그것은 여전히​​ 연동 리듬의 생성 및 규정을 조사 및 자신의 변조를 기본 메커니즘을 설명하기위한 모델로 많이 제공합니다. 약리 assays과 수용체 hindgut에 50 년 전에 시작되었다 서브 타이핑은 오늘날에도 연구에 기여하고 있습니다. 이 강력한 준비가 잘 생리학과 약리학의 교육 학생들에게 적합합니다.

이 보고서에서 우리는 크레이 피쉬 hindgut의 생물을 조사하는 데 사용할 수있는 기법을 보여줍니다. 우리는 가재의 복부를 절개하다와 관련된 해부학, 생리학 활동의 변조를 연구하는 방법을 보여줍니다. 수축의 연동 활동과 강도는 강제 변환기를 사용하여 측정하고 있습니다.

크레이 피쉬 Hindgut와 생리 실험 : 학생 실험실 연습

본 보고서의 목적은 가재 후장(hindgut) 준비를 위한 해부 기술을 설명하고, 생리학적 기록을 측정하는 방법을 시연하는 것입니다...

본 보고서의 전반적인 목표는 생리학 실험에 참여하는 고등학교 심화 과정 및 학부생들을 위한 생리학 과정의 교육 도구가 되는 것입니다. 학생들은 가재 후장(hind gut)을 노출시키고 수축을 기록하는 방법을 배웁니다. 추가 단계로 동물로부터 후장을 적출하며, 이를 통해 화합물을 직접 투여할 수 있습니다.다음으로, 수축 강도를 변화시키는 메커니즘을 조사하기 위해 다양한 약리학적 제제를 처리하면서 후장 평활근 수축의 강도와 리듬을 모니터링합니다. 약리학적 분석 및 수용체 아형 분류를 기반으로 조절제가 신경 내층에 작용하는지 또는 근육에 직접 작용하는지를 보여주는 결과가 도출됩니다. 안녕하세요, 브록 대학교 생물과학과의 J Mercier 박사입니다.저는 내장 근육을 조절하는 신경전달물질 연구를 위한 표본으로 가재의 후장을 사용해 왔습니다. 또한 이 표본을 교육 도구로 활용해 왔으며, 켄터키 대학교의 Robin Cooper 박사 연구실과의 협력을 통해 교육 목적으로 학생들이 수행할 수 있는 여러 실험법을 완성하고 있습니다. 이 방법은 가재 후장의 기능에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.또한 연동 리듬과 관련된 질환과 같은 질병 연구에도 적용될 수 있습니다. 더불어 근육 및 신경 지배의 조절 기전을 설명하는 데 사용할 수 있습니다. 학생들은 약물 제제, 신경전달물질 및 신경 호르몬을 사용하여 생리학적 및 약리학적 데이터를 해석하는 법을 배우며, 수용체 기능에 대한 전반적인 이해를 얻게 될 것입니다.작용제와 길항제와 관련하여, 학생들은 용량-반응 곡선을 작성하고 통계 분석을 위해 데이터를 그래프 형태로 제시하게 됩니다. 동물을 마취시키려면, 몸길이가 6~10 cm인 가재를 얼음 위에 5~10분 동안 둡니다. 마취된 가재를 한 손으로 집게 뒤쪽에서 잡습니다. 양측의 안와에서 머리 중앙까지 빠르게 절개한 후, 가재의 머리를 제거합니다.준비된 혈액은 건조되면 끈적거릴 수 있으므로, 작업이 끝난 후 도구들을 세척하십시오. 다음으로, 다리와 집게발을 제거합니다. 그런 다음 좌우 꼬리지느러미를 절단하고, 마지막 마디에 도달할 때까지 복부의 등 쪽을 따라 절개하여 중앙 꼬리지느러미만 남겨둡니다.그런 다음 마지막 마디를 따라 자르고 반대편 아래쪽으로 절개합니다. 등갑을 제거합니다. 해부한 가재를 거즈가 깔린 페트리 접시에 놓습니다.가재 식염수. 표본을 고정하기 위해 해부 핀을 사용하여 페트리 접시에 고정합니다. 후장은 보통 혈관과 결합 조직 덩어리로 둘러싸여 있습니다.이를 핀셋으로 제거합니다. 이때 장이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이제 복부를 따라 후장을 확인할 수 있습니다.해부된 가재 표본을 생리식염수에 약 10분 동안 두어 해부와 식염수 노출로 인한 충격에서 회복될 수 있도록 합니다. 후장의 느린 연동 수축을 관찰하십시오. 이제 수축 속도를 계산할 수 있습니다.30초 동안 발생하는 수축 횟수를 세어 기록지에 기록하십시오. 또한 발생하는 수축의 유형과 그것이 연동성 수축인지 혹은 경련성 수축인지 기록하십시오. 연동파가 나타나는 경우 그 방향을 기록하십시오.항문 근처와 복부 중간 지점의 수축 속도를 측정하여, 이 두 영역 사이에 속도 차이가 있는지 확인하십시오. 다양한 테스트 용액을 준비하고, 이를 배양용 식염수와 동일한 온도로 유지하십시오. 여기서 처음으로 테스트할 용액은 가재 식염수로 제조한 1 µM serotonin 용액입니다.피펫을 사용하여 가재의 노출된 복부 강 내에서 식염수를 제거하고, 1 µM 세로토닌 용액을 후장에 직접 처리합니다. 새 용액을 첨가한 직후 30초 동안 대기한 다음, 항문 근처 영역에서 30초 동안 발생하는 수축 횟수를 측정하고, 이어서 복부 중간 지점에서 다음 30초 동안의 수축 횟수를 측정합니다. 이 수치들을 도표에 기록하고 발생하는 수축의 유형 또한 함께 기록합니다.다음.기록 접시에서 테스트 용액을 따라내고 가재 생리식염수로 후장을 여러 번 헹굽니다. 그런 다음 5분 동안 30초 간격으로 표본을 헹굽니다. 이 시점에서 다음 테스트 용액을 추가할 수 있으며, 본 시연에서는 1 µM Topamine을 사용합니다.이전과 동일하게 관찰 결과를 기록하고, 나머지 테스트 화합물에 대해 이 과정을 반복하십시오. 동일한 물질의 여러 농도를 사용할 때는 반드시 가장 낮은 농도부터 시작하여 높은 농도 순으로 진행하십시오. 위장관 수축력을 측정하기 위한 설정에는 LabChart 7 소프트웨어가 설치된 노트북, Bridge Pod, PowerLab 26T 및 힘 변환기(force transducer)가 포함됩니다.위장관 근육 수축력을 측정하기 전에 위장관을 분리해야 합니다. 이를 위해 마지막 복부 마디의 근육을 절제하고, 항문 양측의 부드러운 복측 큐티클을 통해 두 개 이상의 핀을 고정한 다음, 힌트gut(후장)과 항문이 작은 큐티클 조각에 부착된 상태로 남도록 나머지 복부를 절제하십시오. 장은 흉부와 복부의 접합부 근처에서 절단해야 합니다.이제 위장관을 바닥에 sardines(사드)가 코팅된 얕은 접시로 옮깁니다. 위장관의 등쪽 면을 따라 혈관이 하나 지나가고 있습니다. 이 혈관을 위장관에서 조심스럽게 분리하십시오.준비물 위에 신선한 가재 식염수를 붓습니다. 힘 변환기(force transducer)를 준비물 위로 이동시킵니다. 힘 변환기 바닥에 접착된 핀을 자세히 관찰하십시오.창자에 고정하는 끝부분에는 작은 굽은 부위가 있습니다. 핀의 작은 굽은 부위를 후장(hind gut)의 절단된 끝부분에 겁니다. 후장을 고정한 후, 후장이 팽팽해질 때까지 디쉬를 약간 이동시킵니다.장관이 팽팽해야 하지만 너무 과하게 당겨지지는 않아야 하므로 이 단계에서 주의하십시오. 너무 세게 당기면 근육이 손상될 수 있습니다. 디쉬가 최적의 위치에 놓이면, 왁스나 점토를 사용하여 디쉬를 안정적으로 고정하십시오.다음으로, 소프트웨어를 실행합니다. 기록을 시작하려면 LabChart 소프트웨어를 엽니다. LabChart 웰컴 센터를 닫습니다.왼쪽 상단의 설정(setup)으로 이동합니다. 왼쪽 하단의 채널 설정(channel settings)을 클릭하십시오. 채널 설정에서 채널이 하나만 되도록 변경합니다.화면 우측의 확인(okay) 버튼을 클릭하십시오. 채널 1의 오픈 브리지 포드(open bridge pod)로 이동합니다. 차트 우측 상단에서 범위를 가장 민감한 설정인 200 microvolts로 설정하십시오.초당 사이클 수를 2K로 설정하십시오. 이제 기록할 준비가 되었습니다. 시작을 클릭하여 설정이 올바르게 작동하는지 확인하십시오.피펫으로 트랜스듀서 팁을 가볍게 터치하십시오. 소프트웨어에 기록되는 힘의 변화가 나타나야 합니다. 소프트웨어에서 중지(stop)를 클릭한 다음, 시작(start)을 클릭하여 프로그램을 실행하십시오.약 20초 동안 정지 버튼을 클릭하고 saline이라는 라벨의 주석을 추가합니다. 한 번의 굴곡 시작점부터 다음 굴곡 시작점까지의 시간을 측정하거나, 1~2분 동안의 전체 굴곡 횟수를 세어 수축률만 계산합니다. 수축이 일어나는 속도에 따라 수축률을 분당 수축 횟수 또는 초당 수축 횟수로 계산합니다.수축력을 측정하려면 저장된 파일에서 서로 다른 조건하의 수축을 비교하기 위해 상대적 측정값을 사용하십시오. 마커 M을 기선(baseline)으로 이동한 다음, 커서를 편위의 정점으로 이동하여 화면 우측 상단에 표시된 값을 기록하십시오. 이 값은 M에서 정점까지의 차이인 델타(delta) 값입니다.변화를 측정하기 위해서는 커서를 피크 지점에 고정시켜야 함에 유의하십시오. 그 다음, M 마커와 커서를 다음 관심 파형으로 이동시키고 측정을 반복하여 조절제의 효과를 조사하십시오. 이 준비물에서 식염수를 테스트 용액으로 천천히 교체하십시오.이 경우, 1 µM 세로토닌을 투여하고 마지막 테스트로서 수축 속도와 강도를 계속 기록합니다. 본 표본에서 간극연접 억제제가 수축 속도나 강도를 변화시키는지 테스트하며, 간극연접 억제제에는 1 HEP 에탄올 또는 이산화탄소를 포화시킨 식염수가 포함됩니다. 이러한 화합물들은 장시간 노출 시 근섬유를 손상시킬 수 있으므로 가장 마지막에 사용합니다. 다양한 화합물의 효과를 비교하기 위해 데이터를 차트로 그래프화합니다.이 표본의 또 다른 흥미로운 용도는 환상근에 의해 생성되는 힘을 기록하는 것입니다. 하지만 표본에 간극연접 억제제(gap junction inhibitors)를 처리했다면, 억제제가 환상근을 손상시켰을 수 있으므로, 이 경우에는 환상근 테스트를 위해 새로운 후장 표본을 사용해야 합니다. 환상근을 노출시키려면 미세 가위로 장관의 튜브를 세로 방향으로 절개하십시오.미세 핀을 사용하여 한쪽 끝을 디시에 단단히 고정합니다. 트랜스듀서의 갈고리 핀을 스트립의 반대쪽 끝에 연결합니다. 종근에서 테스트했던 것과 동일한 화합물에 표본을 노출시키며, 테스트한 화합물과 수축 횟수 및 유형 간의 관계가 여기에 표시되어 있습니다.생리식염수, 세로토닌 및 글루타메이트 용액에 대해 수축 횟수 대 시간 그래프를 작성할 수 있습니다. 또한, 생리식염수, 세로토닌, 글루타메이트 용액에 대해 수축 횟수 대 수축 강도(mV) 그래프를 작성할 수 있습니다. 이러한 그래프 작성은 종근과 환상근 모두에 대해 수행하여, 장의 서로 다른 부위에 있는 종근과 환상근이 다양한 조절제에 대해 서로 다른 반응을 보이는지 테스트할 수 있습니다.위의 실험은 항문부터 복부를 따라 위쪽으로 올라가며 서로 다른 부위에서 반복할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 핀셋으로 위장관(GI tract)을 손상시키지 않도록 주의하고, 힘 변환기(force transducer)로 너무 강하게 당기지 않도록 유의하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 근육의 전기생리학적 기록과 같은 다른 방법들을 수행하여 이온 채널 기능 및 조절과 같은 다른 문제들을 다룰 수 있으며, 이는 다른 동물 모델의 다른 조직들을 위한 모델로 활용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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크레이 피쉬 Hindgut와 생리 실험 : 학생 실험실 연습

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