회로 기판과 생물 세포막을 모델링하고 Axons에 전기 신호를 측정 : 학생 실험실 연습을

이 실험 절차의 전반적인 목표는 전기적 모델을 통해 생체막을 어떻게 이해할 수 있는지 보여주고, 가재의 복측 신경삭(ventral nerve cord)에서 활동 전위를 기록하는 절차를 시연하는 것입니다. 먼저 브레드보드 상의 회로 구성 요소를 사용하여 막의 전기적 특성을 나타냅니다. 다음 단계로는 모델 회로의 저항과 커패시턴스를 변화시켜 전압 트레이스에 미치는 영향을 확인합니다.

절차의 세 번째 단계는 모델 회로에서 학습한 개념을 살아있는 신경 표본에 적용하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 복합 활동 전위를 기록하고 임계 불응기 및 시냅스 전달의 특성을 이해하는 것입니다. 궁극적으로, 모델 회로의 구성 요소를 변경하고 살아있는 신경의 자극을 달리함으로써 생체막의 전기 회로 모델과 살아있는 신경의 특성을 조사하는 것이 어떻게 유용한 교육 도구가 될 수 있는지를 결과가 보여줍니다.

이 방법은 생물학적 막을 전기적 모델의 관점에서 어떻게 이해할 수 있는지에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 근육과 같은 다른 조직에도 적용 가능합니다. 복측 신경삭의 해부와 기록 장치 설정이 처음에는 어려울 수 있으며, 신경삭의 자극 및 기록을 위한 최적의 설정을 얻기 위해 신경 손상을 방지하도록 주의를 기울여야 하므로 이 방법의 시연은 매우 중요합니다.

실험의 첫 번째 단계에서는 저항기와 커패시터를 사용하여 신경 세포막의 전기적 활동을 모사합니다. 초기 회로에는 저항기만 포함되며, 커패시터는 이후 단계에서 추가됩니다.

신경막의 수동 저항 특성은 여기 표시된 회로로 나타낼 수 있습니다. 브레드보드는 횡단막 저항을 나타내는 33 kilo ohms의 병렬 저항기와 세포 내 저항을 나타내는 10 kilo ohms의 직렬 저항기로 구성되었습니다. 이 회로는 외부 액체의 저항이 세포 내 저항 및 횡단막 저항에 비해 무시할 수 있을 정도로 작다고 가정합니다.

모델 세포 제작이 완료되면, 파워랩(power lab)의 출력 리드를 브레드보드 모델에 연결하십시오. 파워랩은 자극을 생성하며 전압 기록을 위한 측정 프로브가 포함되어 있습니다. 그다지, 파워랩을 컴퓨터에 연결하십시오.

컴퓨터는 브레드보드에서 기록된 전기 신호를 표시하는 데 사용됩니다. 다음 단계는 파워랩(power lab)에서 모델 신경 세포로 보내는 자극을 제어할 컴퓨터 소프트웨어를 설정하는 것입니다. 바탕화면에서 랩차트(lab chart) 프로그램을 실행하십시오.

새 파일을 선택하고, 설정을 선택한 다음 채널 설정을 선택합니다. 표시할 채널 하나를 선택한 후, 자극기 패널을 선택합니다. 1.5 volts의 긴 펄스가 필요합니다.

실험의 이 단계에서는 진폭을 1 V로 조정하십시오. PowerLab은 +0.5 V와 -0.5 V 사이에서 변동하는 전압을 출력하며, 이는 결과적으로 1 V의 정점-대-정점(peak-to-peak) 자극을 생성합니다. 주파수는 0.75 Hz로, 펄스 지속 시간은 1 s로 설정하십시오.

채널 설정을 위해 모니터링할 채널 1을 선택하고, 입력 앰프(input amplifier)를 클릭한 다음 상자에서 차동(differential) 버튼을 클릭하고 범위를 5V로 설정한 후 선택하십시오. 다음 단계는 신경 세포 모델에 전기 신호를 가하고 모델의 길이를 따라 신호의 손실을 확인하는 것입니다. 컴퓨터에서 시작(start)을 클릭하여 회로의 A와 B 사이의 한쪽 끝에 전압을 가하십시오.

모델 축삭을 따라 첫 번째 단위 길이의 전압을 측정하고 컴퓨터로 모니터링하십시오. 전압 측정 프로브의 빨간색 리드를 브레드보드의 A 지점에 고정한 상태에서, 다른 리드를 직렬 연결된 저항기 사이의 서로 다른 위치로 이동시키십시오. 더 먼 위치일수록 전압 강하가 일어나는 것을 확인하십시오.

이제 컴퓨터의 정지 버튼을 눌러 기록을 중단하십시오. 커서를 사용하여 기록된 각 펄스로 트레이스를 이동시킨 후, 컴퓨터에 저장된 트레이스의 전압 차이를 측정하십시오. 왼쪽 하단에 있는 M 마커 커서로 트레이스의 바닥 지점을 표시하고, 자유 커서를 트레이스의 정점에 배치하여 전압 차이를 측정하십시오.

화면에서 전압 차 측정값을 읽고, 회로의 각 측정 위치에 대해 공책에 기록하십시오. 다음 단계는 모델 세포의 길이 상수를 계산하는 것이며, 이는 거리에 따른 신호의 지수적 감쇠를 설명하는 데 사용됩니다. 막 저항을 1단위로 간주하여, 소스로부터의 거리 대비 전위 차 그래프에 각각의 전압 차 값을 표시하십시오.

그래프 외에, 이 회로의 길이 상수를 결정하십시오. 신경 섬유의 길이 상수는 막 전위차가 발생 지점의 원래 값의 37%로 감소하는 거리를 의미합니다. 신경 및 근육 섬유의 수동 케이블 특성을 더 잘 시뮬레이션하기 위해, 모델 신경 세포는 저항 성분과 정전 용량 성분을 모두 포함하도록 확장될 것입니다.

신경 세포막에는 횡단막 저항뿐만 아니라 표면막 커패시턴스도 존재하며, 이는 신경 세포 신호를 왜곡시킵니다. 이를 시뮬레이션하기 위해, 10 µF 커패시터 10개를 횡단막에 병렬로 연결하십시오. 컴퓨터의 브레드보드에 있는 저항기를 사용하십시오.

자극기를 1초, 1V로 설정하십시오. 이는 0.5V 진폭 설정과 0.75Hz 펄스에 해당합니다. 또한 패널 우측 상단에서 획득률을 초당 20K로 설정하십시오. 그런 다음 화면 우측의 채널 1을 클릭하십시오.

상자에서 입력 증폭기를 클릭하십시오. 디퍼런셜 버튼을 클릭하고 범위를 5V로 설정하십시오. 확인을 클릭하십시오.

이 변경 사항을 저장하려면 '시작'을 클릭하여 데이터 수집을 시작하십시오. 브레드보드의 동일한 지점에서 데이터를 측정하십시오. 데이터 수집 후, 확대 창을 사용하여 사각 펄스 중 하나의 상승 시간을 확대하십시오.

트레이스를 더 넓게 보기 위해 필요한 만큼 확대 과정을 반복하십시오. 신호가 기저선에서 전압 트레이스의 상단까지 상승하는 데 걸리는 시간을 측정하십시오. 신호가 평탄해지는 지점이 기준입니다.

전위 변화의 시간적 경과와 사각 펄스의 왜곡을 관찰하십시오. 또한 이전과 같이 M 커서와 자유 커서를 사용하여 측정된 전압이 0.2 V 이상인지 확인하고, 임계 전압을 0.2 V로 가정하여 전압 변화량을 읽고 데이터를 노트에 기록하십시오. 각 막 저항에서 전위가 임계값에 도달하는 데 걸리는 시간을 측정하십시오.

결과를 시간에 따른 거리로 도식화하십시오. 수초의 두께가 증가하면 막 커패시턴스가 감소합니다. 브레드보드의 10 µF 커패시터를 더 작은 0.1 µF 커패시터로 교체하여 이를 시뮬레이션하십시오. 이전 실험을 반복하십시오.

선택한 저항기에서 임계값에 도달하는 시간의 변화를 관찰하십시오. 더 큰 커패시터를 사용한 데이터를 이전의 시간 대 거리 그래프 위에 겹쳐서 나타내었습니다. 수초의 두께가 증가하면 신경 세포 내에서 전기 신호가 더 빠르게 상승하고 하강할 수 있으며, 이에 따라 전도 속도가 증가합니다.

실험의 다음 단계에서는 가재의 복신경삭(ventral nerve cord)에서 축삭의 전기화학적 특성을 조사합니다. 모델 회로에서 나타난 수동 전류 확산(passive current spread) 특성은 살아있는 표본에서도 관찰됩니다. 하지만 세포의 수동적 전기 특성으로 인해 수 밀리미터 거리에서 신호가 감쇠되므로, 해당 거리 이상의 신호 전달이 필요할 때는 활동 전위가 필수적입니다.

가재의 복측 신경삭을 따라 신호가 서로 다른 전도 속도로 전달될 때, 가장 빠른 신호가 먼저 관찰되고 더 느린 신호는 약간 나중에 관찰됩니다. 유사한 전도 속도를 가진 축삭군에 따라 일부 신호는 기록 장치에서 합산됩니다. 여러 축삭에서 발생한 이 합산된 전기 신호를 복합 활동 전위라고 합니다.

다음 일련의 실험은 가재의 복측 신경삭을 얻기 위해 가재 신경으로부터 복합 활동 전위를 기록하는 것에 중점을 둡니다. 먼저, 신경 접시 해부 도구와 식염수를 준비하십시오. 가재를 약 5분 동안 얼음 위에 올려 마취시킵니다.

마취가 완료되면 가재를 젖은 종이 타월로 감싸고, 엄지와 검지로 집게발을 잡은 상태로 한 손에 쥐십시오. 다른 한 손을 사용하여 가위로 안와 사이의 부리 부분을 절개합니다. 머리가 완전히 분리될 때까지 절개 부위에서 아래 방향으로 자릅니다.

집게다리와 가슴다리를 제거합니다. 복부 위쪽의 두흉부 기저부를 절개하여 두흉부를 분리합니다. 꼬리와 유영각을 제거합니다.

복부의 복측 양측을 따라 절개합니다. 이때 심부 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오. 복측 신경삭을 노출시키기 위해, 분리된 외골격 부분을 꼬리 부채의 기저부까지 젖혀 줍니다.

포셉의 끝부분을 사용하여 복신경삭의 끝을 조심스럽게 제거합니다. 이때 신경삭이 늘어나거나 짓눌리지 않도록 주의하십시오. 신경삭에서 관찰되는 결절은 가재의 신경절입니다.

신경절 챔버의 금속 바 위에 신경삭을 놓습니다. 복측 신경삭을 촉촉하게 유지하는 것이 매우 중요합니다. 이를 위해, 금속 가로바와 수평이 될 정도로 충분한 양의 가재 식염수를 신경절 챔버에 추가하십시오.

다음으로, 액체의 높이가 막대의 바닥에 닿을 정도가 될 때까지 가재 식염수를 피펫으로 뽑아냅니다. 신경삭이 제자리에 위치하면, 두 개의 미니 훅 리드가 달린 자극기 케이블을 신경 챔버에 연결합니다. 양극의 빨간색 리드를 신경삭 끝부분 근처의 외부 금속 루프 중 하나에 연결하고, 음극의 검은색 리드를 신경삭과 접촉하고 있는 인접한 금속 루프에 연결합니다.

조작기를 사용하여 흡입 전극을 음극 및 양극 리드 반대편의 신경 말단 근처에 배치하십시오. 복측 신경삭(ventral nerve cord)의 끝부분을 기록 전극으로 조심스럽게 흡입하십시오. 흡입 전극의 전선 하나를 프로브의 양성 입력단에 연결하고, 다른 전선을 음성 입력단에 연결하여 전극을 헤드 스테이지 프로브에 부착하십시오.

어느 전선이 어느 입력단에 연결되는지는 중요하지 않습니다. 프로브는 염화은선을 사용하여 패러데이 케이지나 식염수 욕조에 접지하거나, 60 Hz 노이즈 전위차를 줄이기 위해 미분 증폭기의 접지 입력단에 연결할 수 있습니다. 프로브를 미분 증폭기에 부착하고, 증폭기를 PowerLab에 연결하십시오.

첨부된 기사의 표에 제시된 앰플리파이어 RS 설정을 확인하십시오. USB 케이블을 사용하여 power lab을 컴퓨터에 연결하십시오. 컴퓨터 바탕화면 우측 상단에 있는 scope 소프트웨어를 실행하십시오.

채널 2를 선택하고 끕니다. 화면 중앙의 바를 화면 하단으로 드래그하여 채널 1만 표시되도록 화면을 조정합니다. 동반된 논문에 제시된 설정으로 입력 증폭기를 확인합니다.

그런 다음 화면 상단의 설정(setup)에서 자극기(stimulator)를 선택하고, isolated stem 기능을 끄며, 지연 시간(delay)을 5 ms, 지속 시간(duration)을 1 ms, 펄스 수를 2회, 간격(interval)을 15 ms, 범위(range)를 5 V, 진폭(amplitude)을 0.5 V로 설정합니다. 복신경삭(ventral nerve cord) 자극을 시작하려면 화면 왼쪽 하단의 시작 버튼을 클릭합니다. 그러면 스코프 데이터 수집 창에 뚜렷한 활동 전위가 나타나야 합니다.

노트북에 활동 전위의 일반적인 형태를 그려 보십시오. 화면 왼쪽 상단에 있는 탭을 사용하여 전압을 천천히 낮추십시오. 활동 전위의 크기가 점차 작아지다가 특징적인 파형 패턴이 사라질 것입니다.

전압을 낮추면 복합 활동 전위(compound action potential)에 기여하는 뉴런의 수가 줄어듭니다. 이 효과를 반전시키려면 전압을 점진적으로 높이십시오. 더 많은 뉴런이 동원됨에 따라 복합 활동 전위 파형이 더 커집니다. 이 실습은 개별 뉴런들이 활동 전위가 유도되는 서로 다른 임계값을 가지고 있다는 사실을 보여줍니다.

자극 전압을 더 높여도 복합 활동 전위가 증가하지 않으면, 모든 뉴런이 동원된 것이며 컴퓨터 화면에 활동 전위 파형의 두 가지 뚜렷한 피크가 보여야 합니다. 실험의 다음 단계에서는 축삭의 불응기를 조사합니다. 화면 왼쪽 상단의 탭을 사용하여 펄스 사이의 지연 시간을 변경하십시오.

두 번째 화합물 활동 전위를 유도할 수 없을 때까지 지연 시간을 계속 단축하십시오. 절대 불응기는 두 번째 활동 전위가 더 이상 유도되지 않는 펄스 간의 시간 지연으로 정의됩니다. 상대 불응기는 절대 불응기가 끝나는 시점부터 두 번째 자극을 주었을 때 최대 진폭의 두 번째 활동 전위가 나타나는 시점까지의 시간으로 정의됩니다.

이제 헵탄올(hept ethanol)과 같은 간극연접 억제제의 특성을 조사할 수 있습니다. 동일한 자극 설정에서 복합 활동 전위의 차이를 비교하여 복측 신경삭(ventral nerve cord)을 따라 간극연접을 통해 전도되는 신호가 무엇인지 결정할 수 있습니다. 또한, 차가운 식염수나 따뜻한 식염수를 사용하여 복합 활동 전위를 구성하는 다양한 요소들의 전도 속도 차이를 측정할 수도 있습니다.

여기 가재의 복측 신경삭에서 기록된 두 개의 복합 활동 전위가 제시되어 있습니다. 이 그림은 완전한 복합 활동 전위 이후 두 번째 자극이 더 작은 복합 활동 전위를 유발하는 시기인 상대 불응기를 보여줍니다. 또한, 이 그림은 해당 절차 이후 헵탄올(hept ethanol)을 사용했을 때 복합 활동 전위에 나타나는 영향을 보여줍니다.

생체막 회로의 구성 요소는 막 내 누설 채널의 밀도 변화에 따른 영향이나, 전압 개폐 채널의 기능과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 다양하게 변경될 수 있습니다. 이러한 기술과 절차는 생리학 분야의 연구자들이 세포가 전기 회로로서 어떻게 작동하는지, 그리고 동물의 살아있는 조직 내에서 간극 결합이 어떻게 기능하는지 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.