Name: 에 각인 유전자의 DNA Methylation의 결정 Arabidopsis 배젖 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 학습하세요 Arabidopsis 배젖에서 각인 유전자의 DNA 메틸화 상태를 결정하는 방법을. 비설파이트 시퀀싱을 활용하여 모계 및 부계 대립유전자의 메틸화 패턴을 분석하고 식물 유전 조절 메커니즘을 이해하세요.

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저자는 Arabidopsis 식물의 유지 보수를 위해 양 제니퍼 M. Lommel와 타라 N. Rognan 감사합니다. 이 작품은 건강 보조금 1R15GM086846 - 01와 W. 샤오에 3R15GM086846 - 01S1의 세인트 루이스 대학과 국립 연구소에서 시작 기금에 의해 지원되었다.

I. 유전자 크로싱 1. 여성 부모 Emasculating DNA 시퀀스 다형성, 두 개의 다른 ecotypes 예 : 콜럼비아 - 0 (콜 - 0) 및 Ler가, 여성과 남성의 부모로 선택됩니다를 사용하여 모자 아버지 대립 유전자를 식별하기 위해. 식물 젊고 건강해야합니다. 하나는 바이저, 또는 육안을 확대, 해부 현미경을 사용하여 여성의 부모를 거세된 수 있습니다. 무대 - 12 꽃을 찾아 (스미스 외., 1990)와 가위와 작은 꽃자루의 기반을 클리핑하여 꽃이나 siliques 위와 아래를 제거합니다. 포셉에있는 꽃가루 곡물을 제거하고뿐만 아니라 꽃가루를 죽일 것입니다 95 %의 에탄올의 비커로 부드럽게 팁의 기반을 찍기로 집게를 소독. 부드럽게 집게를 사용하여 꽃 봉오리를 분리 캐내려고하고, 부드럽게 암술은 베어하고 그대로두고, 4 sepals, 4 꽃잎, 6 stamens를 제거합니다. 이 과정에서 carpels에 손상을 피하기 위해보십시오. 2. 꽃가루 기증자를 따기와 수분을 수행 최고의 꽃가루의 기증자는 꽃가루가 많이 흘리기있는 암술 (스미스 외., 1990)에 90 ° 각도로 확장 꽃잎과 함께 단계 14에서 열린 꽃 anthesed 있습니다. 기지에서 꽃을 잡고 그냥 작은 꽃자루 위에, 이것은 꽃이 열려 확산하게됩니다. 꽃밥과 준비 암술의 오명을 먼지. 수분 후, 오명은 쉽게 현미경으로 관찰할 수있는 노란색 꽃가루와 함께 다룹니다. 3. 십자가를 라벨링 식물의 모든 emasculated pistils을 pollinating 후, 우리는 보석 태그와 여성과 남성의 부모 및 날짜 정보와 함께 십자가를 라벨. 공장 주변 토양의 지분을 장소 지분에 꽃이 핌의 줄기를 묶어하는 문자열을 사용하고 비닐 봉지로 pollinated pistils을 커버. II. Arabidopsis의 배젖 조직의 분리 1. 준비 자료 액체 질소 탱크, 액체 질소, 해부 현미경, 미세 팁 포셉 (더몬트 생물학 5 INOX FST, 스위스.) 현미경 유리 슬라이드의 두 쌍 (우리는 보통 배젖 및 배아 조직을 수확하기 전에 준비가 필요한 자료를 얻을 3 "X 1"X 1.0 mm), sorbitol 0.3 M의 산도 5.7 솔루션 5 MM MES. 2. 수집 siliques 7 - 또는 8 - 일 - - 수분 후 (DAP), 씨앗이 embryogenesis의 후반 단계 어뢰 중순에 수확하고 배젖 및 배아에 대한 해부를 준비하고 있습니다. emasculated 꽃이 너무 어린 경우에는 때로는 90-10 DAP이 걸릴 수 있습니다. 3. 분리 배젖 및 배아 Arabidopsis 씨앗은 작은 있기 때문에, 우리는 배젖 및 배아를 분리 해부 현미경을 사용합니다. 현미경 8 DAP의 silique 넣고, silique 작은 꽃자루를 잡아 포셉 한 켤레를 사용하여 두 carpels 퓨즈 여백에 열려 silique을 슬라이드 포셉 또 한 쌍의의 팁을 사용합니다. sorbitol 0.3 M 5 MM MES의 산도 5.7 솔루션에 한 종자를 데리러 포셉 한 쌍의를 사용하여, 배아를 슬라이드 micropyle 끝에 작은 상처를 씨앗 코트에서 배젖 및 별도의 배젖를 밀어 포경 끝을 스퀴즈 (기노 시타 외., 2004). 액화 질소에 별도의 microtubes로 배아와 배젖 놔. 우리가 10-15 siliques에서 배아 또는 배젖을 축적 때까지 이것을 계속하고 -80 ° C 냉동고에 튜브를 저장합니다. 어떤 경우에는, 배젖은 씨앗 코트, 즉 분리하실 필요가 없습니다, 하나는 유전자 각인 분석 배젖 및 종자 코트 혼합물에서 총 RNA를 분리하실 수 있습니다. III. Bisulfite 배열 1. 필요한 시약 , : 게놈 DNA, 제한 효소, 3 M NaOH (갓 만든), 6.42 M의 요소 / 4 M 나트륨 bisulfite를 (190 2 M 나트륨 metabisulfite, 시그마 - 알드리치, S9000, Na2S2O5, 분자량) 준비 Cetyltrimethyl 암모늄 브로마이드 (CTAB) 10 MM 히드로퀴논, DNA 정제 키트 (Promega 마법사 DNA 청소 시스템, 고양이. # A7280), TE 버퍼, 6.3 M NaOH (갓 만든), 10 M NH 4 OAc, 20 μg / μL tRNA 및 100 % 에탄올 . 2. bisulfite 치료 프로토콜의 세부 사항 <ol><li> 게놈 배젖 또는 CTAB 절차를 사용하여 배아 DNA (로저스 Bendich, 1988)을 분리. </li><li> 다이제스트 100 NG - 20 μL 100 분석하는 영역 이외의자를 제한 효소로 μL 총 볼륨의 게놈 DNA 2 μg. MEA의 발기인을 위해, 우리는 XhoI, NdeI 및 PstI이나 HindIII를 사용합니다. </li><li> 5 분 동안 DNA를 끓는하여 제한 효소를 변성 후 얼음 끄다. </li><li> 15 분 37 3 M NaOH와 부화의 9분의 1 볼륨 (20 μL 소화 DNA를 2.2 μL) ° C를 추가합니다. </li><li> 250 μL PCR 튜브에 대한 해결책을 전송합니다. </li><li> 멸균 증류수 10 ML에 요소의 7.5 g을 디졸브, 천천히 1~2시간 이상의 나트륨 metabisulfite의 7.6 g을 추가하고 가열은 일반적으로 해소하는 데 도움이, 갓 만들어진 10 M NaOH와 5 산도를 조정, 마지막에 살균 증류수를 추가 20 ML에 볼륨. 이것은 6.24 M의 요소 / 4 M 나트륨 bisulfite 솔루션입니다. </li><li> 각각 6.24 M의 요소 / 5.36 M의 최종 농도 4 M 나트륨 bisulfite 솔루션과 3.44 M을 (폴린 외., 1998) 추가합니다. 예를 들어, 6.42 M의 요소 / 변성 게놈의 DNA (샤오 외., 2003)의 위 22.2 μL 4 M 나트륨 bisulfite 솔루션의 208 μL를 추가합니다. </li><li> 0.5 MM (20 μL 소화 12 μL)의 최종 농도에서 DNA 10 MM의 히드로퀴논를 추가합니다. </li><li> . 55 ° 15 분 95 ° C 30 초 동안 C 30 사이클 : PCR 기계에서 bisulfite 치료를 실시 </li><li> Promega에서 마법사 DNA 청소 시스템을 사용하여 bisulfite 치료 DNA를 탈염하다와 (야콥센 외., 2000) 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 탈염 후 열을에서 발견한 TE의 정확한 부피를 측정하고 37 0.3 M. 부화의 최종 농도 6.3 M NaOH를 추가 ° C를 15 분. </li><li> 최종 3 M의 농도 20 μg / μL tRNA 2 μL, 100 %의 에탄올 3 권 ~ 10 M NH 4 OAc (산도 7.0) 추가하고 다음 섞는다. 14,000 rpm으로 15 분 동안 원심 분리기. </li><li> , 70 % 에탄올로 한 번 펠렛을 씻어 짧은 원심 분리기를하고, 여분의 에탄올을 제거하십시오. </li><li> 25 5-10분 및 resuspend위한 speedvac에 건조 펠렛 - DNA의 양을 시작에 따라 100 μL TE 버퍼. 나트륨 bisulfite - 대우 DNA 지금은 PCR 분석을위한 준비가되었습니다. </li></ol> 3. PCR 증폭 <ol><li> unmethylated cytosines가 유라실로 변환되므로, 이것은 템플릿으로 bisulfite - 대우 DNA를 사용하여 큰 조각을 증폭하기가 어렵습니다. 따라서, 우리는 일반적으로 더 이상 500 BP보다 제품을 증폭하기 위해 primers를 디자인하지 않습니다. 순서 4 - KB MEA의 발기인을 위해, 우리는 primers 많은 세트를 설계하고 14 중복 조각이 전체 지역을 커버하기 위해 증폭 (샤오 외., 2003). </li><li> 순서 가기 - 스트랜드는 앞으로 입문서, I)를 설계 primers에 추가 긴 세포핵이없는 높은 어닐링 온도를 위해서는 G (구아닌)이 풍부한 지역을 선택, II) 변경 C (사이 토신) Y을 ( CG와 CNG 컨텍스트에서 pyrimidine) 및 T (thymine)에 남아있는 C를 변경합니다. 역방향 프라이머, I)을 설계에 C - 풍부한 지역을 선택, II) CG와 CNG 컨텍스트에서 R (purine)로 G를 변경하고 A (아데닌)에 남아있는 G를 변경합니다. </li><li> CG와 CNG 컨텍스트에서 R로 G를 변경하고 선택 역방향 프라이머, I)를 설계 A.에 남아있는 G를 변경 II); 순서 하단 스트랜드는 앞으로 입문서, I)를 설계에 C - 풍부한 지역을 선택 G - 풍부한 지역, II)는 CG와 CNG 컨텍스트에서 Y (pyrimidine)로 C를 변경하고 T.에 남아있는 C를 변경 </li><li> 우리는 일반적으로 각각의 PCR 증폭 (샤오 외., 2003)에 대한 템플릿으로 나트륨 bisulfite - 취급 DNA 1-2 μL를 사용합니다. PCR 제품은 다음 젤 삽입으로 정화하고 토포 TA 클로닝 벡터 pCR2.1 (Invitrogen)에 복제하는 조각의 정확한 크기를 확인하기 위해 젤 전기 영동으로 분석해야합니다. 하나의 식민지가 데리러와 교양되며 플라스미드 DNA가 추출 및 시퀀싱을위한 보냈습니다. </li></ol> 4. 서열 분석 bisulfite 배열의 원칙은 unmethylated 사이 토신은 PCR 제품의 thymine으로 증폭됩니다 pH5.0에서 나트륨 bisulfite의 높은 농도에 의해 가수 분해 deamination에 의한 유라실로 변환됩니다이며 5 메틸 사이 토신은 나트륨 bisulfite에 의해 수정되지 않습니다 반면 과 PCR 증폭 (.; Frommer 외, 1992. 클라크 외, 1994) 이후 사이 토신으로 남아 있습니다. 시퀀스 결과를 얻기 후에, 우리는 PCR의 증폭에 사용되는 스트랜드 특정 템플릿과 그것을 비교하십시오. 템플릿의 사이 토신 잔여물이 시퀀싱 결과 thymine으로 글을 읽는다면, 그것은 사이 토신이 methylated되지 않았음을 나타냅니다. 템플릿의 사이 토신 잔여물이 순서에있는 사이 토신 남아있을 경우, 그것은 사이 토신이 methylated는 것을 의미합니다. IV. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2327/2327fig1.jpg" alt="그림 1 /" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="/ 그림 1"> 그림 1.

<ol><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li>
<li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li>
<li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li>
<li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li>
<li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li>
<li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5%27-+methylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li>
<li>Rogers, S. O., &amp, B. endich, J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Manual%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Flower+Development+in+Arab%C3%ADdopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early Flower Development in Arabídopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li>
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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

그것은 배젖 및 종자 코트에서 배아를 분리하는 것이 비교적 쉽기는하지만 embryogenesis의 초기 또는 중간 단계에서 어뢰 특히 씨앗을 위해, 종자 코트에서 배젖를 구분 지루합니다. 종자 코팅은 일부 유전자에 대한 조직의 매우 작은 금액을 기여 때문에, 예를 들어, MEA와 FWA, 우리는 종자 코트에서 배젖를 구분하지 않아도됩니다. 우리가 배젖 및 종자 코트 조직의 혼합물에서 RNAS을 분리할 수있다는 것을 의미합니다 즉, 유전자의 모자 아버지 대립 유전자의 표현을 확인, 배 (胚)의 표현과 비교, 그리고 유전자의 각인 상태를 결정합니다. bisulfite 배열은 설계 primers는 스트랜드 특정해야합니다. 때로는 나트륨 bisulfite 치료에 의해 손상된 DNA 템플릿에 의한 bisulfite - 대우 게놈 DNA의 파편을 증폭하기 어려운, 우리는 일반적으로 서로 다른 지역 및 짧은 조각의 PCR primers의 다른 세트를보십시오. 제한 효소 소...

용품 <ul><li> 해부 현미경 </li><li> 가위 </li><li> 파인 팁 집게 </li><li> 쥬얼리 태그 </li><li> 플랜트 스테이크스 </li><li> 문자열이나 트위스트 - 넥타이 </li><li> 4 &quot;X 2&quot;X 8 &quot;폴리에틸렌 가방 </li><li> 3 &quot;X 1&quot;X 1.0 mm의 현미경 슬라이드 </li><li> 액체 질소 </li><li> 액체 질소 용기 </li><li> 열 차단 </li><li> PCR 튜브 </li><li> Thermocycler </li><li> Microcentrifuge 튜브 </li><li> Microcentrifuge </li><li> 겔 전기 영동 시설 </li><li> Arabidopsis thaliana 콜럼비아 - 0 식물 </li><li> Arabidopsis thaliana 랜즈 erecta 식물 </li></ul> 시약 <ul><li> 70 % 에탄올 </li><li> 95 % 에탄올 </li><li> 100 % 에탄올 </li><li> Sorbitol 0.3 M 5 MM MES - 산도 5.7 </li><li> Cetyltrimethyl 질산 브로마이드 (CTAB) </li><li> 100 % 에탄올 </li><li> Cholorform </li><li> 제한 효소 </li><li> 3 M NaOH </li><li> 6.3 M NaOH </li><li> 6.24 M 요소 / 4 M 나트륨 Bisulfite </li><li> 멸균 증류수 H 2 O </li><li> 10 MM의 히드로퀴논 </li><li> 마법사 DNA 청소 시스템 (Promega) </li><li> 10 M NH 4 OAc </li><li> 20 μg / μL tRNA </li><li> TE 버퍼 </li><li> 토포 TA 복제 키트 (Invitrogen) </li></ul>

에 각인 유전자의 dna methylation의 결정 arabidopsis 배젖

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana은 epigenetic 메커니즘을 연구를위한 훌륭한 모델 생물이다. 그 이유 중 하나는 DNA의 methyltransferases의 손실 함수 NULL의 돌연변이가 따라서 게놈에있는 DNA의 methylation의 손실이 성장과 발전에 미치는 영향 연구하는 시스템을 제공하고, 실용적입니다. 각인은 모자 아버지의 대립 유전자의 미분 표현을 나타냅니다과 포유 동물과 식물 모두에서 복제 개발에 중요한 역할을합니다. DNA의 methylation은 각인 유전자의 모자 또는 아버지 대립 유전자가 표현하거나 침묵 여부를 결정하는 것이 중요합니다. 꽃 식물에서, 복제에서 더블 수정 이벤트가있다 : 한 정자 세포는 배젖을 일으키다 수있는 중앙 세포와 배아 그리고 두 번째 정자 퓨즈를 형성하기 위해 난자를 fertilizes. 배젖은 각인이 공장에서 발생하는 조직입니다. 메데아, SET 도메인 Polycomb 그룹 유전자 및 FWA, 꽃을 조절 전사 인자는 배젖 및 표현에 인쇄되는 표시된 처음 두 유전자 아르의 DNA의 methylation과 demethylation에 의해 제어됩니다 식물. 유전자와 배젖의 methylation 패턴의 각인 상태를 결정하기 위해, 먼저 배젖를 분리 수 있어야합니다. 씨앗 Arabidopsis에서 작은 있기 때문에, 그것은 Arabidopsis 배젖를 분리하고 methylation을 확인하기 위해 도전 남아 있습니다. 이 비디오 프로토콜에서는, 우리는 씨앗에서 배젖 조직을 분리, 유전자 십자가를 실시하고, bisulfite의 시퀀싱에 의해 methylation 상태를 확인하는 방법을보고합니다.

각인은 식물과 동물의 복제에 현상입니다. DNA의 methylation은 각인의 메커니즘에서 중요한 역할을합니다. 배젖를 분리 및 각인 유전자의 methylation 상태를 결정<em&gt; Arabidopsis</em&gt;는 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 배젖를 분리하고 bisulfite의 시퀀싱에 의해 methylation을 결정하는 방법에 대해 설명합니다.

에 각인 유전자의 DNA Methylation의 결정 Arabidopsis 배젖

Arabidopsis thaliana는 후성유전학적 메커니즘을 연구하는 데 있어 매우 훌륭한 모델 생물입니다. 그 이유 중 하나는 DNA...의 기능 상실 결실 돌연변이체(loss-of-function null mutant)가 존재하기 때문입니다.

이 절차의 전반적인 목표는 배유 내 각인 유전자의 DNA 메틸화 상태를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 암컷 친식물을 제웅함으로써 수행됩니다. 그 후 암컷 친식물을 수컷 친식물의 꽃가루로 수분시킵니다.다음으로, 교잡 수분된 종자에서 배유를 분리합니다. 절차의 마지막 단계는 배유 DNA의 비설파이트 시퀀싱(bi sulfate sequencing)을 수행하는 것입니다. 최종적으로, 서로 다른 생태형의 DNA 시퀀싱 다형성과 비설파이트 시퀀싱을 통해 각인 유전자의 모계 또는 부계 대립유전자의 DNA 메틸화 상태를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 세인트루이스 대학교 생물학과 교수 Yang Shaw입니다. 안녕하세요, 저는 세인트루이스 대학교 생물학과 Dr.J 연구실의 Matthew Ray입니다. 저는 Dr.J 연구실의 Diman Panu입니다.오늘은 rugby officer를 해부하고 sulf FAR 시퀀싱을 통해 DNA 메틸화 상태를 결정하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 DNA 메틸화 및 탈메틸화에 의해 조절되는 유전자 각인 현상을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.본 절차를 시작하려면, DNA 서열 다형성을 이용하여 모계 및 부계 대립유전자를 구별할 수 있도록 암컷 및 수컷 부모로 사용할 서로 다른 두 가지 Arabidopsis ecotype을 선택하십시오. 여기서는 Columbia zero와 Landsberg Erecta를 각각 암컷 및 수컷 부모로 선택하였습니다. 젊고 건강한 식물을 선택하도록 주의하십시오.해부 현미경을 사용하여 모본의 수술을 제거합니다. 12단계 꽃을 찾아 가위로 꽃대 기부를 잘라 그 위아래의 모든 꽃이나 측꽃눈(LICs)을 제거합니다. 포셉의 끝부분을 95% ethanol이 담긴 비커에 살짝 담가 멸균합니다.이렇게 하면 핀셋에 묻은 모든 꽃가루 입자가 제거되고 꽃가루가 사멸합니다. 핀셋을 사용하여 꽃봉오리를 조심스럽게 벌린 후, 암술을 손상시키지 않고 그대로 둔 상태에서 4개의 꽃받침, 4개의 꽃잎, 6개의 수술을 주의 깊게 제거하십시오. 이 과정에서 심피가 손상되지 않도록 주의하십시오.다음 단계는 화분 공여체를 선택하고 수분을 수행하는 것입니다. 가장 적합한 화분 공여체는 꽃잎이 암술에 대해 90도 각도로 뻗어 있고 많은 화분이 비산되는 stage 14의 개화된 꽃입니다. 꽃의 기부와 꽃받침 바로 윗부분을 잡아 꽃이 활짝 펴지게 합니다. 준비된 암술의 주두에 약을 접촉시켜 수분시킵니다.수분 후, 암술머리는 노란색 꽃가루로 덮이며 이는 현미경으로 쉽게 관찰할 수 있습니다. 식물의 제웅된 모든 암술에 수분을 마친 후, 쥬얼리 태그를 사용하여 교배 정보를 표시하십시오. 여기에는 날짜와 암수 부모 식물에 대한 정보를 포함해야 합니다.식물 근처의 토양에 지지대를 세웁니다. 끈을 사용하여 형광 처리된 줄기를 지지대에 묶고, 수분된 암술을 플라스틱 봉투로 덮습니다. 수분 후 7~8일(DAP)이 지나면, 배아 발생의 중기에서 후기 어뢰기 단계에 도달하여 종자를 수확하고 해부할 수 있습니다.배유와 배를 관찰하기 위해, 수정 후 8일(DAP) 된 salic를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 핀셋 한 쌍으로 EK P cell을 잡고, 다른 핀셋의 끝을 사용하여 두심피가 융합되는 가장자리의 틈을 밀어서 엽니다. BPS 한 쌍을 사용하여 종자 하나를 집어 유리 슬라이드 위에 놓습니다.그런 다음 마이크로 핀셋 끝부분을 살짝 절개하여 배를 밀어내어 꺼냅니다. 절개하지 않은 끝부분을 짜내어 배유를 밀어내고 종피와 분리합니다. 이어서 배와 배유를 각각 별도의 마이크로 튜브에 넣고 액체 질소에 보관합니다.10~15개의 CLIC으로부터 충분한 배 또는 배유가 축적될 때까지 이 과정을 반복하십시오. 그 후, 비설파이트 처리 전까지 튜브를 -80°C 냉동고에 보관하십시오. subtle trimethyl ammonium bromide 또는 CTAB법을 사용하여 배유 또는 배의 게놈 DNA를 분리하십시오.배유 게놈 DNA가 분리되면, 분석 대상 영역 외부를 절단하는 제한 효소를 사용하여 총 부피 20 µL의 반응액에서 100 ng을 소화시킵니다. ME 프로모터의 경우 제한 효소로 xh, O one ND one 및 PST one을 사용합니다. DNA를 5분 동안 가열하여 제한 효소를 변성시킵니다.그런 다음 얼음 위에서 반응을 중지시킵니다. 3 M 수산화나트륨을 전체 부피의 9분의 1 또는 2.2 µL 첨가하고 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 용액을 250 µL PCR 튜브로 옮깁니다.다음으로, 6.24 M urea 및 4 M sodium metabisulfite 용액을 제조합니다. 10 mL의 멸균 증류수에 urea 7.5 g을 녹인 후, 용액을 가열 및 교반하면서 1~2시간에 걸쳐 sodium metabisulfite 7.6 g을 천천히 첨가합니다. 완전히 용해되면, 새로 제조한 10 M sodium hydroxide를 사용하여 pH를 5로 조정합니다.멸균 증류수를 가하여 최종 부피를 20 milliliters로 맞춥니다. 이 용액 208 microliters를 변성된 배유 게놈 DNA 22.2 microliters에 옮깁니다. 그 다음, 갓 제조한 10 millimolar hydroquinone 12 microliters를 DNA에 첨가합니다.PCR 기기를 사용하여 55 °C에서 15분, 이어서 95 °C에서 30초로 30회 사이클의 비설파이트 처리를 수행합니다. 다음으로, Promega사의 Wizard DNA cleanup system을 사용하여 비설파이트 처리된 DNA를 탈염합니다. 제조사의 지침에 따라, 탈염 후 컬럼에서 회수된 TE의 정확한 부피를 측정합니다.그 후 6.3 M 수산화나트륨을 첨가하여 최종 농도가 0.3 M이 되게 합니다. 혼합물을 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 10 M 아세트산암모늄을 최종 농도 3 M이 되도록 첨가하고, 20 µg/µL tRNA 2 µL와 100% 에탄올 3배 부피를 첨가합니다.시료를 혼합하고 14,000 RPM에서 15분 동안 원심분리합니다. 펠렛을 70% ethanol로 한 번 세척한 후, 짧게 원심분리하여 잔류 ethanol을 제거합니다. 마지막으로 스피드백에서 펠렛을 5분 동안 건조시킨 다음 25 µL의 TE buffer에 재현탁합니다.소듐 BI cite 처리된 DNA가 이제 PCR 분석을 위한 준비가 되었습니다. 4kb Madea 프로모터를 시퀀싱하기 위해 다수의 프라이머 세트를 설계하고, 전체 영역을 커버할 수 있도록 14개의 중첩 단편을 증폭하십시오. 먼저 상위 가닥을 시퀀싱하기 위한 정방향 프라이머를 설계하는 것부터 시작하십시오.먼저, 프라이머에 과도하게 긴 뉴클레오타이드를 추가하지 않고도 더 높은 어닐링 온도를 확보하기 위해 구아닌(guanine)이 풍부한 영역을 선택하십시오. 다음으로, CG 및 CNG 서열 내의 사이토신(cytosine)을 페리닌(perinine)으로 변경하십시오. 그 후, 그 외의 모든 사이토신을 티민(thymine)으로 변경하십시오.역방향 프라이머를 설계할 때, 사이토신이 풍부한 영역을 선택하십시오. CG 및 CNG 맥락의 구아닌을 퓨린으로 변경하고, 그 외의 모든 구아닌은 아데닌으로 변경하십시오. 하단 가닥을 다시 시퀀싱하려면, 먼저 정방향 프라이머를 설계하십시오.시토신이 풍부한 영역을 선택하고 CG 및 CNG 컨텍스트의 구아닌을 퓨린으로 변경하십시오. 그 외의 구아닌은 아데닌으로 변경하십시오. 역방향 프라이머를 설계할 때는 AINE가 풍부한 영역을 선택하십시오.CG 및 CNG 컨텍스트의 사이토신을 파리딘으로 변경하고, 나머지 사이토신은 티민으로 변경합니다. 프라이머 설계가 완료되면, 각 PCR 증폭을 위해 소듐 바이설파이트 처리된 DNA 2 µL를 템플릿으로 사용하여 PCR 반응액을 준비합니다. PCR 반응을 수행하고 젤 전기영동으로 생성물을 분석하여 단편의 크기가 정확한지 확인합니다.다음 젤을 준비합니다. PCR 생성물을 정제하고 이를 Invitrogen topo TA 클로닝 벡터 PCR 2.1에 클로닝합니다. 개별 클론을 삽입물로 사용해 서열 분석을 수행하며, 비설파이트 시퀀싱의 원리는 pH 5.0의 고농도 아황산나트륨에 의한 가수분해 탈아미노화로 인해 메틸화되지 않은 사이토신이 우라실로 전환된다는 것입니다.반대로, 5-메틸사이토신은 아황산나트륨에 의해 변형되지 않습니다. 우라실은 PCR 생성물에서 티민으로 증폭되는 반면, 메틸화된 사이토신은 PCR 증폭 후에도 사이토신으로 남아 있습니다. 시퀀싱 결과를 얻은 후, 이를 PCR 증폭에 사용된 가닥 특이적 템플릿과 비교하십시오.템플릿의 시토신 잔기가 시퀀싱 결과에서 티민으로 읽히면, 해당 시토신이 메틸화되지 않았음을 나타냅니다. 템플릿의 시토신 잔기가 시퀀싱 결과에서도 시토신으로 남아 있다면, 이는 해당 시토신이 메틸화되었음을 의미합니다. Columbia, g Clarus와 RLD 배유 교배종의 시퀀싱된 클론에서 MEA 프로모터의 -500 bp 영역 내 5개 메틸화 CPG 부위에 대한 모계 MEA 대립유전자의 메틸화 상태가 표시되어 있습니다. 메틸화된 시토신은 검은색 채워진 원으로, 메틸화되지 않은 시토신은 흰색 빈 원로 표시됩니다. 마찬가지로 Columbia, Gladys와 RLD 배아 교배종의 모계 Madea 대립유전자에 대한 메틸화 상태가 표시되어 있습니다.지금까지 배유를 분리하고 이 절차를 수행할 때 아황산염 시퀀싱을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 프로토콜을 정확하게 따르는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이상입니다.시청해주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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