Name: 분리 및 체외에서 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-31T19:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans 수컷의 정자 분리 및 체외 활성화 방법을. 프로테아제 처리를 통해 정자 형태를 시각화하고 생식 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 사무엘 구청 감사, 다이앤 C.이 기술을 개척을위한 쉐익스과 그레고리 넬슨. 우리는 활성 마리의 정자 수야을 보여주는 동영상을위한 파반 Kadandale와 브라이언 Geldziler 감사, 도움이 토론에 대한 Singson 연구실의 구성원, CGC 종자와 NIH에 대한 권한을 부여 (R01HD054681)를 통해 우리를 지원하십시오.

남성 인구의 1) 농축 <ol><li> 실험 필요에 따라 남성의 큰 숫자는 다음 전략 중 하나를 채용하여 구할 수 있습니다 : <ol><li> 야생 타입 남성의 큰 인구는 NGM 판의 중앙에 OP50 씨앗의 작은 잔디 5 야생 타입 남성 1 남녀 추니를 건너하여 얻을 수 있습니다. 성공 세대의 약 50 %가 야생 타입 남성 것입니다. </li><li> 그를 - 5 (e1490) 또는 그를 - 8 (e1489) 나온것 그를 - 5. 남성의 큰 숫자를 던져 그를 - 8 남성 비옥하고 정자의 형태와 기능에 명백한 결함이 없습니다. 그래서, 그를 - 5 또는 그와는 - 8 남성은 많은 실험을위한 야생 타입 남성 대신에 사용할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 남성 2) 식별 및 격리 <ol><li> 벌레의 꼬리 형태를 검사하고, 남성 웜 꼬리가 반올림됩니다. </li><li> L4 무대 남성을 선택하고 E. 가진 NGM 접시 씨앗에게 전송 대장균은 그들이 하루나 이틀 성장 OP50 및하자. 나온것의 부재로 성장 독신 남성은 정자의 손실을 방지하고 따라서 spermatids의 많은 수의 실험 절차를 수행하는 동안 사용 가능한 것입니다. </li><li> 해부의 날, 세균없이 NGM 접시에 독신 남성을 전송하고 그들이 몇 분 동안 크롤 링을 보자. 이 단계는 E. 작은 레이어를 제거하는 데 도움이됩니다 대장균은 벌레의 표면에 준수. 또는 버퍼로 시계 유리 및 전송 남성의 M9 버퍼 (6g 나 2 HPO 4, KH 2 PO 3g 4 5g NaCl, 0.25g MgSO 리터 당 4 0.7 H 2 O)의 피펫 소량. </li></ol> 남성과 체외 활성화 3) 해부 <ol><li> 유리 슬라이드를 타고 자궁 펜을 사용하여 작은 원을 표시합니다. 피펫 1X 정자 매체 30-50 μl (50mM HEPES, 25mM KCl, 45mM NaCl, 1mM MgSO 4, 5mM CaCl 2, 10mM 덱스 트로 오스, 산도 7.8) 원 안에. 소수성 원은 그 경계 내에서 정자 매체를 유지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 정자 매체에 50-10 수컷을 전송합니다. </li><li> 현미경 슬라이드를보기, 당신 손 모두에서 27 게이지 바늘로 연결된 두 주사기를 개최. </li><li> 벌레를 '대기'와 spermatids를 공개 남성의 뒷부분 끝을 잘라 다른 바늘을 사용하여 하나의 바늘을 사용합니다. </li><li> 벌레를 절단하는 것은 대개 즉시 spermatids의 수많은 퇴학. spermatids는 분 스테레오 현미경 '과립'로 볼 수 있습니다. 그러나, 때로는 일부 또는 spermatids의 대부분은 시체 내에 남아있을 수 있습니다. 이 경우에는 조심스럽게 유리 슬라이드 위에 시체 '를 드래그하면'시체에서 spermatids의 출시를 용이하게 수 있습니다. </li><li> spermatids를 활성화하려면, Pronase 전자 (20μg/ml)를 포함하는 1X 정자 중간에 벌레를 해부하다하고 5 분 동안 앉아 보자. </li><li> 슬라이드 실험의 시점에서 건조되는 것을 허용하지 않습니다. 필요한 경우 더 많은 1X 정자 매체를 추가합니다. </li></ol> spermtids와 마리의 정자 수야 4) 시각화 <ol><li> 부드럽게 해부 표본의 표면에 coverslip을 넣으십시오. </li><li> 낮은 배율 (10X)에서 spermatids 분야 찾기 </li><li> 보통 100X 기름 침지에서 - spermatids 또는 마리의 정자 수야의 세밀한 부분이 더 높은 배율로 이동하여 볼 수 있습니다. </li></ol> 5) 대표 결과 남성 C. 엘레간스으로부터 격리 spermatids의 DIC 이미지의 예제는 그림 1에 표시됩니다. Spermatids는 형태 구형이며 핵은 유수 있습니다. 체외 활성화의 정자에서는 그림 2에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1. C.의 DIC 이미지 엘레간스의 spermatids. <img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig2.jpg" alt="그림 2"> 그림 2. 체외 활성화 C로의 DIC 이미지 엘레간스은 마리의 정자 수야.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Spe 돌연변을 분석뿐만 아니라,이 프로토콜은 노화와 정자의 형태를 분석과 같은 다른 중요한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 이 프로토콜을 사용 Spermatids과 격리 마리의 정자 수야는 야생 타입과 돌연변이 정자 8, 9, 슬라이드 10, 생리적 측정 9, 11, 또는 인공 수정 12 정자의 운동성의 immunostaining 같은 다른 스트림 실험에서 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>투베르쿨린 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td>주사기: 1 ml, 바늘:&lt;br/&gt;27G X &amp;#189; in</td></tr><tr><td>Pap 펜</td><td>Zymed Laboratories, Inc.</td><td>00-8888</td><td></td></tr><tr><td>VWR VistaVision HistoBond 현미경 슬라이드</td><td>VWR international</td><td>16004-406</td><td>크기:&lt;br/&gt;75X25X1mm</td></tr><tr><td>커버 글라스</td><td>VWR international</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6911</td><td></td></tr></tbody></table>

분리 및 체외에서</em의> 활성화 caenorhabditis 엘레간스 정자

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

남성과 나온것은 선충류 C. 엘레간스에있는 두 자연스럽게 발견 성적 양식입니다. amoeboid 정자는 남성과 나온것 모두에 의해 생성됩니다. 300 - - gametogenesis의 이전 단계에서 나온것의 배아 세포는 정자의 제한 번호로 차별과 spermatheca라는 작은 &#39;가방&#39;에 저장됩니다. 나중에, 지속 oocytes 1 생산 나온것. 반면, 남성들은 성인에 걸쳐 독점적으로 정자 생산하고 있습니다. 남성은 전형적인 성인 웜 2 전체 세포의&gt; 50 %를 차지하고 그 많은 정자를 생산하고 있습니다. 따라서 남성의 정자를 분리하는 것은 나온것의에서보다 쉽습니다. 남성의 극소수는 자연의 X 염색체 3 자연 이외의 분리로 인해 생성됩니다. 보다 편리하게 남성 또는 그에게 상승을주는 돌연변이의 소개 (수컷의 높은 발병률) 표현형로 나온것 크로싱하면 그 중 하나가 남성 인구 3 풍부 수있는을 통해 전략의 일부입니다. 남성은 쉽게 꼬리 형태 4을 관찰하여 나온것 구별하실 수 있습니다. 남성 꼬리가 짝짓기 구조 둥근 반면 남녀 추니 꼬리는 지적이다. 꼬리를 잘랐다 남성의 생식 요로 내에 저장된 spermatids의 수많은 출시. 해부가 27 게이지 바늘을 사용하여 스테레오 현미경으로 수행됩니다. spermatids가 실제로 다른 세포와 연결되지 않은 상태 때문에, 유압 압력 spermatids이 남성을 포함한 신체의 내부 내용을 퇴학. 말스 직접 &#39;정자 보통&#39;의 작은 방울을 해부하고 있습니다. Spermatids는 산도의 변경에 민감합니다. 따라서 HEPES, 좋은 버퍼링 용량을 가진 화합물은 정자 미디어에서 사용됩니다. 포도당과 정자 매체에있는 다른 소금은 정자의 무결성을 유지하기 위해 삼투압을 유지할 수 있도록 도와주십시오. 마리의 정자 수야에 spermatids의 포스트 meiotic 분화는 spermiogenesis 또는 정자의 정품 인증을 칭했다있다. 5 쉐익스하고, 넬슨 6 이전 라운드 spermatids 여기서 우리는 C.의 체외 spermiogenesis에서 보여주는 Pronase E. 등 다양한 활성화 화합물을 추가하여 마리의 정자 수야으로 차별화할 수있는 유도했다 Pronase E.을 사용 엘레간스의 spermatids 성공 spermiogenesis 임신을위한 필수 조건이며 따라서 spermiogenesis에 결함이 돌연변이 멸균됩니다. 지금까지 여러 가지 돌연변이가 특별히 spermiogenesis 과정 7 결함이 표시되었습니다. 이상은 소설 Spe (Spermatogenesis 결함)의 체외 활성화에 돌연변이 우리가이 행사에 참여 추가 선수를 발견할 도움이 될 중에 발견했습니다.

남성에서 spermatids을 분리하고 활성화하기위한 프로토콜<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; 여기에 설명되어 있습니다. 남성 자료 spermatids의 뒷부분 끝을 절단. spermatids은 프로 테아제를 추가로 활성화할 수 있습니다.

분리 및 체외에서</em의> 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자

선충인 C. elegans에서 자연적으로 발견되는 두 가지 성적 형태는 수컷과 자웅동체입니다. 아메바형 정자는 수컷과...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 정자의 형태를 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 해부를 위해 수컷을 하루 전에 분리합니다. 절차의 두 번째 단계는 수컷을 해부하여 정자를 방출시키는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 정자 형태를 시각화하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 후속 응용 분석을 위해 정자를 준비하는 것입니다. 최종적으로, 정자의 형태와 체외 활성제 처리를 통한 활성화 능력을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.정자 분리 및 활성화 프로토콜은 30여 년 전 Sam Ward, Diane Shakes, Gregory Nelson에 의해 처음 개발되었습니다. 현재 우리는 이 절차를 사용하여 C elegance의 정자 기능과 가임력을 변화시키는 돌연변이를 특성화하고 있습니다. 이 절차의 전반적인 목표는 CL elgan a OID 정자의 형태를 시각화하는 것입니다.이는 해부 하루 전 수컷을 격리하여 금욕 상태를 유지함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 수컷을 해부하여 원형의 비모달 정세포(non modal spermatids)를 방출시키는 것입니다. 세 번째 단계는 정세포가 시험관 내에서 활성화되어 성숙한 AME 정자 형태가 되는 것을 시각화하는 것입니다.본 실험 절차는 연구실의 세 명의 박사후 연구원인 Dr.Matt Marchello, Dr.Chatterjee, Dr.Guna SLU가 정자 분리 과정을 통해 시연할 것입니다. 먼저, nematode growth medium(NGM) 플레이트 중앙에 e coli OP 50 박테리아를 도말한 작은 lawn 위에서 야생형 수컷 5마리와 자웅동체 1마리를 교배시켜 다수의 수컷을 확보하십시오.다음 세대의 약 50%는 수집 대상인 야생형 수컷이 됩니다. 해부 현미경 하에서 L4 단계 수컷의 발달 단계와 꼬리 형태를 관찰합니다. 꼬리 형태를 기준으로 L4 단계의 벌레를 선택합니다.수컷 벌레는 둥근 꼬리를 가진 반면, 자웅동체는 뾰족한 꼬리를 가집니다. 백금선을 사용하여 실험당 7~10마리의 4단계 수컷 L을 선택해 OP 50이 도말된 NGM 플레이트로 옮기고 하루나 이틀 동안 배양합니다. 자웅동체가 없는 환경에서 독신 수컷을 배양하면 정자의 손실을 방지할 수 있으며, 결과적으로 실험 과정 동안 다량의 정자를 확보할 수 있습니다.해부를 시작하기 전, DI 인산수소나트륨 6g, 인산일칼륨 3g, 염화나트륨 5g, 7수화 황산마그네슘 0.25g, 그리고 정자 배지 5mL를 리터당

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

에서 세포 외액의 Vampiric 절연<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

선충은 실험실에서 쉽게 번식할 수 있습니다--부분적으로는 자웅동체가 자가 수정을 통해 번식할 수 있기 때문입니다. 그러나, 유전자 교배 및 기타 실험은 많은 수의 수컷을 필요로 할 수 있습니다. 이 비디오는 수컷 예쁜꼬마선충을 위해 풍부하게 하는 방법을 설명합니다.

수컷을 위한 풍요로움: 수컷 예쁜꼬마선충의 재고 유지

이 비디오는 초기 배아에서 C. elegans 할구를 분리하는 방법을 소개합니다. 그 결과로 생성된 세포는 세포 배양 또는 생체 외 실험에 적합합니다.

C. 예쁜꼬마선충 배반구 해부: 난자 껍질을 제거하고 배아 세포를 해리하는 방법

우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

계란에서 웜 (EIW) 분석은 달걀 누워 행동을 정량화 할 수있는 유용한 방법입니다. 달걀 부설의 변화는 모델 유기체의 행동 반응 할 수...

에 박테리아의 효과를 측정<em&gt; C. 엘레</em계란 보존 분석을 사용하여&gt; 행동

정자는 성공적으로 난 모 세포를 비료를 통해 이동 해야 합니다. 여기에서, 우리는 C에서 정자 이동 측정에 대 한 분석을 설명 합니다 .  이 분석은 결합 후 자 궁 내 정자 분포에 대 한 정량적 데이터 뿐만 아니라 속도, 방향 속도 및 반전 주파수를 제공 할 수 있습니다.

정자 지도 및 운동 성 아닌 간 남녀 양성 생식 기관에서 측정

유전적으로 통할 수 있는 선충성 Caenorhabditis elegans는 약물 발견을 위한 간단하고 저렴한 모델로 사용될 수 있습니다. 여기에 설명된 RAS 및 EGFR 단백질의 하류 신호를 억제하는 항암 치료제를 식별하는 프로토콜이 있다.

Caenorhabditis elegans를 사용하여 EGFR 및 RAS 억제제의 식별

여기서는 애벌레 4C. 예르간 에서 활성 핵 추출물을 분리하고 체외 시스템에서 전사 활동을 시각화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

생체외 전사에 대한 활성 Caenorhabditis elegans 핵 추출물 및 재구성의 고립

여기에서 우리는 모델 유기체 C. elegans를 사용하여 배아 생존력과 생산된 배아(새끼)의 총 수를 결정하는 일반적인 방법을 제시합니다.

Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

이 프로토콜은 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 휘발성 성 페로몬에 대한 반응을 추출하고 정량화하는 방법을 확립하여 화학적 통신 및 탐색 궤적을 연구하기 위한 도구를 제공합니다.

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

여기에서는 모델 선충 C. elegans의 생식계에서 발현되는 유전적으로 암호화된 칼슘 리포터를 사용하여 수정 및 초기 배발생 중 칼슘을 시각화하기 위한 프로토콜과 도구를 제시합니다.

In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

학습하세요 Caenorhabditis elegans 수컷의 정자 분리 및 체외 활성화 방법을. 프로테아제 처리를 통해 정자 형태를 시각화하고 생식 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

분리 및 체외에서 활성화 Caenorhabditis 엘레간스* 정자*

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