Name: 인간의 T Lymphocytes에서 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 기록 (CRAC) 해류 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: 배우세요 인간 T 림프구에서 CRAC 해류를 전체 세포 패치 클램프 기법으로 기록하는 방법을. 이 기술은 T세포 활성화와 면역 질환 연구에 필수적인 칼슘 신호 전달 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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우리는 시설과 이온 채널의 연구에 대한 훌륭한 환경으로 우리를 제공 생리학 및 분리막 생물, 캘리포니아 데이비스 대학의학과에 감사하고 있습니다.

1. 휴식 인간의 T Lymphocytes의 준비 <ol><li> RosetteSep 인간 T 세포 농축 칵테일과 RosetteSep 밀도 매체를 사용하여, 제조 업체의 지시에 따라 인간의 혈액 샘플에서 T 세포를 정화. 그 결과 세포 인구는 95 % 인 경우에는 3 번 CD + 쉬고있는 T 세포를 포함해야합니다. 우리는 UC 데이비스 내부 검토위원회의 승인을 프로토콜에 따라 건강한 지원자에서 수집한 말초 혈액 샘플에서 인간의 T lymphocytes 정화. </li><li> 분리 후 10 % 태아 송아지 혈청, 2퍼센트 GlutaMAX - I, 1 % RPMI 1640과 보충, 글루타민과 HEPES와 RPMI - 1640 매체를 포함하는 세포 배양 매체에서 0.5 X 10 6 세포 / ML의 밀도에 쉬고 T 세포를 resuspend 비타민 용액, 1 % RPMI 1640 아미노산 용액, 1 %의 나트륨 pyruvate, 그리고 0.03 % β - 메르 캅 토 에탄올. </li><li> 플레이스 세포 세포 배양 flasks에 서스펜션과 ° humidified 인큐베이터에서 C 5 % CO 2와 함께 최대 24 H하기 전에 실험을 위해 37 유지합니다. </li></ol> 2. 기록 회의소의 준비 <ol><li> 다음은 녹화 회의소를 준비하는 데 필요한 :) B, A) 실리콘 O - 링을 회전, 70 % 에탄올과 증류수 H 2 O, C와 함께 청소를 25 mm coverslips)는 Sylgard184를 혼합 제조 업체의 지시에 따라 준비하고, D) 이 60 X 15mm 페트리 요리. </li><li> 플레이스 ~ 60x15 - mm 배양 접시에 혼합 Sylgard184 0.5 ML. </li><li> Sylgard184 사용 포셉에 O - 링의 하단 부분을 찍어. </li><li> 같은 다른 배양 접시로 깨끗한 표면에 O - 링을 배치하여 O - 링의 가장자리에서 초과 Sylgard184를 제거합니다. </li><li> coverslip에 반지를 놓고 그것을 아래로 누르십시오. </li><li> 85 ° 40-60 분 또는 Sylgard184까지 C가 polymerized입니다에서 실 가열하여 Sylgard184 치료. </li><li> 먼지없는 용기에 녹화 실에 보관하십시오. </li></ol> 3. 패치 Pipettes의 준비 <ol><li> 실험 당일, 유리 모세관 및 피펫 풀러를 사용하여 ~ 2 μm의 팁 직경 pipettes를 가져옵니다. 우리는 필라멘트 (1.5 mm 및 ID : 1.10 mm OD)와 borosilicate 튜빙을 사용합니다. 먼지없는 위치에 저장 pipettes. </li><li> 표준 절차에 따라 9 Sylgard184 또는 HIPEC R6101 반도체 보호용 코팅 코트 피펫은 팁. </li><li> 부드럽게 실험 전에 pipettes를 해고 - 폴란드어. </li></ol> 4. 패치 클램프 설치 준비 <ol><li> 여러분의 패치 - 클램프 앰프를 제어 소프트웨어의 gigaseal 형성에 대한 매크로를 구성하고 저장합니다. 우리는 Windows XP 및 데이터 수집을위한 펄스 소프트웨어에 의해 지원되는 EPC - 10 앰프를 사용합니다. 우리는 EPC - 10 사용 설명서에 따르면, "에 셀 '및'전체 셀"매크로 "설정"을 설정하고 모든 실험에 사용합니다. </li><li> 이전 실험 목욕 솔루션 및 표 1에 나와있는 피펫 솔루션을 준비하고 최대 일주 4 ° C에 그들을 저장할 수 있습니다. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 화학 제품 </td><td colspan="3"> 바스 솔루션 (㎜) </td><td> 피펫 솔루션 (㎜) </td></tr><tr><td></td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3 나 </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td> CA (OH) 2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> CS -spartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> BAPTA </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> 표 1. 전체 셀 CARC 현재 레코딩을위한 솔루션을 제공합니다. 모든 화학 물질은 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO에서 구입한했다. <ol start="3"><li> 패치 피펫 솔루션과 각 목욕 솔루션 10 ~ 액상 접합 잠재력 (LJ)를 결정합니다. 당신의 수집 소프트웨어를 사용하여 적절한 장소에 LJ 값을 저장합니다. 예를 들어, 펄스 프로그램의 "앰프"창에서 "LJ"컨트롤에 LJ 값을 삽입합니다. </li><li> 실험 전에 수집 소프트웨어의 적절한 장소에서 그림 1에 표시된 자극 프로토콜, 구성 및 저장합니다. 펄스 프로그램에서 우리는 "펄스 생성"창에서 수집 프로토콜을 설정합니다. <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. . 자극 프로토콜 -120에서 기간 50 MS의 백 뮤직 비디오에 전압 램프마다 0.2를 적용 - 2 s을 (5-0.5 Hz에서). 구불 구 사이의 개최 가능성 (V H)는 30 MV에서 관리하고 있습니다. </li></ol> 5. 현미경 스테이지에 장착 셀 <ol><li> 세포를 도금하기 전에 다음 ~ 20 분 및 세척 H 2 O와 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)에 대한 폴리 - L - 라이신과 코트 녹화 실 있습니다. </li><li> 37 20 분 챔버 및 부화에 0.2-0.5 X10 6 셀을 포함하는 세포 현탁액의 플레이트 500 μL ° C. </li><li> 챔버 홀더에 부착된 세포로 녹음 챔버를 고정합니다. 우리는 맞춤 제작 챔버베이스 coverslip의 바닥을 지원 홀더, coverslip의 상단으로부터 상단 부분은 부드럽게 프레스 동안.를 사용하여 </li><li> 거꾸로 현미경의 무대에 챔버 홀더를 놓습니다. </li><li> 전송 빛의 세포에 초점. 우리는 40X 기름 침지 목표를 사용합니다. </li><li> 욕조에 자세 / AgCl 기준 전극을 삽입합니다. </li><li> multibarrel 중력 기반의 재관류 시스템을 맞춥니다. 유입 튜브의 끝은보기의 필드에 coverslip 가까이에 45 ° 각도로 배치해야합니다. </li><li> 유입 튜브 끝에 반대 흡입 튜브를 놓습니다. </li><li> 와 챔버 Perfuse 인산염 버퍼 호수 (PBS) 또는 HBSS은 세포 배양 매체와 느슨하게 연결된 세포를 멀리 세척하십시오. </li></ol> 6. CRAC 채널 해류 녹음 <ol><li> 단단히 coverslip에 연결된 세포를 찾아보십시오. 우리는 일반적으로 부드러운 외부 표면과 평균 크기, 원형 셀을 선택합니다. </li><li> + - 무료, 3 MM MG 2 + 함유 목욕 솔루션 SERCA 펌프를 차단하기 위해 80-10 분 0.5-1 μm의의 thapsigargin를 포함하는 # 1 (표 1) 칼슘 2 녹음 챔버를 Perfuse. 우리는 이전 gigaseal 형성하기 위해 저장소를 고갈이 단계를 수행합니다. </li><li> Eppendorf microloader와 P - 20 변위 피펫을 사용하여, 피펫 솔루션 (표 1)과 함께이 패치 피펫을 기입하여 증폭기 headstage에 피펫 홀더에 패치 피펫를 삽입합니다. 칼슘 2 + chelator BAPTA는 수동적으로 저장을 고갈하고 + 종속 CRAC 채널 불활 성화 칼슘 2 줄이기 위해 피펫 솔루션에 포함되어 있습니다. </li><li> 패치 피펫 내부 욕조에 들어가기 전에 긍정적인 압력 (H 2 O 중 ~ 3 인치)의 작은 금액을 적용합니다. 우리는 가압 공기와 패치 피펫 내부 긍정적이거나 부정적인 압력을 만들 진공 라인에 연결된 사용자 정의 - 만든 압력 흡입 장치를 사용합니다. </li><li> 현미경을 통해 시각적인 통제 욕조에 패치 피펫을 낮추십시오. "오실로 스코프"창에서, 당신은 피펫을 통해 흐르는 전류를 볼 수 있습니다. 현재 진폭의 단계와 같은 변경 사항이 미리 매크로에 의해 적용되는 작은 진폭 전압 펄스 (시험 펄스)에 의해 유도해야합니다. 이 시점에서, 당신은 피펫 저항의 가치를 확인할 수 있어야합니다. 우리 pipettes의 저항은 일반적으로 5-6 MΩ입니다. </li><li> 피펫 및 참조 전극 사이에 생성된 "오프셋"잠재력을 수정합니다. </li><li> 그것은 세포막을 만지는 때까지 현미경을 통해 시각적인 통제, 가까이 세포에 피펫 팁을 가지고. </li><li> 패치 피펫 내부 부정적인 압력 (H 2 O의 20~40인치)을 적용합니다. </li><li> "오실로 스코프"창에서 gigaseal 형성을 모니터링합니다. 당신은 시험 펄스, 감소 및&gt; 5 GΩ에 피펫 저항 증가의 가치에 의해 유도 전류의 진폭을 볼 수 있습니다. 철 이내 gigaseal 형태w 초,하지만 그것은 안정 gigaseal을 달성하기 1-2 분 정도 걸릴 수 있습니다. </li><li> 피펫 커패시턴스 ( "C - 빠른")에 대한 보상. </li><li> 20 CC 주사기를 사용하여 추가 부정적인 압력을 적용하여 패치 막 브레이크. </li><li> 30 MV에 보관 잠재력을 설정합니다. 긍정적인 지주 잠재 칼슘 의존 CRAC 채널 불활 성화를 방지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 세포의 막 커패시턴스 ( "C - 느린")에 대한 보상, C - 느린의 가치를 저장하거나 기록합니다. </li><li> 액세스 저항 "R S"의 가치를 확인합니다. 우리의 실험에서는 R S는 일반적으로 MΩ 70-20 있습니다. </li><li> + 무료 3 MM MG 2 + 함유 목욕 솔루션 # 1 칼슘 2 0.5 Hz의 주파수 (그림 1)과 전압 구불 구 일련의 사항을 적용하려면 시작합니다. MG 2 +에 대한 CRAC 채널의 가난한 투자율에 의한 "누설"현재와 비교하여 본 솔루션에서는 CRAC의 전류 negligibly 작습니다. 저장하고 "누출"조류로서 향후 분석에서 목욕 솔루션 # 1에 기록된 현재 추적을 사용합니다. -100 MV에있는 "누설"현재의 절대 진폭 미만 또는 5 PA 동일해야합니다. 세포는 "새는"있다면, 새로운 패치 피펫하고 새로운 세포를 사용을 통해 실험 시작을 중지합니다. </li><li> CRAC 채널 (I CA - CRAC)를 통해 칼슘 2 + 전류를 기록하려면 재관류 밸브 전환 20 MM 칼슘 2 + 함유 목욕 솔루션 # 2 (표 1)과 칼슘 2 + 무료 3 MM MG 2 + 함유 목욕 솔루션 # 1을 대체합니다. 이것은 칼슘 2 + CRAC 채널을 통해 흐름에 가능하며 내향 전류를 생산하고 있습니다. "오실로 스코프"창에서, 당신은 내심 I CA - CRAC (그림 2) 정류의 개발을 볼 수 있습니다. 부정적인 전압에서 전류 진폭은 칼슘 2 CRAC 전류의 + 종속 potentiation로 인해 약 1 분 계속 증가할 것입니다. </li><li> CRAC 채널을 통해 과도 나 + 전류를 기록하는 데 필요한 5 Hz에서, 전압 경사로와 함께 자극의 빈도를 늘리십시오. </li><li> 20 MM를 교체 칼슘 2 + 함유 재관류 밸브를 전환하여 나 + 함유 이가의 양이온 무료 솔루션 # 3 (표 1) 욕조 솔루션 # 2. "오실로 스코프"창에서, 당신은 안쪽으로 나를 정류 큰 진폭의 과도 발전을 볼 수 + ​​현재 CRAC 채널 (I 나 - CRAC, 그림 2)를 통해. </li><li> 하나는 20 MM 칼슘 2 "누설"현재를 기록하는 실험의 끝에 1-5 μm의 라 3 +를 포함하는 + 함유 목욕 솔루션 # 2를 적용할 수 있습니다. 그러나, 우리는 시간이 지남에 "누출"현재 변경하기 때문에이 방법은 유용하지 않았고 그것은 실험의 끝에 크거나 작게 될 수 있습니다. 우리는 칼슘이에 기록된 현재 + 무료 3 MM MG 2 "누설"현재와 같은 실험의 시작 부분에 + 함유 목욕 솔루션 # 1.을하는 것을 선호 </li><li> 자세한 분석을 위해 기록된 현재의 흔적을 저장합니다. </li></ol> 7. 데이터 분석 <ol><li> 분석 소프트웨어에 저장된 현재 레코드를 검색할 수 있습니다. 우리는 분석을위한 펄스 프로그램을 사용합니다. </li><li> 처음에과 전압 경사로의 끝부분에 현재 amplitudes를 측정. 우리는 일반적으로 -100 뮤직 비디오에서와 펄스 프로그램의 "오실로 스코프"창에서 커서의 쌍을 사용하여 100 뮤직 비디오에서 현재 amplitudes를 측정합니다. </li><li> 자세한 분석 및 그래픽 프레 젠 테이션 그래픽 프로그램으로 현재 amplitudes의 가치를 내보냅니다. 우리는 기원 과학 그래프 및 분석 소프트웨어, 버전 7을 사용합니다. </li></ol> 8. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 쉬고 인간 T 세포의 CRAC 전류. (A), -100 MV (채워진 원)과 100 MV (오픈 원)에서 전체 셀 전압 클램프 구성에 기록된 CRAC 전류의 시간 코스. gigaseal 형성하기 전에, 세포는 칼슘 2 ~ 10 분 preincubated했습니다 + 무료 3 MM MG 2 + 함유 목욕 솔루션 0.5 μm의의 thapsigargin을 포함하는 # 1. 침입 후, 목욕 솔루션은 순차적으로 다음과 같이 적용되었습니다 칼슘 2 + 무료 3 MM MG 2 칼슘 2 + 함유 목욕 솔루션 # 2 20 MM 다음 + 함유 목욕 솔루션 # 1 (0 칼슘 + 3 MG) (20 CA), 목욕 솔루션 # 2 (20 CA) 뒤에 이가의 양이온 무료 목욕 솔루션 # 3 (DVF)로 따라갔다. 전지는 그림 1에 표시된 전압 구불 구 일련의 자극했다. 구불 구의 빈도는 목욕 솔루션 # 3 (DVF)와 다른 모든 솔루션에 0.5 Hz에서 5 Hz에서했습니다. 20 MM 칼슘 2 + 함유 목욕 솔루션 # 2 및 DVF 목욕 솔루션 # 3 I 나 - CRAC의 빠른 과도 개발 신청 후 CA - CRAC의 느린 개발을합니다. (B), 대표 현재 흔적이 + 무료 3 MM MG 2 + 함유 목욕 솔루션 # 1 (CA 2 전압 경사로 동안 기록"누설"), 20 MM 칼슘 2 + 함유 목욕 솔루션 # 2 (20 CA), 그리고 목욕 솔루션 # 3 (DVF)을. (C, D), I CA - CRAC (C)와 나 - CRAC (D)의 전류 - 전압 관계 20 MM의 전압 - 경사로 중에 칼슘 2 + 함유 목욕을 기록 전류에서 "누출"현재를 빼서 얻은 솔루션 # 2 (20 CA), 그리고 목욕 솔루션 패널에 표시된 # 3 (DVF) (B).

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
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<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이러한 세포의 내생 CRAC 현재 진폭이 작은 셀 크기 (쉬고 인간 T 세포의 직경은 5-8 μm의 범위에있는)에 의한 소형이기 때문에 인간의 T 세포를 휴식에 CRAC 전류 electrophysiological 조사 어려운 작업입니다. 여기에서 우리는 확실하게 주변 혈액 mononuclear 세포로부터 격리 쉬고있는 인간의 T lymphocytes에 CRAC 전류를 기록하기위한 단계별 절차를 제시한다. 이 기술은 우리가 더 나은 정상 및 병적인 면역 세포 반응의 본질을 이해하기 위해 쉬고 T 세포의 CRAC 채널의 생리와 기능 표현을 조사 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용, 하나는뿐만 아니라 이러한 활성 인간의 T 세포, monocytes, macrophages과 같은 다른 면역 세포에 인간 T 세포를 휴식에 CRAC 전류를 측정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail</td><td>줄기세포 기술</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep 밀도 매질</td><td>줄기세포 기술</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>글루타민/HEPES가 포함된 RPMI-1640 배지</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100X 용액)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 비타민 용액 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>1640 아미노산 용액 (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-머캅토&amp;#8211;에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>이노시톨 삼인산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 하이드로브로마이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>염화란타넘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>타프시가르긴</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>HIPEC R6101 반도체 보호 코팅</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63-500 시리즈 고성능 진동 절연 실험대</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>헤드스테이지가 포함된 EPC 10 패치 클램프 앰플리파이어</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터 </td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>40배 오일 침강 대물렌즈가 장착된 Olympus 1X71 도립 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Windows 컴퓨터</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulse 소프트웨어</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 과학적 그래프 작성 및 분석 소프트웨어</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>패치 피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>필라멘트가 포함된 붕규산 유리 (외경: 1.5mm, 내경: 1.10mm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Narashige&amp;rsquo;s Microforge</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 O-링 </td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>커버글라스 25 mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 t lymphocytes에서 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 기록 (crac) 해류

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

T lymphocytes 년, CA 2 고갈 + 세포내 칼슘 2 + 저장소, plasmalemmal 칼슘 2 활성화에 + 채널을 리드 칼슘 출시가 활성화된 칼슘 (CRAC) 채널을했다. CRAC 채널은 T 세포 증식 및 유전자 발현의 조절에 중요​​한 역할을한다. T 세포의 비정상적인 CRAC 채널 기능이 심한 결합 면역 결핍과 면역 질환 1, 2에 연결되어 있습니다. 인간 T 세포의 CRAC 채널 기능을 공부하는 것은 정상적인 면역 반응을 조절 새로운 분자 메커니즘을 발견하고 관련 인간 질병의 원인을 풀다 수 있습니다. 멤브레인 전류의 Electrophysiological 녹음 기능 채널 특성과 규제의 가장 정확한 평가를 제공합니다. Jurkat T 세포, 인간의 백혈병 T 세포 라인에 CRAC 채널 전류의 Electrophysiological 평가는 처음 3 전 20 년 이상 수행했다, 그러나 정상적인 인간의 T 세포에 CRAC 전류 측정이 어려운 과제 남아있다. 정상적인 T 세포의 CRAC 채널 전류를 기록의 어려움은 혈액 파생 T의 lymphocytes가 Jurkat T 세포보다 크기가 훨씬 작고, 따라서 내생 전체 세포 CRAC 전류가 진폭 매우 낮게있다는 사실에 의해 혼합 수 있습니다. 여기, 우리가 정기적으로 칼슘 2를 기록하는 데 사용하는 + 나 + 나 건강한 자원 봉사자의 말초 혈액에서 분리된 인간의 T 세포를 휴식에 CRAC 채널을 통해 전류. 단계별 절차를 제공 방법은 여기에 설명된 Jurkat T 세포에서 CRAC 전류를 기록하고 인간의 T 세포 4-8을 활성화에 사용되는 절차에서 채택되었습니다.

우리는 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 패치 클램프 녹음 (CRAC) 말초 혈액 mononuclear 세포 - 파생 인간 T의 lymphocytes의 전류에 대한 단계별 절차를 제공합니다.

인간의 T Lymphocytes에서 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 기록 (CRAC) 해류

T 림프구에서 세포 내 Ca2+ 저장고로부터 Ca2+가 고갈되면, 칼슘 방출 활성 ...이라 불리는 세포막 Ca2+ 채널이 활성화됩니다.

세포막에 위치한 칼슘 방출 활성 칼슘 채널(calcium release activated calcium channels) 또는 CRAC 채널은 T세포 증식과 유전자 발현에 중요한 역할을 합니다. 항원에 의한 T세포 수용체의 자극은 이차 전령인 이노시톨 삼인산(inositol triphosphate)의 형성을 유도하며, 이노시톨 삼인산 수용체를 통해 저장고로부터의 칼슘 방출을 활성화합니다. 저장고 내의 칼슘 농도 감소는 CRAC 채널의 활성화를 유도하며, 결과적으로 세포질 내 칼슘 농도를 증가시킵니다. T세포 내 CRAC 채널 기능의 이상은 중증 복합 면역결핍증 및 자가면역 질환을 포함한 여러 인간 질병과 연관되어 있습니다.본 연구에서는 인간 T 세포로부터 내인성 칼슘 및 나트륨 crack 채널 전류를 신뢰성 있고 재현 가능하게 기록할 수 있는 방법을 제시합니다. 먼저, 저장고를 고갈시키기 위해 칼슘이 없는 세포외 용액 또는 3 mM 마그네슘이 포함된 용액 내에 Sarco endoplasmic reticulum Calcium ATPase 차단제인 FSA garin을 처리합니다.이 절차는 균열 채널(crack channels)을 개방하지만, 마그네슘에 대한 균열 채널의 투과성이 낮기 때문에 균열 전류(crack current)를 유도하지는 않습니다. 그 후 T-세포 막에 전체 세포 전압 고정(whole cell voltage clamp)을 설정합니다. 세포에는 고농도의 칼슘 킬레이터 pta가 포함된 피펫 용액을 관류시킵니다.그 다음, crack 채널을 통해 측정 가능한 칼슘 및 나트륨 전류를 활성화하기 위해 칼슘 함유 세포외 용액 또는 2가 양이온 제거 세포외 용액을 순차적으로 처리합니다. 결과 데이터는 휴지기 인간 T 세포에서 crack 채널의 기능적 발현 수준을 보여줍니다. crack 채널을 통한 막 전류 조사는 crack 채널의 조절 및 기능에 대한 귀중한 정보를 제공하며, 정상적인 면역 반응 및 면역 질환에서 crack 채널의 역할을 규명하는 데 기여할 수 있습니다.일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 인간 T 림프구의 크기가 작고, 이 세포들의 내인성 crack 전류의 진폭이 낮기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 실험에 사용된 CD3 양성 인간 T 림프구는 건강한 자원봉사자의 말초혈액 샘플로부터 얻었으며, TEP human T-cell enrichment cocktail과 TEP density medium을 사용하여 분리하였습니다. 동봉된 서면 프로토콜의 지침에 따라, 세포는 이산화탄소 배양기 내 37 °C의 T-cell 배양 배지에서 유지되었습니다.다음 용액들을 준비하십시오. 용액 1은 3 mM magnesium과 calcium이 포함되지 않은 상태여야 하며, 용액 2는 20 mM calcium을 포함해야 합니다. 용액 3은 10 mM calcium 킬레이트제인 H-E-D-T-A를 포함하고 이가 이온은 포함되지 않아야 하며, 피펫 용액은 12 mM calcium 킬레이트제 bta를 포함해야 합니다. 해당 용액들을 4 °C에서 최대 일주일 동안 보관하십시오. 실험 당일에 유리 모세관과 피펫 풀러(pipette puller)를 사용하여 팁 직경이 약 2 µm인 피펫을 제작하십시오.여기 제시되고 동반 텍스트에 기재된 사양의 필라멘트가 포함된 실리카 튜브를 사용하십시오. 튜브를 가열 인발한 후, 피펫 팁을 PEC R 61 0 1 반도체 보호 코팅제로 코팅하고 화염 연마합니다. 이를 피펫 홀더와 같이 먼지가 유입되지 않는 곳에 보관하십시오.여기에서 패치 클램프 증폭기를 제어하는 소프트웨어를 엽니다. E PC 10 패치 클램프 증폭기는 pulse 소프트웨어로 제어됩니다. 기가 실(giga seal) 형성 및 전체 세포 구성 설정에 사용되는 cell 및 whole cell 매크로의 설정을 구성하고 저장하십시오.다음으로 획득 소프트웨어에서 균열 전류를 기록하기 위한 자극 프로토콜을 구성하고 저장합니다. 펄스 생성 창의 획득 프로토콜은 -120에서 +100 mV까지 50 milliseconds 동안 전압 램프(voltage ramp)가 가해지도록 설정합니다.램프 전압 자극 주파수가 0.5 hertz와 five hertz인 두 가지 자극 프로토콜을 생성하고, 이를 펄스 생성 창에 각각 ramp one과 ramp two라는 이름으로 저장합니다. 기록을 위해 세포를 준비하려면, 0.2 to 0.5 million 개의 세포가 포함된 세포 현탁액 500 microliters를 실리콘 O-ring이 부착된 polyol lysine 코팅 커버슬립으로 구성된 기록 챔버에 플레이팅합니다. 37 degrees Celsius에서 20분 동안 배양합니다.배양 후, 레코딩 챔버를 챔버 홀더에 고정합니다. 여기서는 베이스 부분이 챔버 바닥의 커버 슬립을 지지하고 상단 부분이 커버 슬립의 윗면을 누르는 맞춤 제작된 챔버 홀더를 사용합니다. 40 x 오일 침수 렌즈와 명시야 조명을 사용하는 도립 현미경의 스테이지 위에 챔버 홀더를 배치합니다.세포가 있는 영역을 찾아 초점을 맞춥니다. 은-염화은 참조 전극을 배스(bath)에 넣습니다. 그런 다음 유입 튜브의 끝부분을 커버슬립에 45도 각도로 시야 근처에 배치하여 다중 배럴 중력 구동 관류 시스템을 정렬하고, 흡입 튜브를 챔버 홀더의 상단부에 삽입합니다.흡입 튜브가 유입 튜브의 반대편에 위치하여 채널이 올바르게 형성될 때까지 챔버 홀더의 상단부를 회전시킵니다. 전류 기록은 관류 시스템의 밸브를 열어 기록 챔버에 3mM 마그네슘을 함유하고 칼슘이 제거된 bat 용액 1번(0.5~1 µM AP argon 보충)을 8~10분 동안 관류하여 시냅스 펌프를 차단함으로써 시작합니다.이 단계에서는 칼슘 저장량을 고갈시킵니다. 다음으로, P 20 공기 치환 피펫과 함께 einor 마이크로 로더를 사용하십시오. 피펫에 피펫 용액을 채우려면, 여기 앰플리파이어 헤드 스테이지의 홀더에 피펫을 삽입하십시오.맞춤 제작된 압력 흡입 장치를 가압 공기 및 진공 라인에 연결합니다. 패치 피펫 내부에 양압 또는 음압을 형성하려면, 연결 튜브를 통해 피펫을 압력 흡입 장치의 배출구에 연결하여 피펫 내부에 약 3 inches of water의 소량의 양압을 가합니다. 컴퓨터 화면의 EPC 10 패치 클램프 창에서 설정 제어 키를 클릭하십시오.설정 매크로를 실행하십시오. 커버슬립에 단단히 부착되어 있고 외면이 매끄러우며 평균적인 크기를 가진 원형 세포를 찾습니다. 그런 다음 오실로스코프 창의 현미경을 통해 시각적으로 확인하며 패치 전극을 배스(bath) 내부로 내립니다.피펫을 목욕 용액에 담근 후 피펫을 통해 흐르는 전류를 확인할 수 있습니다. 설정 매크로에 의해 피펫에 인가된 5 mV 전압 테스트 펄스에 의해 전류 진폭에서 계단 모양의 변화가 유도됩니다. 펄스 소프트웨어는 피펫 저항을 자동으로 계산하여 막 저항 창에 표시합니다.컴퓨터 화면상에서 피펫 저항은 보통 5~6 MΩ입니다. 컴퓨터 화면의 앰프 창에 있는 자동 제어(auto control) 키를 클릭하여 피펫과 기준 전극 사이에 생성된 오프셋 전위를 보정하십시오. 그러면 기선 전류가 0 A 수준으로 이동합니다.마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫 팁이 세포막에 닿도록 이동시킵니다. 접촉이 이루어지면 테스트 펄스에 의해 유도된 전류의 진폭이 감소합니다. 패치 피펫에 20에서 40 inches of water의 음압을 가합니다.오실로스코프 창에서 기가실(giga seal) 형성 과정을 모니터링하십시오. 피펫 저항값이 5 GΩ 이상으로 증가함에 따라 테스트 펄스에 의해 유도된 전류의 진폭이 점진적으로 감소해야 합니다. 일반적으로 기가실 접촉은 빠르게 형성되지만, 안정적인 기가실을 형성하는 데 1~2분 정도 소요될 수 있습니다.기가실(giga seal)이 형성되면, 연결 튜브를 배출구에서 제거하여 피펫 홀더를 압력 흡입 장치로부터 분리합니다. 컴퓨터 화면의 onsell 제어 키를 클릭하여 실험 전에 설정한 onsell 매크로를 실행합니다. EPC 10 매뉴얼에 따라, cfat 창의 auto control 키를 클릭하여 피펫 커패시턴스(capacitance)를 보정합니다.오실로스코프 창에서 전류 과도 현상이 사라지면, cfat 창에 피펫 커패시턴스 값이 나타납니다. 피펫 내부의 세포막을 파쇄하기 위해, 연결 튜브를 통해 피펫을 20 cubic centimeter 주사기에 연결하고 플런저를 뒤로 당겨 피펫에 추가적인 음압을 가하십시오. 피펫 내부의 세포막이 파열되면, 세포막을 새로운 전압 수준으로 충전하는 두 번의 전류 과도 현상이 나타납니다. 컴퓨터 화면에서 whole cell 제어 키를 클릭하여 미리 설정된 whole cell 매크로를 실행하십시오.그 다음, V membrane 창에 유지 전위(holding potential) 유형을 +30 mV로 설정합니다. 양의 유지 전위는 칼슘 의존성 크랙 채널(calcium dependent crack channel)의 활성화를 방지하는 데 도움이 됩니다. 이어서 C slow 창의 auto control 키를 클릭합니다. 오실로스코프 창에서 세포 커패시턴스(cell capacitance)가 보상되면, 전류 과도 현상(current transient)이 사라집니다.세포 커패시턴스와 직렬 저항 값은 각각 C slow 및 R series 창에 표시됩니다. 직렬 저항은 일반적으로 7에서 20 mega 범위 내에 있습니다. 세포 커패시턴스 값에 해당하는 C slow 값은 일반적으로 1.5에서 2.5 pico fer 범위입니다.휴지기 인간 T 세포에서, 오실로스코프 창의 램프 원 컨트롤 키(ramp one control key)를 클릭하여 0.5 hertz 주파수의 일련의 전압 램프를 적용합니다. 이렇게 하면 실험 전 오실로스코프 창에서 생성하고 저장한 자극 프로토콜이 실행됩니다. 전압 램프에 의해 유발된 전류가 표시됩니다. 기록하십시오.이것은 3mM 마그네슘이 포함된 칼슘 제거 용액 1에서의 전류 기록입니다. 이 용액에서는 마그네슘에 대한 crack 채널의 투과성이 낮기 때문에 crack 전류가 매우 작게 나타납니다. 향후 분석에서 이 기록들을 누설 전류(leak currents)로 사용하십시오.-100 mV에서의 누설 전류의 절대 진폭은 5 pA 이하이어야 합니다. 세포에 누설이 있는 경우, 실험을 중단하고 새로운 패치 피펫과 새로운 세포로 다시 시작하십시오.다음으로 CRAC 채널을 통한 칼슘 전류를 기록하기 위해, 관류 밸브를 전환하여 bath solution 1을 20 mM 칼슘이 포함된 bath solution 2로 교체합니다. 이를 통해 칼슘 이온이 CRAC 채널을 통해 흐르게 되며 오실로스코프 창에 내향 전류가 생성됩니다. CRAC 채널을 통한 내향 정류 칼슘 전류는 음전압에서 전류 진폭이 형성되며, 칼슘 의존적 CRAC 전류 강화로 인해 약 1분 동안 계속해서 증가합니다.오실로스코프 창에서 ramp two 제어 키를 클릭하여 사전 설정된 자극 프로토콜을 실행합니다. 이는 전압 램프를 통해 자극 빈도를 5 Hz로 변경하며, 자극 빈도의 증가는 일시적인 특성을 가진 CRAC 채널을 통한 최대 나트륨 전류를 기록하는 데 도움이 됩니다. 다음으로, 오실로스코프 창에서 퍼퓨전 밸브를 다시 전환하여 배스 용액 2번을 나트륨을 포함하고 2가 양이온이 없는 용액 3번으로 교체합니다. 그러면 CRAC 채널을 통해 더 큰 진폭의 일시적인 내향 정류 나트륨 전류가 발생합니다.실험이 종료되면 파일을 닫으십시오. 그러면 이후 데이터 분석을 위해 기록된 전류 트레이스가 저장됩니다. 저장된 전류 기록을 분석 소프트웨어로 불러옵니다. 여기서는 pulse 프로그램의 오실로스코프 창에 있는 커서 쌍을 사용하여 분석을 위해 pulse 소프트웨어를 사용합니다. 여기서 전압 램프의 시작점과 끝점에서의 전류 진폭을 측정하십시오.전류 진폭은 -100 mV와 +100 mV에서 측정합니다. 전류 진폭 값을 Origin scientific graphing and analysis software와 같은 그래픽 프로그램으로 내보냅니다. 추가 분석 및 그래프 제시를 위해, 본 실험에서 설명한 방법을 사용하여 건강한 피험자의 CD3+ 휴지기 T 세포에서 crack current를 측정하였으며, 이 그림은 whole-cell voltage clamp 구성에서 -100 mV(채워진 원으로 표시)와 +100 mV(빈 원으로 표시)에서 기록된 crack current의 시간 경과를 보여줍니다.기가씰(giga seal) 형성 전, 세포를 calcium-free, 3 mM magnesium이 포함된 bath solution 1(0.5 µM orthogon 포함)에서 약 10분 동안 사전 배양하였습니다. break-in 이후 bath solution을 다음과 같은 순서로 차례로 적용하였습니다: calcium-free 3 mM magnesium 포함 bath solution 1, 이어서 20 mM calcium 포함 bath solution 2, 이어서 divalent cation-free bath solution 3, 그리고 다시 20 mM calcium 포함 bath solution 2를 적용하였습니다. 세포는 여기에 표시된 바와 같이 -120 mV에서 +100 mV까지의 일련의 전압 램프(voltage ramps)로 자극되었습니다.전압 램프는 2가 양이온이 없는 bat solution number three에서는 200 밀리초마다 또는 5 Hz의 빈도로 적용하였으며, 그 외 모든 용액에서는 2초마다 또는 0.5 Hz의 빈도로 적용하였습니다. 20 mM 칼슘이 포함된 bat solution number two를 처리한 후 CRAC 채널을 통해 칼슘 전류가 느리게 발달하는 점과, 2가 양이온이 없는 bat solution number three에서 CRAC 채널을 통해 나트륨 전류가 빠르게 일시적으로 발달하는 점에 유의하십시오. 이 그림은 칼슘이 없는 상태에서 전압 램프 동안 기록된 대표적인 전류 트레이스를 보여줍니다.3 mM 마그네슘 함유 욕액 1번, 20 mM 칼슘 함유 욕액 2번, 그리고 2가 양이온 무첨가 욕액 3번을 준비합니다. 개별 전압 램프 동안의 칼슘 및 나트륨 전류 트레이스는 20 mM 칼슘 함유 욕액 2번과 2가 양이온 무첨가 욕액 3번에서 기록된 전류에서 3 mM 마그네슘 함유 칼슘 무첨가 욕액 1번에서 기록된 전류를 빼서 얻을 수 있습니다. 여기서 ClC 채널을 통한 칼슘 및 나트륨 전류의 전형적인 전류-전압 관계를 보여주는 결과 전류 트레이스를 확인할 수 있습니다.이 기술을 숙달하고 모든 절차 단계를 적절히 수행하면, 하루에 5~10개의 세포에서 crack channel 전류를 기록할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간 T 세포의 휴지기 상태에서 correctional current를 기록하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 따르면 활성화된 인간 T cells, monocytes, macrophages 및 세포주와 같은 면역계의 다른 세포에서도 correct currents를 기록할 수 있습니다. 전기생리학적.면역계 세포의 crack channel 전류 기록을 통해 연구자들은 면역 세포 내 칼슘 항상성에서 이들의 역할을 규명할 수 있을 것입니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

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