Name: Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 배우세요 Percoll 그라디언트를 이용한 마우스 뇌와 척수 단핵세포 분리 방법을 통해 중추신경계 면역세포 표현형 분석을 수행하는 기술입니다. 이 프로토콜은 흐름세포분석을 위한 신속하고 효율적인 세포 분리를 가능하게 합니다.

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이 작품은 국립 다중 경화증 협회 (TA AEC에 3021 - A1 / T)와 산 안토니오 텍사스 대학에 의해 지원되었다.

시약의 준비 칼슘없이 10X HBSS의 한 부분과 percoll 9 부분을 혼합하여 주식 isotonic percoll (SIP), 뇌 당 4 ML을 준비 + +와 MG + +. 없이 1X HBSS 70 %로 SIP를 준비 칼슘 + +와 MG + +, 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 관에 적절 뇌의 당 2 ML. 참고 :이 percoll은 실온에서 사용해야하는 것이 좋습니다, 감기를 사용한 경우, 세포 클럼프하는 경향과 세포 분리 덜 효율적이다. 조직 수집 및 균질화 얼음처럼 차가운 1X HBSS과 좌심실을 통해 마우스 및 perfuse를 마취. 뇌 및 척수를 해부하다 모든 생쥐가 희생되기 전까지는 페놀 레드없는 RPMI으로 유지합니다. 7 15 ML 다운스 호모 지 나이저는 RPMI 3 ML을 포함에서 개최 조직은 부드럽게 추가로 조직을 떼어 놓다하는 타이 맞는 유봉 (B 크기) 다음 느슨한 맞는 유봉 (크기)와 세포 현탁액합니다. RPMI 7 개의 ML에 셀 suspensions의 볼륨을 작성합니다. 그라데이션이 설정 최종 30 % SIP를 만들기 위해 세포 현탁액에 SIP 3 ML 추가 천천히 계층 70 % SIP 위에 10 ML 세포 현탁액. 이 절차의 가장 중요한 단계이며, 70 % 혼합하여 30 % 솔루션을 피하고 중력 모드에서 설정 피펫 에이드를 사용합니다. 명확 평평한 라인은 70 % -30 %의 교차점에 표시되어야합니다. 500G 18 ° C.에서 30 분 원심 분리기 원심 분리기는 계면이 방해되지 않도록 최소한의 또는 전혀 브레이크와 함께 중지됩니다 있는지 확인하십시오. 전송 pipet을 사용하면 부드럽게 튜브의 상단에서 파편의 레이어를 제거하고 1X HBSS 8 ML을 포함한 깨끗한 원뿔 관에 70 % -30 %의 계면의 2.0-3.0 ML를 수집합니다. 계면을 포함하고있는 percoll 세 배에 대한 희석되었는지 확인, 18 500G에서 역전과 centrifugre 7 분으로 몇 번 혼합 ° C. Resuspend 세포 얼룩 버퍼 1 ML의 펠렛 및 1.5 ML 튜브로 전송하고 4 만 G 1 분 ° C.에서 마이크로 원심 분리기를 사용하여 한 번 더 씻어 항체 염색법 antimouse CD16/CD32 투석을 50 μl의 Resuspend 알약은 FC 바인딩 사이트를 차단하는 세포 얼룩 버퍼에 1:200 희석. 10 분 얼음 위에 알을 품다. hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 30 분 얼음 항체 칵테일 믹스와 부화 50 μl를 추가합니다. 각 항체 먼저 최적의 희석을 평가하기 위해 titrated해야합니다. 레이저와 특정 흐름 cytometer의 필터 설정의 기능에 따라 선택한 해당 fluorochrome 조합을 사용합니다. 세포 얼룩 버퍼의 100-200 μl의 세포 얼룩 버퍼, resuspend 알약의 세포를 세척하고 cytometer에 즉시 분석하거나, 또는 세포는 4 PBS의 준비 2 % paraformaldehyde (PFA)에 resuspended 이상 박 저장할 수 있습니다 ° C . 대표 결과 : 그라디언트를 회전 후, 70 % -30 %의 계면은 정의된 흰색 후광이 있어야하고, 순진한 마우스에서 발견한 세포의 quantitation 마우스 당 3-5 X10 5 세포 (뇌 척수 플러스) 양보해야합니다. 염증 두뇌 CNS의 모욕 또는 질병 모델 (그림 1)에 따라 염증 세포의 숫자까지 할 수도 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2348/2348fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 피크 질병에 순진하고 EAE - 머리에서 mononuclear 세포의 분리. 뇌 세포의 suspensions는 불연속 70% / 30 % percoll의 그라디언트를 통해 분리되었다. 세포 얼룩이 얼음에 30 분 안티 CD45 항체 뒤에 FC - 블록 incubated되었습니다. 세포는 세포 얼룩 버퍼에 씻어서하고, LSR - II에 2% PFA 전에 인수에서 수정되었습니다. CD45 강도는 세 개의 서로 다른 인구가 시각의 Y - 축 단위로 측정됩니다. CD45 안녕 침투 세포의 면역 표현형의 추가 특성이 추가 항체를 사용하여 구현하고 이후 유동세포계측법 의해 분석됩니다.

<ol><li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

정상 및 염증 마우스 조직에서 CNS의 leukocytes의 세포 표면 마커의 분석은 1-3 몇 수십 년 동안 이용되었다. 격리 프로토콜은 밀도 원심 분리에 의해 4 microglia 및 leukocytes의 분리에 근거하고 있습니다. 여기 불연속 percoll의 그라디언트를 사용하여 CNS의 leukocytes를 격리의 신속하고 효과적인 방법을 설명합니다. 세포의 분리 후, 각종 항체와 얼룩으로 - 이에 - CD45 이에 국한되지 않음, CD4, CD8, CD11b, CD19, 등 특정 병리의 유도에 따라 CNS에 침투해 면역 인구의 식별을 허용합니다. 안티 CD45 항체와 얼룩 것은 유동세포계측법하여 세 개의 서로 다른 인구를 보여, (1)의 연결을 세포, astrocytes와 다른 신경 세포 사이에 oligodendrocytes, 구성 CD45 부정적인 인구 (2) 대부분 surveillant microglial 세포 (3)를 포함 CD45 싸다, 또는 중간 CD...

조직 균질화 및 그라디언트 <ul><li> Percoll (아머샴) </li><li> 칼슘과 마그네슘없이 10X 행크스 &#39;밸런스드 소금 솔루션 (Gibco) </li><li> 페놀 레드 않고 중간 RPMI 1640 (Gibco) </li><li> 7 - ML 15 - ML 다운스 조직 그라 인더스 (VWR) </li></ul> 유동세포계측법 <ul><li> 세포 스테 이닝 버퍼 (Biolegend) </li><li> 정화 랫 방지 마우스 CD16/CD32 (마우스 BD FC 블록), BD Pharmingen </li><li> Hemacytometer (피셔) </li><li> 안티 마우스 CD45 (복제 30 - F11), CD4 (클론 RM4 - 5), CD19 (클론 6D5), BioLegend </li><li> 10X 인산은 칼슘과 마그네슘없이 살린 버퍼 (써모 과학) </li><li> Paraformaldehyde (시그마 알드리치) </li><li> 유동세포계측법 분석 LSR II (BD Biosciences)와 수행 </li></ul>

percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 mononuclear 세포의 분리

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

감염, 외상, autoimmunity 또는 neurodegeneration 동안 중추 신경계 (CNS)를 침투 면역 세포의 분리는 종종 자신의 표현형 및 이펙터 기능을 정의해야합니다. Histochemical 접근 침투 세포의 위치를​​ 파악하고 병리 관련 CNS를 분석하는 수단입니다. 그러나, 원위치 histochemistry과 immunofluorescent 얼룩 기술은 특정 조직에 면역 세포 subtypes을 특성화하기 위해 한 번에 사용할 수있는 항체의 숫자에 의해 제한됩니다. 따라서, 유동세포계측법에 의해 면역 - phenotyping와 함께 histological 접근 방법이 완전히 지역 CNS의 침투의 조성을 특성화하기 위해 중요하다. 이 프로토콜은 discontinous percoll 그라디언트를 통해 CNS 세포 suspensions의 분리에 따라 달라집니다. 현재 문서는 효율적으로 효과적으로 유동세포계측법하여 하나의 샘플에서 다양한 면역 세포 집단의 식별을 위해 활용할 수있는 두뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.

현재 문서는 효율적으로 효과적으로 흐름 cytometric 분석을 위해 활용할 수 뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

감염, 외상, 자가면역 질환 또는 신경퇴행 과정 중 중추신경계(CNS)로 침윤하는 면역 세포의 분리는 종종 요구되며...

감염, 외상, 자가면역 질환 또는 신경퇴행성 질환 발생 시 면역 세포가 중추신경계로 침윤합니다. 조직화학적 접근법을 통해 침윤된 세포의 위치를 결정하고 관련 병리를 분석할 수 있지만, 이러한 기술은 동시에 사용할 수 있는 항체의 수에 제한이 있습니다. 본 영상에서는 절제된 조직을 먼저 균질화하여 뇌 및 척수 조직으로부터 단핵 세포를 빠르게 분리하는 방법을 소개합니다.다음으로, 페리콜(percoll) 밀도 구배를 형성하고 원심분리를 통해 인터페이스에서 단핵 세포를 수집합니다. 마지막으로, 세포를 세척하고 항체로 염색합니다. 유세포 분석을 통해 혈행성 세포와 감시 미세아교세포를 구분하며, 질병 상태에서의 상대적 비율을 결정할 수 있습니다. 기존의 피크링(Ficoll) 구배 방식이나 조직 화학 염색과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 소요 시간이 더 짧다는 점입니다.이를 통해 더 많은 조직을 동시에 처리할 수 있습니다. 그래디언트 설정을 시연할 연구실 테크니션이 이 프로토콜에 필요한 시약을 준비합니다. 뇌 하나당 4 mL의 SIP로 지칭되는 등장성 페로스톡(stock isotonic perol)부터 시작합니다.이를 위해 perol 9분량과 칼슘 및 마그네슘이 제거된 10배 농축 HBSS 1분량을 혼합한 후 도립 혼합합니다. 다음으로, 준비된 SIP를 칼슘 및 마그네슘이 제거된 1배 농축 HBSS와 혼합하여 70% per call을 준비합니다. 그런 다음 조직을 수집하기 위해 70% per cole 2mL를 15mL 폴리프로필렌 원심 분리 튜브에 분주합니다.본 절차에서는, 모든 실험 쥐의 적출된 뇌와 척수를 10 milliliters의 RPMI가 들어있는 비커에 넣고 얼음 위에 둡니다. 다음으로, 조직을 3 milliliters의 1배수 HBSS가 들어있는 7 또는 15 milliliter 다운 호모게나이저(down homogenizer)로 옮깁니다. 이때 헐거운 크기의 B 페스틀(pestle)을 사용하여 부드럽게 세포 현탁액을 만든 후, 딱 맞는 크기의 B 페스틀로 교체하여 조직을 추가로 해리합니다.조직을 균질화한 후, RPMI 또는 1배 HBSS를 넣어 최종 부피를 7mL로 맞추고 Percoll 구배를 설정하는 단계로 진행합니다. 먼저 세포 현탁액에 3mL의 SIP를 추가하여 최종 PERCOCO 농도를 30%로 맞춥니다. 이때 Percoll은 상온에서 사용해야 함을 유의하십시오. 차갑게 사용할 경우 세포가 뭉치는 경향이 있어 세포 분리 효율이 떨어집니다.다음으로, 피펫 에이드의 중력 모드(gravity mode)를 사용하여 10 milliliter의 세포 현탁액을 70% SIP 위에 천천히 층을 이루며 얹습니다. 70% 용액과 30% 용액이 섞이지 않도록 주의하십시오. 이는 전체 과정에서 가장 중요한 단계입니다.70%와 30% 접합부에 매우 선명하고 평평한 경계선이 보여야 합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 층을 쌓는 동안 상층과 70% 용액이 섞여 어려움을 겪을 수 있습니다. 다음 단계로, 계면을 안정시키기 위해 18°C에서 500 Gs로 30분 동안 원심분리합니다.인터페이스가 흐트러지지 않도록 원심분리기가 최소한의 제동 또는 제동 없이 정지하도록 설정하십시오. 기울기 원심분리를 마치면 튜브 상단에 두껍고 점성이 있는 파편 층이 축적됩니다. 그 다음 층은 황색의 30% Percoll 층이며, 때때로 파편이 포함되어 있을 수 있습니다.다음은 70%와 30% 층의 경계면으로, 뚜렷한 흰색 띠(halo)가 나타나며 단핵구가 포함되어 있습니다. 마지막으로 튜브 바닥에는 투명한 70% Percoll 층이 위치합니다. 만약 경계면이 관찰되지 않는다면, 세포 회수율이 매우 낮을 가능성이 커 이후 분석이 매우 어려워질 것입니다.따라서 이 시점에서 오염을 줄이기 위해 신선한 세포 현탁액이 필요할 수 있습니다. 튜브 상단의 부유물 층을 조심스럽게 제거하여 버립니다. 그다음 플라스틱 피펫을 사용하여 상단 30% 층을 지나 70-30 중간층에서 2~3 mL를 채취하여 1배수 HBSS 8 mL가 들어 있는 깨끗한 원추형 튜브로 옮깁니다.희석된 인터페이스를 도립 혼합하여 몇 번 섞은 후, 18 °C에서 500 g로 7분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 펠렛을 재현탁합니다. 1 mL의 세포 염색 버퍼가 담긴 1.5 mL 튜브에 세포 현탁액을 옮기고 한 번 더 세척합니다.항체 염색을 진행하기 전, 4 °C에서 10,000 g로 1분 동안 마이크로 원심분리기를 사용합니다. FC 결합 부위를 차단하기 위해, 펠릿을 세포 염색 버퍼에 1:200으로 희석한 50 µL의 정제된 anti-US CD 16, CD 32에 재현탁합니다. 모든 염색 절차와 마찬가지로, 모든 항체는 적절히 타이트레이션 되어야 하며, 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 배양하는 동안, 2~5 µL의 세포를 취하여 헤모사이토미터로 세포 수를 측정합니다.정상 뇌와 척수 조직을 합치면 마우스 한 마리당 약 3~5×10⁵개의 세포를 얻을 수 있습니다. 염증이 있는 뇌의 경우, 수집 시점과 질환 모델에 따라 염증 세포의 수가 다양하게 나타납니다. CD 16 및 CD 32를 이용한 배양 후, 면역 세포 특이적 항체 칵테일 믹스 50 µL를 첨가합니다. 본 예시에서 사용된 믹스는 CD 45, CD 4 및 CD 19에 대한 항체를 포함하며, 이를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.중요한 점은, 각 항체를 먼저 적정해야 한다는 것입니다. 최적의 희석 배수를 평가하려면, 사용 중인 유세포 분석기의 레이저 및 필터 설정 기능에 맞춰 선택한 적절한 형광색소 조합을 사용하십시오. 세포를 염색한 후, 세포 염색 버퍼 1 mL를 첨가하고 1분 동안 원심 분리하여 세포 염색 버퍼로 세척합니다.원심분리 후 10,000 Gs에서 상층액을 제거한 다음, 펠릿을 100 내지 200 µL의 세포 염색 버퍼에 재부유시켜 즉시 유세포 분석을 수행하거나 나중에 분석합니다. 또는 세포를 PBS로 제조한 2% paraformaldehyde에 재부유시켜 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 여기에서는 FC block과 함께 배양한 후 anti CD 45, CD 4 및 CD 19 항체를 처리하여 얻은 단핵구들이 나타나 있습니다.유세포 분석을 통한 CD 45 염색 프로토콜에 따라, CD 45 high 혈행성 세포와 CD 45 DIM 감시 미세아교세포가 잘 분리됩니다. 이 그림은 정상 뇌와 실험적 자가면역성 뇌척수염이 유도된 생쥐의 염증성 뇌에서 분리된 세포들을 비교한 것입니다. Y축에는 CD 45 APC 강도가 표시되어 있으며, 정상 뇌에서는 세 가지 뚜렷한 세포군이 시각화됩니다.CD 45 high 세포는 매우 적은 수만 검출됩니다. 일반적으로 분리된 전체 세포군의 2% 미만입니다. 이와 대조적으로, EAE가 유발된 마우스의 뇌에서는 뇌로 유입된 혈액 세포의 대규모 침윤이 관찰됩니다.CD 11 b, CD 4, CD 8 등의 다른 세포 표면 마커를 추가하면 CD 45 high 집단을 더욱 세부적으로 특성화할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3~4시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 진행할 때, CNS 염증성 침윤물의 구성을 완전히 특성화하기 위해서는 유세포 분석을 통한 면역 표현형 분석과 조직학적 접근법을 병행하는 것이 매우 중요하다는 점을 기억해야 합니다.

isolation-brain-spinal-cord-mononuclear-cells-using-percoll

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 실험자가 면역 질환 encephalomyelitis와 쥐의 중추 신경계에서 mononuclear 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

EAE와 쥐의 중추 신경계에서 Mononuclear 세포의 분리

여기서 우리는 분리 방법 및 출생 후의 마우스 문화 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포와 소뇌 과립 신경을 제시.

포스트 - 나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포 뉴런의 분리 및 문화

murine 두뇌에서 침투 leukocytes을 얻는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 연속 Percoll 기울기와 백혈구 - 농축 레이어를 선택하고 정화 불연속 Ficoll 기울기를 사용합니다. 절연 leukocytes 그때 흐름 cytometric 측정에 의해 특징 수 있습니다.

브레인 - 침투 Leukocytes의 분리

이 비디오에서는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 마우스의 뇌에서 단핵 세포를 분리하는 작업을 수행합니다. 분리된 단핵 세포 현탁액은 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 단핵 세포 분리: 뇌 상주 단핵 세포를 분리하기 위한 밀도 구배 원심분리 기술

이 비디오에서는 체외 연구를 위해 신생아 마우스에서 척수 뉴런을 분리하는 단계별 프로토콜에 대해 설명합니다.

Spinal Cord Neuron Isolation: In Vitro Studies를 위해 신생아 척수 뉴런을 분리하기 위한 밀도 구배 절차

이 비디오는 기계적 해리와 효소 분해를 사용하여 쥐의 뇌에서 종양에 침투하는 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 다음에는 추가 분석을 위해 면역 세포를 수집하기 위해 밀도 구배 원심분리가 수행됩니다.

쥐의 뇌에서 종양 침투 면역 세포 분리

이 비디오는 쥐의 뇌 조직에서 면역 세포의 단세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여줍니다. 여기에는 뇌 조직에서 세포를 분리하기 위한 효소 소화와 밀도 구배 원심분리를 포함하여 밀도에 따라 면역 세포를 분리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

쥐 뇌 조직에서 면역 세포의 단세포 현탁액 준비

이 비디오는 성체 쥐의 척수 조직에서 1차 혼합 신경교세포를 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다. 이 프로토콜은 조직의 효소 분해를 포함하며, 그 후 단세포 집단을 얻기 위해 부서진 세포막과 미엘린 파편을 제거하는 것입니다. 그런 다음 세포는 혼합 신경교세포 성장에 최적화된 배지에서 배양됩니다.

Establishing Primary Mixed Glial Cell Cultures from a Mouse Spinal Cord

기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

배우세요 Percoll 그라디언트를 이용한 마우스 뇌와 척수 단핵세포 분리 방법을 통해 중추신경계 면역세포 표현형 분석을 수행하는 기술입니다. 이 프로토콜은 흐름세포분석을 위한 신속하고 효율적인 세포 분리를 가능하게 합니다.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

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