Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

면역 세포는 감염, 외상, 자가면역 또는 신경 퇴행 중에 중추 신경계에 침투합니다. 조직화학적 접근법을 사용하여 침투 세포의 위치를 확인하고 관련 병리학을 분석할 수 있지만, 이러한 기술은 동시에 사용할 수 있는 항체의 수에 의해 제한됩니다. 여기에서는 뇌와 척수 조직에서 단핵 세포를 신속하게 분리하는 방법을 보여 주며, 여기서 절개된 조직을 먼저 균질화합니다.

다음으로, perol gradient를 설정하고 원심분리 후 계면에서 단핵 세포를 수집합니다. 마지막으로, 세포를 헹구고 항체로 염색합니다.유세포 분석을 통해 적성 세포와 감시 미세아교세포를 구별하고 질병 상태 동안 상대적 비율을 결정할 수 있습니다. Aris gradient 또는 이러한 조직화학과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 시간이 덜 소요된다는 것입니다.

이를 통해 동시에 더 많은 조직을 처리할 수 있습니다. 그래디언트 설정을 시연하는 것은 palino입니다: 제 연구실의 기술자가 이 프로토콜에 필요한 시약을 준비합니다. 뇌 당 SIP라고 하는 4밀리리터의 스톡 등장성 페롤로 시작합니다.

이렇게 하려면 페롤 9부와 칼슘과 마그네슘이 반전으로 혼합되지 않은 HBSS의 10배 1부와 함께 결합하십시오. 다음으로, 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS와 1회 혼합하여 준비된 SIP를 혼합하면서 통화당 70%를 준비합니다. 그런 다음 조직을 수집하기 위해 15 밀리리터의 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 70 % per cole의 2 밀리리터를 분배합니다.

이 절차를 위해 모든 연구 마우스의 절개된 뇌와 척수를 10ml의 RPMI가 들어 있는 비커에 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 조직을 헐렁한 크기의 HBSS의 1배인 3밀리리터를 포함하는 7 또는 15밀리리터 다운 균질기로 옮깁니다. 유봉은 부드럽게 세포 현탁액을 만든 다음 꼭 맞는 B 크기의 유봉으로 전환하고 조직을 더 해리합니다.

조직이 균질화되면 RPMI 또는 HBSS를 1회 7ml의 최종 부피에 추가하고 퍼코코 구배를 설정하기 위한 구배 설정을 진행합니다. 먼저 세포 현탁액에 3ml의 SIP를 추가하여 최종 PERCOCO 농도가 30%가 되도록 합니다. 페롤은 실온에서 사용해야 한다는 점을 명심하십시오. 차갑게 사용하면 세포가 뭉치는 경향이 있고 세포 분리의 효율성이 떨어집니다.

다음으로, 피펫 보조 설정 중력 모드를 사용하여 70% SIP 위에 10ml 셀 현탁액을 천천히 겹쳐 놓습니다. 70%와 30% 용액을 혼합하지 마십시오. 이 절차는 절차에서 가장 중요한 단계입니다.

70-30% 접합부에서 매우 명확한 편평한 선이 보여야 합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 레이어링 중에 세 번째 용액과 70% 용액이 혼합되기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 다음 단계로, 인터페이스 손상 원심분리기 섭씨 18도에서 500G의 30분.

인터페이스가 방해받지 않도록 원심분리기가 최소한의 휴식 또는 중단 없이 중지되는지 확인하십시오. 그래디언트를 회전시킨 후에는 두껍고 점성이 있는 파편층이 튜브 상단에 쌓여야 합니다. 다음 층은 노랗게 하는 30%per 코어 층으로, 때때로 파편을 포함합니다.

다음은 70-30 인터페이스로, 정의된 흰색 후광을 가져야 하고 단핵 셀을 포함해야 합니다. 마지막으로, 튜브의 바닥에는 투명한 70% 페롤 층이 있습니다. 계면이 관찰되지 않으면 세포의 수율이 매우 낮아 추가 분석이 매우 어려울 수 있습니다.

따라서 이 시점에서 오염을 줄이기 위해 신선한 세포 현탁액이 필요할 수 있습니다. 튜브 상단에서 파편층을 조심스럽게 제거하고 버리십시오. 그런 다음 플라스틱 피펫을 사용하여 코어 층당 상위 30%를 통과하고 70 30 계면의 2-3밀리리터를 수집하고 HBSS의 1배 8밀리리터를 포함하는 깨끗한 원추형 튜브로 옮깁니다.

반전으로 희석된 계면을 몇 번 혼합한 다음 섭씨 18도에서 500GS에서 7분 동안 원심분리합니다. 스핀 후 supena를 제거하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 1ml의 세포 염색 완충액에서 세포 현탁액을 1.5ml 튜브로 옮기고 한 번 더 세척합니다.

항체 염색을 실행하기 위하여 항체 염색으로 진행하기 전에 10, 4 섭씨 온도에 1 분 동안 마이크로 분리기를 사용하여 000 GS를 사용하여, 순화된 반대로 미국 CD 16, CD 32의 50 마이크로리터에 있는 펠릿을 재현탁하고, 세포 염색 완충액에서 200에 1개를 희석하여 FC 바인딩 부위를 막기 위하여 재현탁시킨다. 모든 염색 절차와 관련하여 모든 항체를 적절하게 적정하여 얼음에서 10분 동안 배양해야 합니다. 배양 중에 2-5 마이크로 리터의 세포를 제거하고 혈구 분석기를 사용하여 계산합니다.

미숙한 뇌와 척수 조직을 합치면 쥐 한 마리당 5개의 세포에 10의 3-5배의 세포가 생성되어야 합니다. 염증이 생긴 뇌는 염증 세포가 수집되는 시점과 질병 모델에 따라 다양한 수의 염증 세포를 갖게 됩니다.CD 16 및 CD 32로 배양한 후 50마이크로리터의 면역 세포 특이적 항체 칵테일 믹스를 추가합니다. 이 예시에 사용된 혼합물에는 CD 45, CD 4 및 CD 19에 대한 항체가 포함되어 있으며, 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

중요한 것은 각 항체를 먼저 적정해야 한다는 것입니다. 최적의 희석을 평가하려면 특정 흐름의 레이저 및 필터 설정 기능에 따라 선택한 적절한 형광 색소 조합을 사용하십시오. 세포분석기는 세포를 염색한 후 세포 염색 완충액 1ml를 넣고 1분 동안 회전시켜 세포 염색 완충액으로 세척합니다.

스핀 후 10, 000Gs에서 앙와위 제제를 폐기한 다음 100-200마이크로리터의 세포 염색 완충액에 팔레트를 재현탁하여 나중에 분석하기 위한 즉각적인 유세포 분석을 수행합니다. Reus는 PBS에서 제조된 2%par 포름알데히드에 세포를 현탁시키고 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다. 여기에 표시된 것은 FC 블록으로 얻어지고 배양된 단핵 세포와 항 CD 45, CD 4 및 CD 19 항체입니다.

유세포 분석에 의해 입증된 프로토콜에 따라 CD 45 염색은 CD 45, DIM 감시 미세아교세포에서 CD 45 고혈구 세포를 잘 분리합니다. 이 그림은 실험적 자가면역 뇌척수염이 발병하도록 유도된 쥐의 순진한 세포와 염증이 있는 뇌에서 분리된 세포를 비교합니다. CD 45 PC intensity는 Y축에 표시되며, 여기서 세 개의 뚜렷한 집단이 naive brain에서 시각화됩니다.

CD 45 상위 셀의 수는 거의 감지되지 않습니다. 일반적으로 전체 격리 개체군의 2% 미만입니다. 이에 비해 EAE에 감염된 쥐의 뇌는 뇌로 모집된 혈액 세포의 대량 유입을 보여줍니다.

CD 11 b, CD four, CD eight 등과 같은 다른 세포 표면 마커를 추가하면 CD 45 높은 집단의 추가 특성화가 가능합니다.일단 마스터하면 이 기술이 제대로 수행되면 3-4시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안, 유세포 분석에 의한 면역 표현형 분석과 연계된 조직학적 접근법이 CNS 염증성 침윤 물질의 구성을 완전히 특성화하는 데 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.