Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

감염, 외상, 자가면역 질환 또는 신경퇴행성 질환 발생 시 면역 세포가 중추신경계로 침윤합니다. 조직화학적 접근법을 통해 침윤된 세포의 위치를 결정하고 관련 병리를 분석할 수 있지만, 이러한 기술은 동시에 사용할 수 있는 항체의 수에 제한이 있습니다. 본 영상에서는 절제된 조직을 먼저 균질화하여 뇌 및 척수 조직으로부터 단핵 세포를 빠르게 분리하는 방법을 소개합니다.

다음으로, 페리콜(percoll) 밀도 구배를 형성하고 원심분리를 통해 인터페이스에서 단핵 세포를 수집합니다. 마지막으로, 세포를 세척하고 항체로 염색합니다. 유세포 분석을 통해 혈행성 세포와 감시 미세아교세포를 구분하며, 질병 상태에서의 상대적 비율을 결정할 수 있습니다. 기존의 피크링(Ficoll) 구배 방식이나 조직 화학 염색과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 소요 시간이 더 짧다는 점입니다.

이를 통해 더 많은 조직을 동시에 처리할 수 있습니다. 그래디언트 설정을 시연할 연구실 테크니션이 이 프로토콜에 필요한 시약을 준비합니다. 뇌 하나당 4 mL의 SIP로 지칭되는 등장성 페로스톡(stock isotonic perol)부터 시작합니다.

이를 위해 perol 9분량과 칼슘 및 마그네슘이 제거된 10배 농축 HBSS 1분량을 혼합한 후 도립 혼합합니다. 다음으로, 준비된 SIP를 칼슘 및 마그네슘이 제거된 1배 농축 HBSS와 혼합하여 70% per call을 준비합니다. 그런 다음 조직을 수집하기 위해 70% per cole 2mL를 15mL 폴리프로필렌 원심 분리 튜브에 분주합니다.

본 절차에서는, 모든 실험 쥐의 적출된 뇌와 척수를 10 milliliters의 RPMI가 들어있는 비커에 넣고 얼음 위에 둡니다. 다음으로, 조직을 3 milliliters의 1배수 HBSS가 들어있는 7 또는 15 milliliter 다운 호모게나이저(down homogenizer)로 옮깁니다. 이때 헐거운 크기의 B 페스틀(pestle)을 사용하여 부드럽게 세포 현탁액을 만든 후, 딱 맞는 크기의 B 페스틀로 교체하여 조직을 추가로 해리합니다.

조직을 균질화한 후, RPMI 또는 1배 HBSS를 넣어 최종 부피를 7mL로 맞추고 Percoll 구배를 설정하는 단계로 진행합니다. 먼저 세포 현탁액에 3mL의 SIP를 추가하여 최종 PERCOCO 농도를 30%로 맞춥니다. 이때 Percoll은 상온에서 사용해야 함을 유의하십시오. 차갑게 사용할 경우 세포가 뭉치는 경향이 있어 세포 분리 효율이 떨어집니다.

다음으로, 피펫 에이드의 중력 모드(gravity mode)를 사용하여 10 milliliter의 세포 현탁액을 70% SIP 위에 천천히 층을 이루며 얹습니다. 70% 용액과 30% 용액이 섞이지 않도록 주의하십시오. 이는 전체 과정에서 가장 중요한 단계입니다.

70%와 30% 접합부에 매우 선명하고 평평한 경계선이 보여야 합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 층을 쌓는 동안 상층과 70% 용액이 섞여 어려움을 겪을 수 있습니다. 다음 단계로, 계면을 안정시키기 위해 18°C에서 500 Gs로 30분 동안 원심분리합니다.

인터페이스가 흐트러지지 않도록 원심분리기가 최소한의 제동 또는 제동 없이 정지하도록 설정하십시오. 기울기 원심분리를 마치면 튜브 상단에 두껍고 점성이 있는 파편 층이 축적됩니다. 그 다음 층은 황색의 30% Percoll 층이며, 때때로 파편이 포함되어 있을 수 있습니다.

다음은 70%와 30% 층의 경계면으로, 뚜렷한 흰색 띠(halo)가 나타나며 단핵구가 포함되어 있습니다. 마지막으로 튜브 바닥에는 투명한 70% Percoll 층이 위치합니다. 만약 경계면이 관찰되지 않는다면, 세포 회수율이 매우 낮을 가능성이 커 이후 분석이 매우 어려워질 것입니다.

따라서 이 시점에서 오염을 줄이기 위해 신선한 세포 현탁액이 필요할 수 있습니다. 튜브 상단의 부유물 층을 조심스럽게 제거하여 버립니다. 그다음 플라스틱 피펫을 사용하여 상단 30% 층을 지나 70-30 중간층에서 2~3 mL를 채취하여 1배수 HBSS 8 mL가 들어 있는 깨끗한 원추형 튜브로 옮깁니다.

희석된 인터페이스를 도립 혼합하여 몇 번 섞은 후, 18 °C에서 500 g로 7분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 펠렛을 재현탁합니다. 1 mL의 세포 염색 버퍼가 담긴 1.5 mL 튜브에 세포 현탁액을 옮기고 한 번 더 세척합니다.

항체 염색을 진행하기 전, 4 °C에서 10,000 g로 1분 동안 마이크로 원심분리기를 사용합니다. FC 결합 부위를 차단하기 위해, 펠릿을 세포 염색 버퍼에 1:200으로 희석한 50 µL의 정제된 anti-US CD 16, CD 32에 재현탁합니다. 모든 염색 절차와 마찬가지로, 모든 항체는 적절히 타이트레이션 되어야 하며, 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 배양하는 동안, 2~5 µL의 세포를 취하여 헤모사이토미터로 세포 수를 측정합니다.

정상 뇌와 척수 조직을 합치면 마우스 한 마리당 약 3~5×10⁵개의 세포를 얻을 수 있습니다. 염증이 있는 뇌의 경우, 수집 시점과 질환 모델에 따라 염증 세포의 수가 다양하게 나타납니다. CD 16 및 CD 32를 이용한 배양 후, 면역 세포 특이적 항체 칵테일 믹스 50 µL를 첨가합니다. 본 예시에서 사용된 믹스는 CD 45, CD 4 및 CD 19에 대한 항체를 포함하며, 이를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

중요한 점은, 각 항체를 먼저 적정해야 한다는 것입니다. 최적의 희석 배수를 평가하려면, 사용 중인 유세포 분석기의 레이저 및 필터 설정 기능에 맞춰 선택한 적절한 형광색소 조합을 사용하십시오. 세포를 염색한 후, 세포 염색 버퍼 1 mL를 첨가하고 1분 동안 원심 분리하여 세포 염색 버퍼로 세척합니다.

원심분리 후 10,000 Gs에서 상층액을 제거한 다음, 펠릿을 100 내지 200 µL의 세포 염색 버퍼에 재부유시켜 즉시 유세포 분석을 수행하거나 나중에 분석합니다. 또는 세포를 PBS로 제조한 2% paraformaldehyde에 재부유시켜 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 여기에서는 FC block과 함께 배양한 후 anti CD 45, CD 4 및 CD 19 항체를 처리하여 얻은 단핵구들이 나타나 있습니다.

유세포 분석을 통한 CD 45 염색 프로토콜에 따라, CD 45 high 혈행성 세포와 CD 45 DIM 감시 미세아교세포가 잘 분리됩니다. 이 그림은 정상 뇌와 실험적 자가면역성 뇌척수염이 유도된 생쥐의 염증성 뇌에서 분리된 세포들을 비교한 것입니다. Y축에는 CD 45 APC 강도가 표시되어 있으며, 정상 뇌에서는 세 가지 뚜렷한 세포군이 시각화됩니다.

CD 45 high 세포는 매우 적은 수만 검출됩니다. 일반적으로 분리된 전체 세포군의 2% 미만입니다. 이와 대조적으로, EAE가 유발된 마우스의 뇌에서는 뇌로 유입된 혈액 세포의 대규모 침윤이 관찰됩니다.

CD 11 b, CD 4, CD 8 등의 다른 세포 표면 마커를 추가하면 CD 45 high 집단을 더욱 세부적으로 특성화할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3~4시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 진행할 때, CNS 염증성 침윤물의 구성을 완전히 특성화하기 위해서는 유세포 분석을 통한 면역 표현형 분석과 조직학적 접근법을 병행하는 것이 매우 중요하다는 점을 기억해야 합니다.