Name: Intraperitoneal 감염 후 면역 세포의 인신 매매 형광등 프리온 로즈 시간을 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 학습하세요 프리온 감염 후 면역 세포의 섭취 및 운반 과정을 형광 표지된 프리온 로드를 이용해 실시간으로 모니터링하는 방법입니다. 거세포와 수지상 세포를 중심으로 한 면역 반응 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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우리는 마우스 처리와 관련하여 도움이 ultracentrifugation와 패티 키서와 관련하여 도움이 스티브 McBryant와 제프 핸슨 감사드립니다. 국립 보건원의 신경 질환 및 뇌졸중의 국립 연구소, 부여 5R01NS056379 - 02이 작품을 후원.

1. 프리온 봉 정화 및 라벨링 이 프로토콜은 한 이전에 출판 18 적응됩니다 <ol><li> 상업 믹서의 최대 속도로 1 분 후, 얼음에 2 분 얼음 추위 homogenizing 버퍼의 900 ML에서 프리온에 감염된 뇌 조직 100g (HB, 1X PBS 320 MM의 자당, 150 MM NaCl 및 4mm짜리 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 포함하는)를 균질. 세 번 반복합니다. </li><li> 10 3,000 XG에서 분 및 4 ° C.에 대한 homogenate 원심 분리기 제거하고 얼음에 뜨는 저장합니다. 1L HB의 펠렛을 다시 정지 및 단계 1.1과 1.2를 반복합니다. </li><li> 100,000 XG, 0 ° C. 60 분 풀 supernatants 및 원심 분리기 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 다시 중지 1X 트리스의 100 ML의 펠렛은 (10 MM 트리스 - HCL, 0.1 MM NaCl 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))이 2퍼센트 트리톤 X - 100 (TBST)이있는 염분 버퍼. 견적 단백질 브래드 또는 이와 유사한 분석하여 농도 5 TBST에 MG / ML을 조절할 수 있습니다. 30 분 얼음 칠. </li><li> 100,000 XG, 0 ° C.에서 30 분 원심 분리기 뜨는 취소 50 ML의 TBST 다음 100 ML TBS와 펠렛을 씻으십시오. 100 ML 1X PBS 1 %의 sarcosyl 및 테아제 억제제 칵테일을 포함에서 펠렛을 다시 정지 37에서 120 분 저어 ° C. </li><li> 100,000 XG, 10 ° C. 60 분 320 MM의 자당과 원심 분리기 900 ML에 레이어 샘플 뜨는 취소 10 ML 2.3M NaCl에 다시 중지 펠렛, 5 % sarcosyl. </li><li> 얼음 1 분 간격으로 70 % 최대 전력에서 샘플 5 X 40 초 Sonicate. </li><li> 13,000 XG, 4oC에서 15 분 동안 eppendorf 튜브 및 원심 분리기에 샘플 나누어지는 1 ML. TBS 및 매장과 함께 두 번 알약을 씻어 @ -70 ° C 또는 단계 1.9에서 fluorochrome에 공액. </li><li> DyLight 649 1 병을 사용하여 프리온 봉 정화의 공액 한 튜브 제조 업체의 프로토콜에 따라 fluorochrome. </li><li> 필터 컬럼을 통해 투석이나 원심 분리하여 PBS에 대한 Exchange DyLight 라벨 버퍼. -70 ° C에서 멀리 사용할까지 빛으로부터 20 μL aliquots에 보관하십시오. </li></ol> 2. 프리온 접종 및 셀 복구 이 섹션은 intraperitoneal 프리온 접종과 복막, mediastinal 및 mesenteric 림프절과 비장에서 세포의 복구를 포함. <ol><li> 사용하는 즉시 이전 형광 프리온 막대 PBS에서 1시 50분을 희석. 엄지와 검지로 지느러미 목 모피로 아저씨의 마우스는 부드럽게 얼굴과 분홍색 손가락으로 꼬리를 묶어 두려고 마우스를 켜십시오. 머리 위에서 뒷다리 몸통 이팅 및 약간 거꾸로 그를 잡고 마우스를 Supinate. </li><li> 30G의 인슐린 주사기를 사용하여 sacroiliac 관절에 앞쪽에 정중선과 1~2cm의 1cm 측면 형광 프리온 막대 100 μL를 주입. 피부를 통해서도 1cm가 medially 45 °를 감독 바늘을 삽입합니다. 컨트롤로 형광 구슬 또는 PBS 혼자의 1시 50분 희석을 사용합니다. 분석하기 전에 할당된 시간 쥐를 품어. </li><li> 승인 동물 보호에 따라 마우스를 안락사 및위원회 프로토콜을 사용합니다. 12 ML 주사기와 25G 바늘을 사용하여 복막 구멍에 PBS 10 ML을 주사. 부드럽게 일분 길이 방향 시체를 바위. 지육 절개가 지속하는 동안 얼음에 15 ML 원뿔 관과 보유에 동일한 주사기와 16G 바늘을 사용하는 복막의 세포 현탁액을 복구합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 철저하게 시체의 복부 측면 젖었어. 그냥 집게로 ribcage 아래의 정중선에서 피부를 허용하고 가위로 피부를 통해 작은 절개를 잘라. 각 엔드에서 정중선에서 두 2 cm의 incisions 옆으로 후, 머리와 꼬리 양쪽 방향에서 피부를 통해 3~5cm 긴 절개를, 거기서부터. 다시 필과 복막 및​​ 흉부 충치를 나타내기 위해 피부를 핀. 조심스럽게 복막을 둘러싸고있는 얇은 반투명 세포막을 통해 잘라 폐종격부을 나타내기 위해 흉부를 반영합니다. </li><li> 기관의 복부 쪽 근처 brachiocephalic 동맥 medially 인접한 thymus에 약간 지느러미와 옆으로 인접 2-4 mediastinal 림프절을,,, 찾기 및 제거합니다. 찾기 및 부드러운 흰색 mesenteric 조직에 포함된 여섯 mesenteric의 림프절까지 제거하는 사후 복부 벽에 앵커는 내장. 비장, 단지 정중선의 측면과 복부의 왼쪽에있는 내장에있는 등 지느러미 긴 어두운 빨간색 기관을 찾아 제거합니다. 예약 림프절 얼음 1 ML RPMI 1640 배지에 절개가 완료될 때까지. </li><li> 더운 물에 담가서 부드럽게하고 1 ML 주사기의 플런저를 사용하여 플라스틱 페트리 접시에 RPMI 3 ML로 40 μm의 메쉬 스트레이너를 통해 림프절을 누르십시오. RPMI의 추가 2 ML와 스트레이너를 씻어 15 ML 원뿔 관에 5 ML 세포 현탁액을 전송할 수 있습니다. RPMI의 추가 5 ML있는 페트리 접시를 씻어 같은 튜브로 전송할 수 있습니다. 250 XG에서 5 분 원심 분리기, 1 ML 외과 버퍼 (1X PBS, 1 % 소 혈청 알부민 및 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에 뜨는을 다시 중단 세포 펠렛을 버리고 1.5 ML Eppendorf 튜브에 전송할 수 있습니다. </li></ol> ove_title "&gt; 3. 세포 스테 이닝 및 유동세포계측법 다음은 잘 특징인 면역 세포 표면 마커에 대한 형광 항체를 사용하여 면역 세포 하위 집합을 식별에 대한 일반적인 얼룩 프로토콜입니다. 모든 항체는 사용하기 전에 즉시 외과의 버퍼로 희석되었다. <ol><li> Eppendorf 튜브에 세포 나누어지는 10 6 세포를 계산합니다. 원심 분리기 세포 (2.7 참조​​) 1 ML 외과 버퍼로 세척 펠릿 2X. </li><li> 내생 FC 수용체를 차단 2 NG / ML 쥐 방지 마우스 CD16/32 100 μL의 세포에게 얼음에 20 분 알을 품다. 펠렛 및 외과 버퍼로 세척 세포. </li><li> 한 시간 만이라도 얼음의 각 샘플과 부화 1ng / ML 적절한 형광등 antibod (Y) 이거야 100 μL를 추가합니다. 제어 세포에 혼자 외과 버퍼 100 μL를 추가합니다. 펠렛 및 외과 버퍼로 두 번 세척 세포. </li><li> 1 ML ACK 버퍼 (NH 4 Club 호텔 150 MM, 1 MM KHCO 3 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 적혈구를 lyse 1 분 얼음에 품어에서 다시 중지 세포. 펠렛 및 외과 버퍼로 세척 세포. 1 ML 외과 버퍼의 세포를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 일반적으로 405, 488 및 633 나노미터 여기 레이저 5-10 형광 방출 탐지기로, 여러 가지 빛깔의 검출 및 분석을 수있는 흐름 cytometer를 사용하여 세포에서 데이터를 수집합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 우리는 원유에서 프리온 봉 정화, E2 엘크 뇌 homogenate (차선 1 및 2)의 프리온에 감염된 뇌 homogenate (그림 1) 세제 solubilization 및 ultracentrifugation 크게 또한 프로 테아제 K되었습니다 프리온 막대 (차선 1 3 비교)에 대한 풍부한 저항 (레인 4). 흥미롭게도, 소화되지 않은 정화 프리온 막대는 prions에 대한 극적인 농축을 나타내는 소화 E2 뇌 homogenate에 놀랍도록 닮아 glycoform 프로필을 표시합니다. 동일 - 대우 정상 뇌 homogenate는 PK 방지 PrP C를 (차선 5 6) 생산하지 않습니다. 특정 세포 집단의 흐름 cytometric 분석은 항원 두 시간에 의해 복막에 세포를 집으로 발표하고 형광 구슬과 프리온 막대로 PBS 주입 제어를 통해 극적으로 증가 형광 (그림 2)에 의해 입증을 유지 보여줍니다. 동안 구슬 (Figs. 2 시간 - N)에서 세포 프리온 (Figs. 2O - U) - 주사 상당한 형광 표시 마우스 (Figs. 2A - G) 배경 위에 형광 표시 PBS - 취급 컨트롤의 복막에서 수확 대한 세포도 특히 monocytes에 (Figs. 2I와 P), 돌기 세포 (Figs. 2K 및 R) 및 macrophages (Figs. 2L 및 S), 일부 Neutrophils (그림 2J 및 Q)와 적은 B 세포 (그림 2T). 비드와 프리온 베어링 monocytes, 돌기 세포 및 macrophages도 이시간 접종 (Figs. 2AD 및 AK, AF 및 AM과 AG와, 각각), 동안 거의 또는 전혀 PrP CWD 베어링 Neutrophils 후 mediastinal 림프절에서 발견되었습니다 , B 또는 T 세포 (Figs. 2AE와 AL, AH 및 AG 각각 AI와 AP)가 발견되었습니다. 우리는 비장이나 림프절 mesenteric (데이터가 표시되지 않음)에 구슬이나 프리온 막대를 감지하지 않습니다. 토토, 이러한 데이터는 면역 세포의 트래픽이 다른 미립자 항원 매우 비슷하게 prions 것을 보여줍니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> FLUOROCHROME </td><td> 여기 레이저 (NM) </td><td> PEAK 방출 (NM) </td></tr><tr><td> 프리온 막대 </td><td> DyLight 649 </td><td> 633 </td><td> 674 </td></tr><tr><td> 1 μm의 구슬 </td><td> AlexaFluor 660 </td><td> 633 </td><td> 685 </td></tr><tr><td> 항체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CD11b </td><td> eFluor 450 </td><td> 405 </td><td> 450 </td></tr><tr><td></td><td> Phycoerythrin - Cy7 </td><td> 488 </td><td> 760 </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> R - Phycoerythrin </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr><tr><td></td><td> Phycoerythrin - Cy7 </td><td> 488 </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Ly6C </td><td> Fluoroisothiocyante </td><td> 488 </td><td> 518 </td></tr><tr><td> Ly6G </td><td> R - Phycoerythrin </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr><tr><td> CD21 </td><td> DyLight 488 </td><td> 488 </td><td> 518 </td></tr><tr><td> B220 </td><td> Allophycocyanin - Cy7 </td><td> 633 </td><td> 785 </td></tr><tr><td> 인 경우에는 3 번 CD에 들어 </td><td> R - Phycoerythrin </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr></tbody></table>형광 시약의 "&gt; 표 1. 스펙트럼 특성 <img src="/files/ftp_upload/2349/2349fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 감염된 뇌 homogenate에서 프리온 막대의 정제가. 우리는 집계 프리온 봉 (차선 3, 4) 투석을하는 자료를 시작으로 CWD에 감염된 사슴 (E2, 차선 1and 2)에서 10 % 원유의 뇌 homogenate를 사용했습니다. 정상적인 두뇌 homogenate이 (차선 5 6)하지 않는 반면, - 원유 및 정화 재료는 모두 프로 테아제 K 치료 (4 차선 1) 특성 저항을 보여주었다. 분자량 마커는 얼룩의 왼쪽에 KD에 표시됩니다. BH, 뇌 homogenate. <img src="/files/ftp_upload/2349/2349fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 접종은. (패널 AG와 V - AB), 형광 구슬 (HN 및 AC - AI) 또는 프리온 막대는 (OU와 AJ - AP = 연합 뉴스) PBS되었습니다 두 시간 후에 복막에서 mediastinal 림프절에 면역 세포의 인신 매매 prions의 흐름 cytometric 분석 복막 세척 유체 (AU) 또는 두 시간 후에 mediastinal 림프절 (V - AP)에서 수확 마우스 및 세포의 복막으로 주입. PBS (패널 A와 V), 형광 구슬 (패널 H와 AC)과 프리온 막대 (패널 O 및 AJ) 대우 생쥐에서 첫 번째 칼럼보기 세포의 그래프로 보여줍니다. 형광 셀 (빨간색 또는 녹색 점들)와 전체 세포 (회색 점) 상대 크기 (앞으로 분산형), 입도 (사이드 분산형) 및 형광 총 라이브 세포의 비율을 보여주 꾸몄다 있습니다. granulocytes의 특징 세포의 중요한 숫자는 형광 구슬과 막대를 유지. 세포는 또한 면역 세포 표면 마커와 LyG - Ly6C + monocytes에 대한 문이 (패널 B, I, P, W, 광고 및 AK), Ly6c - CD11c - CD11b + Ly6G + neutrophils (C, J, Q, X, AE에 대한 항체 물들일되었습니다 그리고 AL), Ly6G - Ly6C - CD11b + CD11c + 돌기 세포 (D, K, R, Y, AF와 AM), Ly6G - Ly6C - CD11c - CD11b + macrophages, (E, L, S, Z, AG와) 인 경우에는 3 번 CD에 들어 - B220 + CD21 + B - 세포 (F, M, T, AA, AH 및 AO) 및 CD21 - B220 - 인 경우에는 3 번 CD + T 세포 (G, N, U, AB, AI 및 AP). Monocytes, 돌기 세포 및 macrophages은 복막 캐비티 (패널 I와 P, K와 R과 L과 S, 각각)에서 형광 구슬과 프리온 봉을 보유하고 mediastinal 림프절 (패널 광고 및 AK, AF 및 오전 및 AG에게 운반 각각),이 두 입자의 유사한 이해와 인신 매매를 시연. Neutrophils은 구슬 (J)와 적은 봉 (Q)의 상당한 금액을 유지하지만, (AE 및 AL) 림프절에게 전달하지 못했습니다. B 세포 일부 봉 (T 및 AO)하지만 거의없이 구슬을 (M 및 AH) 유지 및 수송. T 세포는 구슬이나 막대 (N, U, AI 및 AP = 연합 뉴스)도없는 인신 매매.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기 우리는 크게 말초 프리온 감염 초기에 이벤트를 모니터링 용이 생체내에 태그 및 추적 prions에 대한 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 크게 unambiguously 내생 PrP C에서 차별화에 사전 라벨 매우 풍부한 프리온 inoculum에 의해 체외 9 및 생체내 3,12의 모니터링 프리온 이해에서 과거 시도를 향상시킵니다. 전염성 prions와 PrP C가 동일한 기본 아미노산 서열을 공유하기 때문에 발생 프리온 특정 항체가 문제가되었습니다. 우리는 PK - 소화와 메탄올 우리가 Dylight 649 - labelelled 방지 PrP 항체를 (우리되지 않은 데이터)를 사용하여 추적되는 원유 뇌 homogenate를 시켰던로 주입 PrP의 NULL 마우스를 사용하여 유사한 실험을 수행했습니다. 여기 같이이 실험은 거의 동일한 결과를 생산하지만, PrP NULL 마우스는 프리온 질환 <s...

<table><tbody><tr><td>CWD 감염 엘크 뇌</td><td>콜로라도의 개인 엘크 농장</td><td></td><td>인간이 아닌 모든 프리온 감염 뇌 사용 가능</td></tr><tr><td>블렌더</td><td>Oster Professional Products</td><td>6694-015</td><td>모든 상업용 블렌더 사용 가능</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>SS34 rotor</td><td>3000 x g에 도달할 수 있고 &amp;#8805; 500 ml 용량을 수용할 수 있는 모든 원심분리기/로터 사용 가능</td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>50.2 Ti rotor</td><td>100,000 x g에 도달할 수 있고 &amp;#8805; 500 ml 용량을 수용할 수 있는 모든 초원심분리기/로터 사용 가능</td></tr><tr><td>Bradford 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>초음파 파쇄기</td><td>Misonix</td><td>MP4000X</td><td>최대 출력의 ~70%로 설정된 모든 혼(horn) 또는 프로브(probe) 초음파 파쇄기 사용 가능</td></tr><tr><td>DyLight 항체 표지 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>53050</td><td></td></tr><tr><td>마이크로원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>55430R</td><td>13,000x &lt;em&gt;g&lt;/em&gt;를 달성할 수 있는 모든 냉장 마이크로원심분리기 사용 가능</td></tr><tr><td>원심 여과 컬럼</td><td>EMD Millipore</td><td>Microcon YM-100</td><td>100 Kd 분자량 컷오프를 가진 모든 필터 또는 투석막 사용 가능</td></tr><tr><td>8-40주령 FVB 마우스</td><td>Charles River Laboratories</td><td>207</td><td>모든 근친 교배 마우스 계통 사용 가능</td></tr><tr><td>1 &amp;mu;m 적색 형광 비드</td><td>Phosphorex</td><td>2307</td><td>&amp;#8804; 10 &amp;#x03BC;m 크기의 모든 형광 비드 사용 가능</td></tr><tr><td>RPMI 1640 배지</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 세포 스트레이너</td><td>Falcon BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>형광 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>Various</td><td>실험 목적에 적합한 모든 형광 항체 사용 가능</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>Dako</td><td>CyanADP</td><td>다색 형광 검출이 가능한 모든 유세포 분석기 사용 가능</td></tr></tbody></table>

intraperitoneal 감염 후 면역 세포의 인신 매매 형광등 프리온 로즈 시간을 모니터링

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

비정상적인 형태의 존재 프로 테아제, 모성 pathologic 및 전염성있는 호스트 인코딩된 프리온 단백질 (PrPC)는 같은 양의 cervids과 scrapie의 만성 낭비 질병 (CWD)와 같은 프리온 질병을 특징. 프리온 가설이 비정상 conformer가 대부분 또는 모든 감염성 프리온의를 종속 주장한다. 주변 프리온 pathogenesis 초기 행사에 면역 체계의 역할은 설득 CWD과 scrapie 1-3에 대한 증명되었습니다. 생쥐에 유전자 변형과 pharmacologic 연구는 감염 4-6 후 조기 prions을 유지하고 복제의 보완 시스템의 중요한 역할을 공개했다. 또한 70-10 돌기 세포 프리온 보존을 살펴 봤으니, 체외에서와 생체내 연구에서 매매에서 역할이 남아 있지만, 11-16 불분명. Macrophages는 마찬가지로 초기 프리온 pathogenesis에 연루되어 있지만,이 연구는 감염 후 3,11,17 주 발생하는 이벤트에 초점을 맞추고있다. 이러한 이전 연구는 또한 내생 PrP C와 전염성 prions 간의 차별의 문제에서 고통. 여기 우리가 모집 면역 세포에 의해 접종 사이트에서 프리온 이해와 인신 매매를 평가하기위한 semiquantitative, 편견 방식을 설명합니다. 집계 프리온 막대가 아닌 집계 단백질과 자당의 쿠션을 통해 ultracentrifugation의 세제 solubilization에 감염된 뇌 homogenate에서 정화했다. Polyacrylamide 젤 전기 영동, 쿠매시 푸른 얼룩과 pelleted 분수에 매우 풍부한 프리온 봉의 서쪽 모래 바닥 확인 회복. 프리온 막대는 마우스로 fluorochrome - 라벨이 다음 주입 intraperitoneally했다. 2 시간 후에 복막 세척 유체, 비장 및 mediastinal 및 mesenteric 림프절의 면역 세포는 프리온 막대기 유지 및 monocytes, neutrophils, 돌기 세포, macrophages 및 B 및 T 세포에 대한 마커를 사용하여 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법으로 식별 셀 집합에 대한 assayed했다. 이 분석은 감염 후 시간 이내에 면역 획득 세포와 생체내의 인신 매매 prions의 처음으로 직접 모니터링을 허용합니다. 이 분석은 또한 분명 어렵고 다른 분석 시스템의 데이터 해석에 문제가 발생할 수있는 일반적으로 호스트 세포에 표현 PrPC에서 전염성, 집계 prions를 차별화합니다. 이 프로토콜은 다른 접종 경로 (경구, 정맥, intranervous 및 피하 예)와뿐만 아니라 항원 (복합 비즈, 세균 바이러스 및 기생 병원균과 단백질, 계란)에 적용할 수 있습니다.

여기 우리는 즉시 정화하여 intraperitoneal 접종 다음과 찬란 다음 주사 사이트에서 자신의 이해와 움직임을 모니터링하고 이러한 이벤트를 중재 전지 특성화 감염 두뇌 자료에서 집계 프리온 봉 라벨 면역 세포 프리온 이해와 인신 매매를 감시를위한 소설 분석을 설명합니다.

Intraperitoneal 감염 후 면역 세포의 인신 매매 형광등 프리온 로즈 시간을 모니터링

프로테아제 저항성을 가지며 병리적이고 감염성이 있는, 숙주 인코딩 프리온 단백질(PrPC)의 비정상적인 형태의 존재는 ...와 같은 프리온 질환의 특징입니다.

본 실험 절차의 주요 목적은 감염 후 수 시간 내에 면역 세포에 의한 프리온의 섭취 및 이동을 모니터링하는 것입니다. 우선, 감염된 뇌에서 응집된 프리온 로드를 정제하고 형광 색소로 표지한 다음, 이 프리온 로드를 마우스의 복강 내에 접종합니다. 2시간 후, 복강과 비장, 그리고 종격동 및 장간막 림프절에서 세포를 수집합니다. 마지막으로, 회수된 세포를 면역 표현형 마커로 염색하고 프리온 보유 여부를 분석합니다.예를 들어, 유세포 분석 결과는 프리온 로드(prion rods)가 주로 대식세포와 수지상세포에 의해 유지 및 수송되며, 그 다음으로는 단핵구, 그리고 세 번째로 B 세포에 의해 수송됨을 보여주는 데 사용될 수 있습니다. 이 실험 시스템은 감염 직후 어떤 세포가 PreOn을 섭취하는지, 그리고 이를 어디로 운반하며 얼마나 빠르게 도달하는지와 같은 핵심 질문에 답함으로써 프리온 저장소와 잠재적인 치료 표적을 밝히기 위해 설계되었습니다.본 절차의 시연은 PreOn 단백질을 수집하기 위해 저희 실험실의 대학원생인 Crystal, Mt.And Brady Michael이 진행하겠습니다. 상용 블렌더를 사용하여 PreOn에 감염된 뇌 조직 100 milligrams를 얼음처럼 차가운 균질화 완충액 900 milliliters에 넣고 최대 속도로 1분간 균질화한 후, 즉시 얼음 위에 2분 동안 둡니다. 단백질 수율을 높이기 위해 이 과정을 세 번 반복합니다.균질액을 3000 Gs, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하여 얼음 위에 보관합니다. 펠렛을 1 L의 hp에 재현탁하고 균질화 및 원심분리 단계를 반복합니다.이제 snat를 모아 0 °C에서 100,000 ×g로 60분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다. 펠렛을 100 mL의 TBST에 재부유시킵니다.Bradford Assay를 통해 단백질 농도를 추정하고, TBST 내 단백질 농도가 5 mg/mL가 되도록 부피를 조절하십시오. 얼음 위에서 30분 동안 냉각하십시오. 다시 0 °C에서 100,000 ×g로 30분 동안 원심분리하십시오.SNA를 제거하고 펠렛을 먼저 50 milliliters의 TBST로 세척합니다. 그 후, 1% sarcas seal 및 proteus inhibitor cocktail이 포함된 100 milliliters의 1X PBS에 생성된 펠렛을 재현탁하고 37 degrees Celsius에서 120분 동안 교반합니다. 자당 농도 구배(sucrose gradient)를 수행하려면, 샘플을 900 milliliters의 320 millimolar sucrose 위에 층을 이루게 얹고 60분 동안 원심분리합니다.10 °C에서 100,000 ×g로 원심분리합니다. 상층액은 버리고 펠렛을 2.3 M sodium chloride, 5% Sarco seal 10 mL에 다시 현탁합니다. 이제 샘플을 최대 출력의 70%로 40초씩 5회 초음파 처리하며, 각 처리 사이에는 1분 간격으로 휴지기를 둡니다.샘플 1 mL를 마이크로 튜브에 넣고 4 °C에서 13,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 펠렛을 TBS로 두 번 세척하고 스톡을 -70 °C에서 보관합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 DITE 649 형광색소 1바이알을 사용하여 정제된 PreOn rod 1튜브를 접합합니다.마지막으로, 필터 컬럼을 이용한 원심분리를 통해 다이 라벨링 버퍼를 PBS로 교체합니다. 20 µL씩 분주하여 -70 °C에서 빛을 차단한 상태로 보관하며, 사용 직전에 꺼냅니다. 이 섹션에서는 복강 내 투여, 프리온 접종, 그리고 D loop 형광 프리온 사용 직전의 복강, 종격동 및 장간막 림프절과 비장에서의 세포 회수 과정을 다룹니다.엄지와 검지로 등 쪽 목덜미 털을 잡아 PBS에 담긴 1번부터 50번까지의 쥐를 고정합니다. 쥐를 조심스럽게 돌려 정면을 향하게 하고 새끼손가락으로 꼬리를 제어합니다. 쥐를 회내시켜 머리보다 뒷몸통을 높게 들어 올리고 약간 거꾸로 된 상태로 유지합니다.30게이지 인슐린 주사기를 사용하여, 정중선에서 외측으로 1cm, 천장관절에서 전방으로 1~2cm 떨어진 지점에 형광 파이온 로드 100 µL를 주입합니다. 바늘을 피부를 통해 1cm 깊이로 삽입하며 45도 내측 방향으로 향하게 합니다. 대조군 생쥐의 경우, 형광 비드를 1:50으로 희석하여 사용하거나 PBS만을 사용합니다. 실험 설계에 따라, 분석을 시작하기 전 정해진 시간 동안 생쥐를 배양합니다.승인된 동물실험윤리위원회 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시킵니다. 12 mL 주사기와 25 gauge 바늘을 사용하여 복강 내에 PBS 10 mL를 주입합니다. 마우스 해부를 진행하기 위해 마우스를 앞뒤 방향으로 1분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.70% ethanol로 마우스 외피의 복측을 충분히 적십니다. 핀셋으로 흉곽 바로 아래 중앙선의 피부를 들어 올린 후, 가위로 피부에 작은 절개를 냅니다. 머리와 꼬리 양방향으로 피부를 3~5cm 길이로 절개합니다.정중선에서 양측 끝단으로 2 cm 길이의 절개를 가한 후, 피부를 젖혀 핀으로 고정하여 복강과 흉강을 노출시킵니다. 동일한 주사기와 16 gauge 바늘을 사용하여 복막에서 세포 현탁액을 회수합니다. 삼출액을 15 milliliter 원심분리관에 넣고 얼음 위에 보관합니다.복막을 둘러싸고 있는 얇고 반투명한 막을 조심스럽게 절개하고 흉부를 젖혀 종격동을 노출시킵니다. 이제 기관의 복측 근처, 상완두동맥의 내측이자 흉선의 약간 등쪽 및 외측에 인접한 종격동 림프절 2~4개를 찾아 제거합니다. 다음으로, 장을 후복벽에 고정시키는 부드럽고 흰 장간막 조직에 박혀 있는 장간막 림프절을 최대 6개까지 찾아 제거합니다.적출한 림프절은 섹션 작업이 완료될 때까지 얼음 위에 놓인 1 mL의 PMI 1640 배지에 보관하십시오. 마지막으로 비장을 찾아 제거합니다. 비장은 마우스의 좌측, 정중선 바로 가측이자 장의 배측에 위치한 길쭉하고 진한 붉은색의 기관입니다.1 mL 주사기의 플런저를 사용하여 림프절을 으깬 후, 40 µm 메쉬 스트레이너를 통해 플라스틱 페트리 접시에 담긴 3 mL의 PBS로 압착하여 통과시킵니다. 스트레이너를 2 mL의 PBS로 추가로 헹구고, 총 5 mL의 세포 현탁액을 15 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 또한, 페트리 접시를 5 mL의 PBS로 추가로 헹구어 동일한 튜브로 옮깁니다.샘플을 250 gs에서 5분 동안 원심 분리하십시오. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 재부유시킵니다. 1 mL의 fax buffer에 분리된 세포를 1.5 mL EOR 튜브로 옮기십시오.일반적으로 이 염색 프로토콜은 잘 알려진 면역 세포 표면 마커에 대한 형광 항체를 사용하여 면역 세포 서브셋을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 모든 항체를 fax buffer에 희석하십시오. 사용 직전에 세포 수를 측정하고 $10^6$개의 세포를 ependorf tube에 분주한 후, 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고 1 mL의 fax buffer로 펠렛을 2회 세척하여 내인성 FC 수용체를 차단하십시오.세포를 2 ng/mL 농도의 rat anti-US CD 1632 100 µL에 넣고 얼음 위에서 20분 동안 배양한 후, 펠렛화하여 FACS buffer로 세척합니다. 다음으로, 각 샘플에 1 ng/mL 농도의 적절한 형광 항체 또는 항체들을 100 µL씩 첨가하고 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 대조군 세포에는 FACS buffer만 100 µL 첨가하고, 펠렛화한 후 FACS buffer로 두 번 세척합니다.세포를 1 mL의 act 버퍼에 재부유시킨 후, 얼음 위에서 1분 동안 배양합니다. 적혈구를 용해하려면 세포 펠렛을 생성하고 fax 버퍼로 세척한 뒤, 세포를 1 mL의 fax 버퍼에 재부유시킵니다. 일반적으로 405, 488 및 633 nm 여기 레이저와 5~10개의 형광 방출 검출기가 장착된 유세포 분석기로 샘플을 분석합니다.조조(Crude) 프리온이 포함된 감염된 뇌 균질액에는 프리온이 매우 풍부하게 농축되어 있습니다. 정제 과정에는 E2 엘크 뇌 균질액의 계면활성제 처리, 가용화 및 초원심분리가 포함됩니다. 그 생성물은 프로테아제입니다.특정 세포군에 대한 K 저항성 팩스 분석 결과, 항원 제시 세포가 2시간 만에 복강으로 이동하며 형광 비드와 프리온 로드를 보유하고 있음이 확인되었습니다. 비드와 프리온이 접종된 마우스의 세포에서는 특히 단핵구, 수지상 세포 및 대식세포에서 유의미한 형광이 나타났습니다.PreOn을 함유한 단핵구, 수지상 세포 및 대식세포가 종격동 림프절에서도 발견되었습니다. 접종 2시간 후, 구강 또는 장간막 림프절에서는 비드나 PreOn 막대형 입자가 검출되지 않았습니다. 본 실험의 영상에서는 복강 내 주사를 위해 감염된 뇌에서 응집된 프리온 막대형 입자를 정제하는 여러 프로토콜과 림프절을 정확하게 식별 및 분리하는 방법, 그리고 최종적으로 면역 세포를 분리하고 염색하는 방법을 시연하였습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 GFP 형질 전환 말라리아 기생충이 장기 내에 기생충의 이동성과 혈액 흐름의 부량를 사용하여 비장의 intravital 현미경을 수행하는 방법을 보여줍니다.

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

Citrobacter rodentium 감염이 장의 세균 감염을 공부뿐만 아니라 마우스의 면역 반응 및 대장염를 개최 할 수있는 중요한 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 장벽 무결성, 병원체 부하와 손쥐 전염성 대장염에 대한 병원체 및 호스트 공헌의 철저한 특성을 허용하는 조직 학적 손상의 측정을 설명합니다.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; 마우스 모델 : 감염성 대장염에 대한 공부 병원체 및 호스트 기부

멀티 양상 이미징 작은 동물 모델에서 세균성 식민지 공부를위한 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 생물 발광과 생쥐의 감염을...

의 4D 좌석 Multimodality 이미징<em&gt; Citrobacter rodentium</em마우스에서&gt; 감염

리스테리아 균은 자주 세포 내 기생의 연구를위한 주요 모델로 사용되는 그람 양성 세균 병원체이다. 후반 L. 이미징 소 간섭 RNA 화면의 문맥 내 감염 단계 모노 사이토 겐은 표적 숙주 세포의 세균 감염에 필요한 세포 경로의 글로벌 학습을 허용한다.

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

간의 면역 세포를 안정적으로 생체 내 고해상도 이미징하는 것은 어려운 일입니다. 여기에서는 집중 치료 모니터링과 함께 생체 내 다광자 레이저 스캐닝 현미경을 통해 장기간(약 6시간)에 걸쳐 마우스 간에 있는 면역 세포의 이동 및 세포-세포-상호 작용을 연구할 수 있는 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

이 프로토콜은, 리스테리아의 EGD 균주 (L. 모노 사이토 겐)을 C57BL / 6J 마우스에 접종하고, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포에 의한 인터페론 - γ (IFN-γ) 응답을 측정하는 방법을 설명 적응 T 포스트 감염 림프구. 이 프로토콜은 또한 병원균의 수정 된 LD (50) 투여로 감염 후 쥐에서 생존 연구를 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

와 실험 감염<em&gt; 리스테리아</em&gt; 호스트 인터페론-γ 응답 유학을위한 모델로

여기, 우리 향상 된 녹색 형광 단백질 표현 대장균을 사용 하 여 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해

우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 감염 분석 호스트 인코딩 요인의 활동을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

여기서, 우리는 뮤린 이차 림프기관에서 사이토카인 인터페론 감마를 분비하는 세포의 내부 국소화를 가시화하는 간단한 공초점 이미징 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 다양한 조직에서 다른 사이토카인의 시각화를 위해 확장될 수 있다.

리스테리아 단세포 유전자 감염 다음 마우스 비장에서 시투 인터페론 감마 생산의 이미징

본 프로토콜은 손상되지 않은 깨끗한 장기 및 조직에서 증식 및 휴면 중인 트리파노소마 크루지 기생충 및 T 세포를 시각화하고 정확하게 정량화하기 위한 광시트 형광 현미경 및 자동화된 소프트웨어 지원 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 치료 결과를 평가하고 기생충-숙주 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 T 세포의 정량적 3D 이미징

우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에서 복막 조직 상주 대식세포의 유전자 기능을 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

학습하세요 프리온 감염 후 면역 세포의 섭취 및 운반 과정을 형광 표지된 프리온 로드를 이용해 실시간으로 모니터링하는 방법입니다. 거세포와 수지상 세포를 중심으로 한 면역 반응 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

Intraperitoneal 감염 후 면역 세포의 인신 매매 형광등 프리온 로즈 시간을 모니터링

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