Intraperitoneal 감염 후 면역 세포의 인신 매매 형광등 프리온 로즈 시간을 모니터링

본 실험 절차의 주요 목적은 감염 후 수 시간 내에 면역 세포에 의한 프리온의 섭취 및 이동을 모니터링하는 것입니다. 우선, 감염된 뇌에서 응집된 프리온 로드를 정제하고 형광 색소로 표지한 다음, 이 프리온 로드를 마우스의 복강 내에 접종합니다. 2시간 후, 복강과 비장, 그리고 종격동 및 장간막 림프절에서 세포를 수집합니다. 마지막으로, 회수된 세포를 면역 표현형 마커로 염색하고 프리온 보유 여부를 분석합니다.

예를 들어, 유세포 분석 결과는 프리온 로드(prion rods)가 주로 대식세포와 수지상세포에 의해 유지 및 수송되며, 그 다음으로는 단핵구, 그리고 세 번째로 B 세포에 의해 수송됨을 보여주는 데 사용될 수 있습니다. 이 실험 시스템은 감염 직후 어떤 세포가 PreOn을 섭취하는지, 그리고 이를 어디로 운반하며 얼마나 빠르게 도달하는지와 같은 핵심 질문에 답함으로써 프리온 저장소와 잠재적인 치료 표적을 밝히기 위해 설계되었습니다.

본 절차의 시연은 PreOn 단백질을 수집하기 위해 저희 실험실의 대학원생인 Crystal, Mt.And Brady Michael이 진행하겠습니다. 상용 블렌더를 사용하여 PreOn에 감염된 뇌 조직 100 milligrams를 얼음처럼 차가운 균질화 완충액 900 milliliters에 넣고 최대 속도로 1분간 균질화한 후, 즉시 얼음 위에 2분 동안 둡니다. 단백질 수율을 높이기 위해 이 과정을 세 번 반복합니다.

균질액을 3000 Gs, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하여 얼음 위에 보관합니다. 펠렛을 1 L의 hp에 재현탁하고 균질화 및 원심분리 단계를 반복합니다.

이제 snat를 모아 0 °C에서 100,000 ×g로 60분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다. 펠렛을 100 mL의 TBST에 재부유시킵니다.

Bradford Assay를 통해 단백질 농도를 추정하고, TBST 내 단백질 농도가 5 mg/mL가 되도록 부피를 조절하십시오. 얼음 위에서 30분 동안 냉각하십시오. 다시 0 °C에서 100,000 ×g로 30분 동안 원심분리하십시오.

SNA를 제거하고 펠렛을 먼저 50 milliliters의 TBST로 세척합니다. 그 후, 1% sarcas seal 및 proteus inhibitor cocktail이 포함된 100 milliliters의 1X PBS에 생성된 펠렛을 재현탁하고 37 degrees Celsius에서 120분 동안 교반합니다. 자당 농도 구배(sucrose gradient)를 수행하려면, 샘플을 900 milliliters의 320 millimolar sucrose 위에 층을 이루게 얹고 60분 동안 원심분리합니다.

10 °C에서 100,000 ×g로 원심분리합니다. 상층액은 버리고 펠렛을 2.3 M sodium chloride, 5% Sarco seal 10 mL에 다시 현탁합니다. 이제 샘플을 최대 출력의 70%로 40초씩 5회 초음파 처리하며, 각 처리 사이에는 1분 간격으로 휴지기를 둡니다.

샘플 1 mL를 마이크로 튜브에 넣고 4 °C에서 13,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 펠렛을 TBS로 두 번 세척하고 스톡을 -70 °C에서 보관합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 DITE 649 형광색소 1바이알을 사용하여 정제된 PreOn rod 1튜브를 접합합니다.

마지막으로, 필터 컬럼을 이용한 원심분리를 통해 다이 라벨링 버퍼를 PBS로 교체합니다. 20 µL씩 분주하여 -70 °C에서 빛을 차단한 상태로 보관하며, 사용 직전에 꺼냅니다. 이 섹션에서는 복강 내 투여, 프리온 접종, 그리고 D loop 형광 프리온 사용 직전의 복강, 종격동 및 장간막 림프절과 비장에서의 세포 회수 과정을 다룹니다.

엄지와 검지로 등 쪽 목덜미 털을 잡아 PBS에 담긴 1번부터 50번까지의 쥐를 고정합니다. 쥐를 조심스럽게 돌려 정면을 향하게 하고 새끼손가락으로 꼬리를 제어합니다. 쥐를 회내시켜 머리보다 뒷몸통을 높게 들어 올리고 약간 거꾸로 된 상태로 유지합니다.

30게이지 인슐린 주사기를 사용하여, 정중선에서 외측으로 1cm, 천장관절에서 전방으로 1~2cm 떨어진 지점에 형광 파이온 로드 100 µL를 주입합니다. 바늘을 피부를 통해 1cm 깊이로 삽입하며 45도 내측 방향으로 향하게 합니다. 대조군 생쥐의 경우, 형광 비드를 1:50으로 희석하여 사용하거나 PBS만을 사용합니다. 실험 설계에 따라, 분석을 시작하기 전 정해진 시간 동안 생쥐를 배양합니다.

승인된 동물실험윤리위원회 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시킵니다. 12 mL 주사기와 25 gauge 바늘을 사용하여 복강 내에 PBS 10 mL를 주입합니다. 마우스 해부를 진행하기 위해 마우스를 앞뒤 방향으로 1분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.

70% ethanol로 마우스 외피의 복측을 충분히 적십니다. 핀셋으로 흉곽 바로 아래 중앙선의 피부를 들어 올린 후, 가위로 피부에 작은 절개를 냅니다. 머리와 꼬리 양방향으로 피부를 3~5cm 길이로 절개합니다.

정중선에서 양측 끝단으로 2 cm 길이의 절개를 가한 후, 피부를 젖혀 핀으로 고정하여 복강과 흉강을 노출시킵니다. 동일한 주사기와 16 gauge 바늘을 사용하여 복막에서 세포 현탁액을 회수합니다. 삼출액을 15 milliliter 원심분리관에 넣고 얼음 위에 보관합니다.

복막을 둘러싸고 있는 얇고 반투명한 막을 조심스럽게 절개하고 흉부를 젖혀 종격동을 노출시킵니다. 이제 기관의 복측 근처, 상완두동맥의 내측이자 흉선의 약간 등쪽 및 외측에 인접한 종격동 림프절 2~4개를 찾아 제거합니다. 다음으로, 장을 후복벽에 고정시키는 부드럽고 흰 장간막 조직에 박혀 있는 장간막 림프절을 최대 6개까지 찾아 제거합니다.

적출한 림프절은 섹션 작업이 완료될 때까지 얼음 위에 놓인 1 mL의 PMI 1640 배지에 보관하십시오. 마지막으로 비장을 찾아 제거합니다. 비장은 마우스의 좌측, 정중선 바로 가측이자 장의 배측에 위치한 길쭉하고 진한 붉은색의 기관입니다.

1 mL 주사기의 플런저를 사용하여 림프절을 으깬 후, 40 µm 메쉬 스트레이너를 통해 플라스틱 페트리 접시에 담긴 3 mL의 PBS로 압착하여 통과시킵니다. 스트레이너를 2 mL의 PBS로 추가로 헹구고, 총 5 mL의 세포 현탁액을 15 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 또한, 페트리 접시를 5 mL의 PBS로 추가로 헹구어 동일한 튜브로 옮깁니다.

샘플을 250 gs에서 5분 동안 원심 분리하십시오. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 재부유시킵니다. 1 mL의 fax buffer에 분리된 세포를 1.5 mL EOR 튜브로 옮기십시오.

일반적으로 이 염색 프로토콜은 잘 알려진 면역 세포 표면 마커에 대한 형광 항체를 사용하여 면역 세포 서브셋을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 모든 항체를 fax buffer에 희석하십시오. 사용 직전에 세포 수를 측정하고 $10^6$개의 세포를 ependorf tube에 분주한 후, 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고 1 mL의 fax buffer로 펠렛을 2회 세척하여 내인성 FC 수용체를 차단하십시오.

세포를 2 ng/mL 농도의 rat anti-US CD 1632 100 µL에 넣고 얼음 위에서 20분 동안 배양한 후, 펠렛화하여 FACS buffer로 세척합니다. 다음으로, 각 샘플에 1 ng/mL 농도의 적절한 형광 항체 또는 항체들을 100 µL씩 첨가하고 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 대조군 세포에는 FACS buffer만 100 µL 첨가하고, 펠렛화한 후 FACS buffer로 두 번 세척합니다.

세포를 1 mL의 act 버퍼에 재부유시킨 후, 얼음 위에서 1분 동안 배양합니다. 적혈구를 용해하려면 세포 펠렛을 생성하고 fax 버퍼로 세척한 뒤, 세포를 1 mL의 fax 버퍼에 재부유시킵니다. 일반적으로 405, 488 및 633 nm 여기 레이저와 5~10개의 형광 방출 검출기가 장착된 유세포 분석기로 샘플을 분석합니다.

조조(Crude) 프리온이 포함된 감염된 뇌 균질액에는 프리온이 매우 풍부하게 농축되어 있습니다. 정제 과정에는 E2 엘크 뇌 균질액의 계면활성제 처리, 가용화 및 초원심분리가 포함됩니다. 그 생성물은 프로테아제입니다.

특정 세포군에 대한 K 저항성 팩스 분석 결과, 항원 제시 세포가 2시간 만에 복강으로 이동하며 형광 비드와 프리온 로드를 보유하고 있음이 확인되었습니다. 비드와 프리온이 접종된 마우스의 세포에서는 특히 단핵구, 수지상 세포 및 대식세포에서 유의미한 형광이 나타났습니다.

PreOn을 함유한 단핵구, 수지상 세포 및 대식세포가 종격동 림프절에서도 발견되었습니다. 접종 2시간 후, 구강 또는 장간막 림프절에서는 비드나 PreOn 막대형 입자가 검출되지 않았습니다. 본 실험의 영상에서는 복강 내 주사를 위해 감염된 뇌에서 응집된 프리온 막대형 입자를 정제하는 여러 프로토콜과 림프절을 정확하게 식별 및 분리하는 방법, 그리고 최종적으로 면역 세포를 분리하고 염색하는 방법을 시연하였습니다.