Name: 모터 신경 세포의 이점 패치 클램프 레코딩과 Zebrafish의 대상 골격근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 배우세요 제브라피시 유충에서 척수 운동신경세포와 표적 골격근의 동시 패치 클램프 기록법을 통해 신경근 접합부의 시냅스 전달을 연구하는 방법을. 이 기술은 운동 조절 메커니즘 이해에 필수적입니다.

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1. 이점 레코딩을위한 물고기의 준비 <ol><li> 이전 절차를 시작하기 위해 포함 5 가지 주요 솔루션을 준비 : 목욕 솔루션, Tricaine (MS222), 포름 아미드, 신경 세포 내부 솔루션과 근육 내부 솔루션과 함께 목욕 솔루션 목욕 솔루션입니다. </li><li> 다음 72-96시간 세에서 Tricaine 욕조 솔루션의 장소 사이에 하나의 애벌레 zebrafish를 수집합니다. 마취에 노출 1 분 이내에 물고기 연락에 응답하지 않습니다. </li><li> 플라스틱 접시 위에 생선을 놓고, stereomicroscope를 사용하여, 더블 에지 면도날로 목을 베다. </li><li> sylgard와 코팅과 목욕 솔루션 가득한 유리 녹음 챔버에 생선을 전송합니다. notochord 통해 electrolytically 날카롭게 텅스텐 핀을 삽입하여 각 끝에 고정. </li><li> 좋은 포셉 한 켤레에 대한 적절한 그립을 제공할 것입니다 핀과 함께 물고기의 주동이의 끝 근처에 피부 플랩을 만듭니다. 좋은 포셉 한 쌍의와 주동이의 핀 근처 재밌하여 overlying 피부를 제거합니다. 서서히 꼬리 방향으로 껍질 피부를 제거합니다. </li><li> 녹음에 방해가있을 근육의 수축을 차단하는 3~5분에 대한 포름 아미드 욕조 솔루션 3 MLS와 생선을 취급. 일반 목욕 ​​솔루션 5 번 씻으십시오. 부드럽게 텅스텐 핀의 측면과 scrapping하여 5-6 세그먼트를 통해 근육의 표면 층의 일부를 제거합니다. </li><li> 전기 노이즈를 차폐하는 패러데이 케이지에 수직 현미경으로 생선을 전송합니다. 현미경은 오래 4X 거리에 40x 목적과 0.5의 확대 노력, 고정 무대를 갖추고 있습니다. 현미경은 높은 전력에 따라 신경 및 근육 사이의 준비를 이동하기 위해 전동 XY 번역 무대에 장착할 수 있습니다. 미분 간섭 대비 광학의 사용은 뉴런을 시각화하는 데 도움이됩니다. </li><li> 0.5 X 줌에서 overlying 근육을 제거하고 척수를 노출하기 위해 넓은 구멍 15 미크론 피펫을 사용합니다. 부정적인 압력이 3 CC 일회용 주사기와 근육 세포를 통해 적용됩니다 하나씩 제거됩니다. 이 절차는 골격근의 5-6 등의 세그먼트에 대해 반복됩니다. 같은 넓은 구멍 피펫도 대상 빠른 골격 근육을 얻기 위해 복부 근육의 상위 두 레이어를 제거하는 데 사용됩니다. </li><li> 이것은 이점 레코딩을위한 준비를 완료하고 현미경 줌 약 1.6x로 증가합니다. </li></ol> 2. 이점 캡 모터 신경 세포의 레코딩 및 대상 근육 세포 <ol><li> 청소 세그먼트는 캡 뉴런의 위치를​​ 스캔합니다. 척수의 각 헤미 세그먼트는 하나의 대형, 10 미크론의 직경, 캡 모터 신경 세포가 포함되어 있습니다. 이 티어드롭 모양 소마는 segmental 경계의 꼬리 가장 끝 부분에서 척수 두라 아래에 피상적으로 위치하고 있습니다. 캡 신경 세포는 녹음 선택하고 인접 꼬리 부분에서 복부 대상 근육은 무결성을 확인하는 검사입니다. </li><li> 두 패치 전극 녹음, 신경 세포 하나는 근육에 대한 잠깐 위치하고 있습니다. 상부 전극은 힘든 척추 두라 있으며, 약 2 미크론의 팁 오프닝의 침투에 대한 얕은 테이퍼가 있습니다. 낮은 전극은 골격근의 낮은 저항 전압 클램프 녹음 험한 테이퍼가 </li><li> 척추 두라에 침투 약 30 도의 각도에 신경 전극을 위치에 대한 하나를 선택 캡 신경 세포에 주동이의 반 세그먼트. 약 60mm의 수은의 부드러운 지속적으로 긍정적인 압력을 적용하는 동안 축 드라이브 조작하는 사람을 사용하여 전극 사전. 전극이 두라을 통해 나누기로 캡틴 신경 세포는 초점의 구획 정리가 필요 전극에서 재관류에 의해 갑작스런 수 있습니다. </li><li> 전극이 접촉하면 총액 신경 소마 긍정적인 압력이 출시와 gigaohm의 인감 즉각적인 형성에 일반적으로 결과입니다. 그러나, 봉인이 양식에 실패 경우에, 그것은 부드러운 부정적인 압력을 적용하는 데 필요한됩니다. 인감 형성 후, 전극 전위는 - 80mV로 조정하고 부정적인 압력의 응용 프로그램은 세포막을 파열이다. 캡 신경 세포가 140-180 메가 ohms의 입력 저항 및 행동 잠재력 해당 overshoots 40 millivolts이 특징입니다. 이것은 실천 가능성이 elicited 때까지 현재의 클램프 아래 depolarizing 단계를 점진적으로 증가 주사에 의해 테스트됩니다. </li><li> 다음 현미경은 높은 전력에서 XY 전동 번역기를 사용하여 복부 근육에 이전됩니다. 빠른 근육 세포는 대상 필드에서 선택됩니다. </li><li> 근육 전극이 출시되면, gigaohm 도장을 형성하고 긍정적인 압력을 받고 대상 근육 세포, 방향 고급입니다. 전극 전위는 나트륨 채널을 inactivate로 -50 millivolts 조정하고 부드러운 형편에서 세포막이 파열됩니다. 100-200 메가 ohms으로 저항하고 큰 용량성 과도 신호 항목의 갑작스런 등장에 놓습니다. </li><li> 테스트하려면실천 가능성이 elicited 때까지 이점 녹화, 모터 신경 전류가 점진적으로 큰 주사에 의해 depolarized 있습니다. 이 시점에서 endplate 전류는 근​​육에 elicited해야합니다. 실패없이 endplate 전류 1 헤르츠 결과를 motorneuron의 지속적인 자극. 자극 주파수 100 헤르츠로 증가로 endplate 흐름은 진폭의 변동 자극을 10 초 이내에 기능을 고갈을 받고있다. </li></ol> 3. 대표 결과 일반적으로 신경 세포의 녹화는 최대 한 시간 동안 안정하지만 근육 세포는 같은 직렬 저항의 증가로 반영 저하. 이 문제가 발생하면 실험 중 종료 또는 다른 근육 세포는 패치가 고정되어 있습니다. 모든 녹음 한 시간 이내에 완료해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2351/2351fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. motorneuron 작업의 가능성 (AP, TOP)과 전류 관련된 근육 endplate (EPC, 하단)의 레코딩. 캡 신경 세포에 대한 행동 잠재력은 오버 슈트 40 뮤직 비디오와 EPC는 1 밀리초 이하 일정한 시간 지수 시간 코스를 따라 300 μsec과 부패 이내 상승해야한다. <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 조리법 </td></tr><tr><td> 바스 솔루션 (MM)을 </td><td> 134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 10 포도당, 10 나 - HEPES, pH를 7.8 </td></tr><tr><td> Tricaine 욕조 솔루션 </td><td> 0.02 % tricaine을 포함 바스 솔루션 </td></tr><tr><td> 포름 아미드 욕조 솔루션 </td><td> 2M 포름 아미드를 포함하는 바스 솔루션 </td></tr><tr><td> 신경 세포 내부 솔루션 (MM)을 </td><td> 115 K - 글루 콘 산, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES 5 K - EGTA, 4 MG - ATP, pH를 7.2 </td></tr><tr><td> 근육 내부 솔루션 (MM)을 </td><td> 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, 산도 7.4 </td></tr></tbody></table> 표 1. 솔루션을 제공합니다.

<ol><li>Fetcho, J. R., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+networks+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal networks in behaving animals.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).</li>
<li>Fetcho, J. R., S, H. igashijima <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+and+genetic+approaches+toward+understanding+neuronal+circuits+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish.</a> Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).</li>
<li>Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethering+naturally+occurring+peptide+toxins+for+cell+autonomous+modulation+of+ion+channels+and+receptors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo.</a> Neuron. 43, 305-311 (2004).</li>
<li>Li, W., Ono, F., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurements+of+presynaptic+release+in+mutant+zebrafish+lacking+postsynaptic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors.</a> J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).</li>
<li>Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+receptors+direct+rapsyn+clusters+to+the+neuromuscular+synapse+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish.</a> J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralytic+zebrafish+lacking+ACh+receptors+fail+to+localize+rapsyn+clusters+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse.</a> J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+motility+mutant+twitch+once+reveals+new+roles+for+rapsyn+in+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function.</a> J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).</li>
<li>Wang, M., Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+neuromuscular+synapses+in+the+zebrafish+choline-acetyltransferase+mutant+bajan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan.</a> J Neurophysiol. , 100-104 (2008).</li>
<li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+motor-neuron+muscle+recordings+in+zebrafish+test+the+receptor+blockade+model+for+shaping+synaptic+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current.</a> J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 주로 고주파 자극하는 동안 소포 자료 및 재활용의 과정을 연구 zebrafish 이점 레코딩 (웬과 브렘, 2005)를 사용하고 있습니다. 이 과정은 주요 구성 요소는 시냅스에 의한 포인트 돌연변이로 생긴 전형적인 시냅스 전달이 궁극적으로 운동성의 돌연변이에 방해됩니다. 예를 들어, postsynaptic 수용체 집계 (오노 외., 2001, 2002, 2004)와 presynaptic 송신기의 합성 (왕 외., 2008) 취소 조정 수영의 결과를 방해 변이. 이점 녹음 따라서 행동, 유전학 및 생리학을 연결하는 기능 결함의 원인을 정확히 파악할 수있는 정보를 제공합니다. 이제 더 사려 분별이있는 발기인을 사용하여 캡 모터 뉴런에 과도 표현에 의해 시냅스 전송을 기본 프로세스를 해부하다 수 있어야한다. 이런 방식으로 지배적인 부정적 또는 변이된 유전자가 특별히 이러한 뉴런의 표현과 모두 행동 및 electrophysiological 결과는 결정 수 있습니다. 전체 세포 구성에 의해 제공되는 추가적인 장점은 잠재적으로 이러한 clostridial 독소와 칼슘 버퍼로 소포 재활용을 변경할 수 에이전트와 캡 소마의 투석 수 있습니다. 소마와 근육 사이의 짧은 거리로 인해 보급이 레코딩의 시간 프레임 내에 잘 발생한다. 이 준비의 가능성은 도청으로 시작했습니다. 시냅스의 연령과 표면 위치에있는 물고기의 투명성은 또한 광학 도구의 사용 (; Fetcho와 히가시 2004 Fetcho와 오말리, 1997)을 용이하게합니다. 우리는 FM 염료와 같은 Synaptophluorin (리튬 외., 2003)로 유전자 지표를 사용하여 생활 생선에 엔도와 exocytosis의 측정에서 매우 성공적으로되었습니다. 또한, 형광 복합 독소가 활어 (아이 바네즈 - 탈론 외., 2004)의 이미징을위한 시냅스 단백질을 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 이 준비의 단순 감안할 때 그것은 미래의 학습에 큰 약속을 보유하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>공압 트랜스듀서 테스터</td><td>Fluke Biomedical</td><td>DPM1B</td><td></td></tr><tr><td>0.002 x 3 inch 텅스텐 로드</td><td>A-M Systems</td><td>715000</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 엘라스토머</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>도포 두께가 DIC 광학계에 영향을 줍니다</td></tr></tbody></table>

모터 신경 세포의 이점 패치 클램프 레코딩과 zebrafish의 대상 골격근

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

애벌레 zebrafish는 척수 모터 신경 세포와 근육 대상에서 동시 패치 클램프 녹음을 허용하는 최초의 척추 모델 시스템을 나타냅니다. 이 두 세포 유형과 시각 형태 및 위치에 기초하여 단일 segmental 캡 모터 신경 세포를 구별하는 능력에 접근의 직접적인 결과이다. 이 동영상은 캡 모터 신경 세포와 목표 근육 세포뿐 아니라 각 세포 유형에서 레코딩을위한 방법론을 식별하는 데 사용되는 미세한 방법을 보여줍니다. 캡 모터 신경 세포 유형의 식별은 염료의 작성에 의해 또는 행동 잠재력 파형과 셀 입력 저항으로 biophysical 기능에 의해 확인됩니다. 일시간 여러 다른 대상 근육 세포에서 장기적인 레코딩을 허용에 대한 일상적으로 마지막으로 모터 신경 세포의 녹음. 모터 신경 세포의 발사 패턴을 통해 컨트롤 신경근육학 교차점에서 시냅스 전달의 주파수 의존의 측정이 가능합니다. 대형 quantal 크기 및 전체 셀 전압 클램프가 제공하는 낮은 잡음 때문에, 하나의 이벤트가 모든 근육에서 해결하실 수 있습니다. 이 기능은 릴리스 속성, 소포 재활용뿐만 아니라 우울증과 신경 촉진 등의 기본적인 시냅스 속성의 연구를 수 있습니다. 모터 뉴런은 보통 세포 전극에 의해 자극된 상태네 궁극적 생체내 준비 이클립스 이전 신경근육학 모델 시스템이 제공하는 장점은 연구와 근육이 전체 세포 패치 클램프에 비해 너무 큽니다. zebrafish 준비는 유전자 변형 라인, morpholino의 최저, 약리 개입 및 생체내 이미징에 포함하는 방법의 다양한 electrophysiological 분석을 결합 의무가 있습니다. 이러한 접근 방식은, zebrafish의 돌연변이 라인에 의해 제공 신경근육학 질병 모델의 증가와 결합, 인간 신경근육학 질환의 새로운 이해 문을 엽니다.

애벌레 zebrafish는 척수 모터 신경 세포 및 대상 골격근에서 동시 패치 클램프 녹음을 허용하는 최초의 척추 모델 시스템을 나타냅니다. 이 동영상은 segmental 캡 모터 신경 세포와 목표 근육 세포뿐 아니라 각 세포 유형에서 레코딩을위한 방법론을 식별하는 데 사용되는 미세한 방법을 보여줍니다.

모터 신경 세포의 이점 패치 클램프 레코딩과 Zebrafish의 대상 골격근

제브라피시 치어는 척수 운동 뉴런과 표적 근육으로부터의 동시 패치 클램프 기록이 가능한 최초의 척추동물 모델 시스템입니다. ...

이 절차의 전체적인 목표는 운동 신경세포의 활동 전위와 표적 근육의 관련 시냅스 반응을 동시에 전기생리학적으로 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 물고기의 등 쪽 피부를 제거합니다. 절차의 두 번째 단계는 상위에 있는 모든 등쪽 근육 세포를 제거하여 척수를 노출시키는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 지근의 상층부를 제거하여 표적 속근을 노출시키는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 coddle 일차 뉴런 또는 캡 뉴런을 전류 고정(current clamp)하고 표적 골격근을 전압 고정(voltage clamp)하는 것입니다. 최종적으로, 운동 뉴런의 전류 고정과 표적 근육의 전압 고정을 동시에 수행함으로써 운동 뉴런의 활동 전위 발생과 연관된 근육 내 시냅스 반응을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.LaVar Super Fish는 쌍을 이룬 운동 뉴런과 골격근 기록을 용이하게 하는 여러 장점의 조합을 제공하며, 근육의 작은 크기는 효율적인 전압 고정(voltage clamp)을 가능하게 하고, 캡 운동 뉴런의 전형적인 특징은 손쉬운 식별과 접근을 가능하게 합니다. 이제 뉴런과 근육 모두에 패치 클램프(patch clamp)를 설정하는 데 필요한 절차를 단계별로 설명하겠습니다. 절차를 시작하기 전, Bath 용액, Trica가 포함된 bath 용액, IDE가 포함된 bath 용액, 뉴런 내부 용액 및 근육 내부 용액을 포함한 5가지 주요 용액을 준비하십시오.다음으로, 72~96시간 된 제브라피쉬 유어 한 마리를 채집하여 trica가 포함된 배스 용액(bath solution)에 넣습니다. 마취제에 노출된 후 1분 이내에 물고기가 반응하지 않게 됩니다. 물고기를 플라스틱 접시 위에 올리고 실체 현미경을 사용하여 양날 면도날로 머리를 제거합니다.물고기를 sard로 코팅하고 bass 용액으로 채운 유리 기록 챔버로 옮깁니다. 미세 핀셋으로 적절히 잡을 수 있도록 물고기의 주둥이 끝 부분 근처에 핀을 사용하여 피부 플랩을 만듭니다. 미세 핀셋으로 주둥이 쪽 핀 근처의 피부를 잡아 덮고 있는 피부를 제거합니다.피부 제거를 위해 꼬리 방향으로 천천히 벗겨냅니다. 기록을 방해할 수 있는 근육 수축을 차단하기 위해 form IDE가 포함된 bath solution 3 mL로 3~5분 동안 어류를 처리합니다. normal bath solution으로 5회 세척합니다.텅스텐 핀의 측면으로 살살 긁어내어 5~6개 마디에 걸친 근육의 표층 일부를 제거합니다. 전기적 노이즈를 차단하기 위해 패러데이 케이지 내부에 설치된 정립 현미경으로 물고기를 옮깁니다. 이 현미경에는 고정 스테이지, 장작동거리 40 x 대물렌즈 및 0.5에서 4배까지의 줌 기능이 갖춰져 있습니다.현미경은 전동 XY 이동 스테이지 위에 설치되어 있습니다. 고배율 상태에서 신경과 근육 사이로 표본을 이동시키기 위해, 미분 간섭 대비(DIC) 광학계를 사용하면 0.5배 줌 상태에서 뉴런을 시각화하는 데 도움이 됩니다. 구경이 넓은 15 micron 피펫을 사용하여 상단의 근육을 제거하고 척수를 노출시키십시오.3 cc 일회용 주사기를 통해 음압을 가하여 근육 세포를 하나씩 제거합니다. 이 과정을 골격근의 등쪽 분절 5~6개에 대해 반복합니다. 동일한 광구 파이펫을 사용하여 복측 근육의 상위 2개 층을 제거함으로써 표적 속근 섬유를 얻습니다.이로써 쌍 기록(paired recordings)을 위한 준비가 완료되었으며, 현미경 배율을 약 1.6 x로 높입니다. 캡 뉴런(cap neurons)의 위치를 찾기 위해 깨끗한 분절들을 스캔합니다. 척수의 각 HEMI 분절에는 지름 10 micron의 커다란 캡 운동 뉴런이 하나씩 포함되어 있습니다.이 눈물방울 모양의 세포체는 척수 Jira 아래 표면에 위치하며, 분절 경계의 가장 말단 부분 근처에 있습니다. 기록을 위해 캡 뉴런을 선택하고, 관련된 말단 분절의 복측 표적 근육 영역을 스캔하여 무결성을 확인합니다. 기록을 위해 두 개의 패치 전극을 배치하며, 하나는 뉴런용이고 두 번째는 근육용입니다.상부 전극은 단단한 척수 경막을 관통할 수 있도록 완만한 테이퍼 구조를 가지며, 팁 개구부는 약 2 µm입니다. 하부 전극은 골격근의 저저항 전압 클램프 기록을 위해 더 가파른 테이퍼 구조를 가집니다. 척수 경막을 관통시키기 위해 뉴런 전극을 약 30도 각도로 배치하십시오.선택한 캡 뉴런(cap neuron)에서 주둥이 쪽으로 약 0.5 세그먼트 떨어진 지점에서, 약 60 mmHg의 완만하고 지속적인 양압을 가하면서 축 방향 구동 조작기(axial drive manipulator)를 사용하여 전극을 전진시킵니다. 전극이 경막(dura)을 뚫을 때, 전극에서 나오는 관류액으로 인해 캡 뉴런이 밀려날 수 있으므로 초점 재조정이 필요할 수 있습니다. 전극이 캡 뉴런의 세포체(SOMA)에 닿으면 양압을 해제하며, 이는 일반적으로 즉각적인 기가 씰(giga seal) 형성으로 이어집니다.하지만 씰(seal)이 형성되지 않는 일부 경우에는 완만한 음압을 가해야 합니다. 씰이 형성된 후, 전극 전위를 -80 mV로 조정하고 음압을 가하면 세포막이 파열됩니다. 캡 뉴런(cap neuron)은 140~180 MΩ의 입력 저항과 +40 mV를 초과하는 활동 전위를 특징으로 합니다.전류 클램프 상태에서 활동 전위가 유도될 때까지 탈분극 단계를 점진적으로 증가시키며 주입하여 이를 테스트합니다. 다음으로, XY 전동 이동 장치를 사용하여 현미경을 복측 근육으로 이동시킵니다. 고배율 상태에서 대상 시야로부터 속근 세포 하나를 선택합니다.양압 하에 근육 전극을 표적 근육 세포 방향으로 전진시킨 후, 압력을 해제하여 기가 씰(giga seal)을 형성합니다. 나트륨 채널을 비활성화하기 위해 전극 전위를 -50 mV로 조정합니다. 그 다음, 약한 흡입력을 가해 세포막을 파열시킵니다. 저항이 100~200 MΩ으로 떨어지고 커다란 정전 용량 과도 현상이 갑자기 나타나면, 패치 클램프 테스트를 위한 진입이 이루어진 것입니다.운동 뉴런을 기록하며, 활동 전위가 유도될 때까지 점진적으로 더 큰 전류를 주입하여 탈분극시킵니다. 이 시점에서 근육의 종판 전류가 유도되어야 하며, 운동 뉴런을 1 hertz로 계속 자극하면 실패 없이 종판 전류가 발생합니다. 자극 빈도를 100 hertz로 높이면, 종판 전류의 진폭이 변동하며 자극 시작 후 10 seconds 이내에 기능적 고갈이 일어납니다.일반적으로 뉴런 기록은 최대 1시간까지 안정적이지만, 근육 세포는 직렬 저항의 증가로 나타나는 것처럼 점차 퇴화합니다. 이러한 현상이 발생하면 실험을 종료하거나 다른 근육 세포를 패치 클램프합니다. 모든 기록은 1시간 이내에 완료되어야 합니다.한 쌍의 숙달이 완료되면, 녹화는 1시간에서 1시간 30분 이내에 끝낼 수 있습니다. 또한 인접한 분절에서 한두 쌍의 추가 쌍을 얻는 것도 가능합니다. 전형적인 하루 녹화 과정에서는 2~3쌍의 결과물을 얻게 됩니다.쌍을 이룬 운동 신경세포-골격근 기록은 신경근 전달의 근본적인 작동 원리를 탐구할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 이를 Motility 돌연변이 어류 라인과 함께 사용하면 신경근 기능 장애의 원인을 정확히 찾아낼 수 있으며, 전이 증후군과 같은 인간 질환의 기저 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

paired-patch-clamp-recordings-from-motor-neuron-target-skeletal

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상의 목적은 성인 zebrafish의 내부 귀 기관에서 건강 손상 세포를 획득하고 자신의 전압 개폐 채널의 biophysical 속성을 특성화하기위한 패치 클램프 연구를 위해 사용에 대한 절차를 설명하는 것입니다.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 Mauthner 뉴런 및 기타 망상 척수 세포의 전기적 특성을 연구하는 방법인 전체 세포 패치 클램프 전기생리학이라는 기술을 설명합니다.

Whole-Cell Patch Clamp 전기생리학: 뉴런의 전기적 특성을 연구하는 방법

이 비디오는 제브라피시 배아에서 운동 뉴런의 전기생리학을 연구하기 위한 비침습적 분석을 보여줍니다. 척수 운동 뉴런의 자발적인 탈분극의 결과로 배아에서 꼬리 코일링을 측정하면 코일링 빈도를 줄이기 위해 나트륨 채널 차단제가 적용됩니다. 다음으로, 배아를 아가로스에 고정시키고 형광 현미경 아래에 놓습니다. 유전자 조작 운동 뉴런은 공여체와 수용체 형광단이 있는 전압 감지 바이오센서를 발현합니다. 수용체 형광단 방출의 감소는 나트륨 채널 차단제로 인한 운동 뉴런의 자발적 탈분극(droppolarization)이 감소했음을 나타냅니다.

제브라피시 배아에서 운동 뉴런의 전기생리학을 연구하기 위한 비침습적 접근 방식

이 비디오는 마비된 제브라피시 유충에서 구심성 뉴런의 전기 신호를 측선 신경절 근처에 마이크로피펫을 배치하고 신호 캡처를 위해 느슨한 밀봉을 형성하여 기록하는 방법을 보여줍니다. 세포외 용액은 이 과정에서 신경 세포의 생존력을 유지합니다.

고정된 제브라피시 유충에서 구심성 뉴런의 전기 신호 모니터링

제브라 피쉬는 골격 근육의 인간의 질환을 모델링하는 새로운 시스템이다. 우리는 배아 및 유충의 제브라 피쉬에서 골격 근육의 근섬유를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 하나의 골격 근육 섬유 형태의 연구에 적합한 고밀도 근섬유 준비, 단백질 세포 내 현지화, 근육 생리를 얻을 수 있습니다.

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

우리는 zebrafish의 배아에서 MAUTHNER 뉴런과 다른 reticulospinal 세포 패치 클램프 녹음을 통해 전기적 활동을 기록하고 모니터링 할 수있는 그대로 뇌 - 척수 준비를 개발했습니다. 따라서, 우리는 배아의 주요 신경 세포에서 흥분성과 억제 성 시냅스 전류, 전압 문 채널 활동 및 활동 전위를 기록 할 수 있습니다.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

이 원고는 제브라 피쉬 배아 및 유충의 척수 신경 세포에서 전기 생리 녹음하는 방법을 설명합니다. 준비는 현장에서 뉴런을 유지하고 자주 최소 절개를 포함한다. 이 방법은 초기 애벌레 단계를 통해 초기 전기 흥분의 인수, 척추 신경의 다양한 전기 생리학 연구 할 수 있습니다.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

우리는 모델 척추 동물 머리 세포 시스템에서 모터 명령 중 발포성 뉴런 활동의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다.

얼룩말피에서 수영하는 동안 후방 측면 라인 발신 신경의 활동

본 프로토콜은 전기생리학적 연구에 적합한 성체, 청소년, 유충 및 배아 제브라피쉬(Danio rerio)로부터 생존가능한 심장 및 혈관 평활근 세포의 급성 단리를 기술한다.

전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년, 애벌레 및 배아 제브라 피쉬에서 심장 및 혈관 평활근 세포 분리

광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

제브라피시 유충 신경근 접합부(jebrafish larval neuromuscular junction)는 시냅스 생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 전기 생리학 및 광학 이미징을 포함한 많은 실험 기술에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 정립 형광 현미경 하에서 pHluorin 기반 프로브를 사용하여 시냅스 전달을 이미징하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

배우세요 제브라피시 유충에서 척수 운동신경세포와 표적 골격근의 동시 패치 클램프 기록법을 통해 신경근 접합부의 시냅스 전달을 연구하는 방법을. 이 기술은 운동 조절 메커니즘 이해에 필수적입니다.

모터 신경 세포의 이점 패치 클램프 레코딩과 Zebrafish의 대상 골격근

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