모터 신경 세포의 이점 패치 클램프 레코딩과 Zebrafish의 대상 골격근

이 절차의 전체적인 목표는 운동 신경세포의 활동 전위와 표적 근육의 관련 시냅스 반응을 동시에 전기생리학적으로 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 물고기의 등 쪽 피부를 제거합니다. 절차의 두 번째 단계는 상위에 있는 모든 등쪽 근육 세포를 제거하여 척수를 노출시키는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 지근의 상층부를 제거하여 표적 속근을 노출시키는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 coddle 일차 뉴런 또는 캡 뉴런을 전류 고정(current clamp)하고 표적 골격근을 전압 고정(voltage clamp)하는 것입니다. 최종적으로, 운동 뉴런의 전류 고정과 표적 근육의 전압 고정을 동시에 수행함으로써 운동 뉴런의 활동 전위 발생과 연관된 근육 내 시냅스 반응을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

LaVar Super Fish는 쌍을 이룬 운동 뉴런과 골격근 기록을 용이하게 하는 여러 장점의 조합을 제공하며, 근육의 작은 크기는 효율적인 전압 고정(voltage clamp)을 가능하게 하고, 캡 운동 뉴런의 전형적인 특징은 손쉬운 식별과 접근을 가능하게 합니다. 이제 뉴런과 근육 모두에 패치 클램프(patch clamp)를 설정하는 데 필요한 절차를 단계별로 설명하겠습니다. 절차를 시작하기 전, Bath 용액, Trica가 포함된 bath 용액, IDE가 포함된 bath 용액, 뉴런 내부 용액 및 근육 내부 용액을 포함한 5가지 주요 용액을 준비하십시오.

다음으로, 72~96시간 된 제브라피쉬 유어 한 마리를 채집하여 trica가 포함된 배스 용액(bath solution)에 넣습니다. 마취제에 노출된 후 1분 이내에 물고기가 반응하지 않게 됩니다. 물고기를 플라스틱 접시 위에 올리고 실체 현미경을 사용하여 양날 면도날로 머리를 제거합니다.

물고기를 sard로 코팅하고 bass 용액으로 채운 유리 기록 챔버로 옮깁니다. 미세 핀셋으로 적절히 잡을 수 있도록 물고기의 주둥이 끝 부분 근처에 핀을 사용하여 피부 플랩을 만듭니다. 미세 핀셋으로 주둥이 쪽 핀 근처의 피부를 잡아 덮고 있는 피부를 제거합니다.

피부 제거를 위해 꼬리 방향으로 천천히 벗겨냅니다. 기록을 방해할 수 있는 근육 수축을 차단하기 위해 form IDE가 포함된 bath solution 3 mL로 3~5분 동안 어류를 처리합니다. normal bath solution으로 5회 세척합니다.

텅스텐 핀의 측면으로 살살 긁어내어 5~6개 마디에 걸친 근육의 표층 일부를 제거합니다. 전기적 노이즈를 차단하기 위해 패러데이 케이지 내부에 설치된 정립 현미경으로 물고기를 옮깁니다. 이 현미경에는 고정 스테이지, 장작동거리 40 x 대물렌즈 및 0.5에서 4배까지의 줌 기능이 갖춰져 있습니다.

현미경은 전동 XY 이동 스테이지 위에 설치되어 있습니다. 고배율 상태에서 신경과 근육 사이로 표본을 이동시키기 위해, 미분 간섭 대비(DIC) 광학계를 사용하면 0.5배 줌 상태에서 뉴런을 시각화하는 데 도움이 됩니다. 구경이 넓은 15 micron 피펫을 사용하여 상단의 근육을 제거하고 척수를 노출시키십시오.

3 cc 일회용 주사기를 통해 음압을 가하여 근육 세포를 하나씩 제거합니다. 이 과정을 골격근의 등쪽 분절 5~6개에 대해 반복합니다. 동일한 광구 파이펫을 사용하여 복측 근육의 상위 2개 층을 제거함으로써 표적 속근 섬유를 얻습니다.

이로써 쌍 기록(paired recordings)을 위한 준비가 완료되었으며, 현미경 배율을 약 1.6 x로 높입니다. 캡 뉴런(cap neurons)의 위치를 찾기 위해 깨끗한 분절들을 스캔합니다. 척수의 각 HEMI 분절에는 지름 10 micron의 커다란 캡 운동 뉴런이 하나씩 포함되어 있습니다.

이 눈물방울 모양의 세포체는 척수 Jira 아래 표면에 위치하며, 분절 경계의 가장 말단 부분 근처에 있습니다. 기록을 위해 캡 뉴런을 선택하고, 관련된 말단 분절의 복측 표적 근육 영역을 스캔하여 무결성을 확인합니다. 기록을 위해 두 개의 패치 전극을 배치하며, 하나는 뉴런용이고 두 번째는 근육용입니다.

상부 전극은 단단한 척수 경막을 관통할 수 있도록 완만한 테이퍼 구조를 가지며, 팁 개구부는 약 2 µm입니다. 하부 전극은 골격근의 저저항 전압 클램프 기록을 위해 더 가파른 테이퍼 구조를 가집니다. 척수 경막을 관통시키기 위해 뉴런 전극을 약 30도 각도로 배치하십시오.

선택한 캡 뉴런(cap neuron)에서 주둥이 쪽으로 약 0.5 세그먼트 떨어진 지점에서, 약 60 mmHg의 완만하고 지속적인 양압을 가하면서 축 방향 구동 조작기(axial drive manipulator)를 사용하여 전극을 전진시킵니다. 전극이 경막(dura)을 뚫을 때, 전극에서 나오는 관류액으로 인해 캡 뉴런이 밀려날 수 있으므로 초점 재조정이 필요할 수 있습니다. 전극이 캡 뉴런의 세포체(SOMA)에 닿으면 양압을 해제하며, 이는 일반적으로 즉각적인 기가 씰(giga seal) 형성으로 이어집니다.

하지만 씰(seal)이 형성되지 않는 일부 경우에는 완만한 음압을 가해야 합니다. 씰이 형성된 후, 전극 전위를 -80 mV로 조정하고 음압을 가하면 세포막이 파열됩니다. 캡 뉴런(cap neuron)은 140~180 MΩ의 입력 저항과 +40 mV를 초과하는 활동 전위를 특징으로 합니다.

전류 클램프 상태에서 활동 전위가 유도될 때까지 탈분극 단계를 점진적으로 증가시키며 주입하여 이를 테스트합니다. 다음으로, XY 전동 이동 장치를 사용하여 현미경을 복측 근육으로 이동시킵니다. 고배율 상태에서 대상 시야로부터 속근 세포 하나를 선택합니다.

양압 하에 근육 전극을 표적 근육 세포 방향으로 전진시킨 후, 압력을 해제하여 기가 씰(giga seal)을 형성합니다. 나트륨 채널을 비활성화하기 위해 전극 전위를 -50 mV로 조정합니다. 그 다음, 약한 흡입력을 가해 세포막을 파열시킵니다. 저항이 100~200 MΩ으로 떨어지고 커다란 정전 용량 과도 현상이 갑자기 나타나면, 패치 클램프 테스트를 위한 진입이 이루어진 것입니다.

운동 뉴런을 기록하며, 활동 전위가 유도될 때까지 점진적으로 더 큰 전류를 주입하여 탈분극시킵니다. 이 시점에서 근육의 종판 전류가 유도되어야 하며, 운동 뉴런을 1 hertz로 계속 자극하면 실패 없이 종판 전류가 발생합니다. 자극 빈도를 100 hertz로 높이면, 종판 전류의 진폭이 변동하며 자극 시작 후 10 seconds 이내에 기능적 고갈이 일어납니다.

일반적으로 뉴런 기록은 최대 1시간까지 안정적이지만, 근육 세포는 직렬 저항의 증가로 나타나는 것처럼 점차 퇴화합니다. 이러한 현상이 발생하면 실험을 종료하거나 다른 근육 세포를 패치 클램프합니다. 모든 기록은 1시간 이내에 완료되어야 합니다.

한 쌍의 숙달이 완료되면, 녹화는 1시간에서 1시간 30분 이내에 끝낼 수 있습니다. 또한 인접한 분절에서 한두 쌍의 추가 쌍을 얻는 것도 가능합니다. 전형적인 하루 녹화 과정에서는 2~3쌍의 결과물을 얻게 됩니다.

쌍을 이룬 운동 신경세포-골격근 기록은 신경근 전달의 근본적인 작동 원리를 탐구할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 이를 Motility 돌연변이 어류 라인과 함께 사용하면 신경근 기능 장애의 원인을 정확히 찾아낼 수 있으며, 전이 증후군과 같은 인간 질환의 기저 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.