Name: 생체내 및 아답터 - clathrin 상호 작용의 체외 연구에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: 학습하세요 클라트린 매개 세포내이입에서 Sla1p 어댑터 단백질과 클라트린의 상호작용을 생체내 영상 분석 및 체외 풀다운 분석을 통해 연구하는 방법을. 이 기법은 막 수송 메커니즘 이해에 필수적입니다.

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DF는 박사 교제에 NSF 교량에 의해 지원됩니다. 이 작품에 사용되는 현미경은 콜로라도 주립 대학에서 현미경 이미징 네트워크 코어 인프라 부여에 의해 부분적으로 지원됩니다. 저자의 실험실에서 clathrin 어댑터에 대한 작업은 CSU 시작 자금과 SD로 미국 심장 협회 상을 09SDG2280525 지원합니다

1. SLA1 유전자에 GFP 태그와 선택 마커의 설립 SLA1 유전자 오픈 읽기 프레임의 3 '끝 (Sla1p는 C - 말단)에 직접 GFP 태그를 융합하고 동시에 E.있는 유전자를 표시하기 위해 Longtine 방법 17 적용 G418의 선택을 허용 대장균 관 R 유전자. <ol><li> 템플릿으로 플라스미드 pFA6a - GFP (S65T) kanMX6 18 다음 primers를 사용하여 PCR하여 DNA의 조각을 생성 : 앞으로, 5' - CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG ATT TTA AA - 3 '및 역방향, 5' - CA 두드리는 AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC 문신 AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC CTC GTT TAA 개그 AC - 3. 밑줄 순서 SLA1 유전자 특정 세그먼트 바로 앞 (전방 프라이머)와 정지 코돈 (역방향 프라이머) 다음에 해당합니다. DNA 정화 뒤에 아가로 오스 겔 전기 영동하여 PCR 제품을 분리. </li><li> 50 ML 문화 S. 준비 cerevisiae SEY6210 변형 (MAΤα ura3 - 52, leu2 - 3, 112 his3 - Δ200, trp1 - Δ901, lys2 - 801, suc2 - Δ9 GAL - 멜) YPD에서 19, 초기 단계 로그 (OD 600 = 0.2-0.6)에서 성장. 2000 XG 3 분 상온에서 스핀, 살균 물로 두 번 씻어. </li><li> 리튬 아세테이트 절차 20을 사용하여 세포에 1 단계에서 얻은 PCR 조각을 변환. 1 ML YPD 30 4 H에 대한 품어 ° 통에 C를 추가, 1 ML 멸균 물을 세포를 씻으십시오. </li><li> 2-3 일동안은 30 ° C에서 품어 G418 방지 transformants에 대한 선택 YPD - G418 플레이트에있는 세포를 확산. YPD - G418 플레이트에 식민지과 탄력을 선택하십시오. </li><li> 를 사용하여 식민지를 PCR, GFP 관 모듈이 제대로 상동 재조합에 의해 SLA1 유전자 시퀀스와 통합어진 transformants를 확인합니다. 앞으로 프라이머를 사용하는 것이 SLA1 오픈 읽기 프레임과 반대되는 입문서 이내 anneals GFP 관 모듈 내부 anneals. PCR 제품 예상 크기를 가지고 시퀀싱에 의해 확인 식민지를 식별합니다. </li><li> 그들은 GFP의 형광을 확인하기 위해 형광 현미경에 의해 식민지를 화면. </li></ol> 2. SLA1 유전자의 변종 clathrin 상자 (VCB)의 돌연변이 <ol><li> 두 단계 접근 15 다음 SLA1 유전자 (세포핵 2407년부터 2415년까지)에 AAALQ 변이에 LLDLQ을 소개합니다. </li><li> 첫째, SLA1 세포핵 PCR에 의해 1207년에서 1410년까지 및 2427년에서 2589년까지를 증폭하고 각각 pBluescriptKS의 노티 / BamHI 및 EcoRI / 살리 사이트에 조각을 복제. </li><li> BamHI / EcoRI 사이트 URA3를 포함하는 PCR의 조각에 Subclone. </li><li> 클리브 노티 / 살리와 결과 플라스미드는 젤 정화하여 URA3 조각을 분리하고, 제 1 부, 또는 TVY614 (마타 ura3 - 52 leu2 - 3112 his3 - Δ200 trp1으로 생성된 Sla1 - GFP 스트레인에 리튬 아세테이트 변환하여 소개 - Δ901 lys2 - 801 suc2 - Δ9 pep4 : LEU2 prb1 : HISG prc1 : HIS3) 21. </li><li> 유라실이 부족해 보충 SD 접시에있는 세포를 확산. 식민지 - PCR에 의해 확인하고 우라 + 식민지 VCB 조각을 교체 제대로 통합 URA3을 포함 순서. </li><li> 두 번째 단계에서, subclone SLA1 세포핵 pBluescriptKS의 노티 / 살리 사이트에 1207년부터 2589년까지. 사용 QuickChange - XL 사이트 이동 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)을 AAALQ에 VCB 잔류물에게 LLDLQ을 변화시키다. 순서로 확인합니다. </li><li> 클리브 결과 BsgI / 아게로 구축하고, 젤 정화에 의해 조각을 포함하고있는 돌연변이 VCB을 분리. 부품 2.3에서 얻어진 변형에 pRS313 (HIS3) 22 BsgI / 아게 조각을 Cotransform. </li><li> 히스티딘이 부족해 보충 SD 접시에있는 세포를 확산. 돌연변이 시퀀스 재생에게 있으므로, AAALQ 변이 (sla1 AAA)에 LLDLQ 들어있는 sla1 유전자를 URA3을 대체하는 세포를 식별 5 fluorotic 산성을 포함하는 한천 배지에 복제 판 그의 + 식민지. 식민지 - PCR 및 시퀀싱에 의해 확인합니다. </li></ol> 3. 형광 현미경 <ol><li> OD 600 = 0.1-0.4에 도달 때까지 효모 변종 30에서 보충 SD 미디어 4 ML에 부품 1과 2 · 어둠의 회전에 C에서 생성된 Sla1 - GFP 및 sla1 AAA - GFP를 성장. 상온에서 1 분 4,000 XG에 microcentrifuge의 문화 1ml를 스핀. 뜨는의 ~ 950 μl를 폐기하십시오. 남은 액체 (~ 50 μl)에 세포를 Resuspend. </li><li> 보증금 3 현미경 슬라이드에 세포 현탁액의 μl와 유리 coverslip로 커버. 빛의에서 샘플을 보호합니다. </li><li> 마운트 회전하는 디스크 공촛점 - 현미경의 100x 기름 침지 목표에 슬라이드. </li><li> GFP의 형광을 자극하고 감지하기 위해 적절한 필터 브라이트 조명 또는 488 nm의 레이저를 사용하여 세포의 정확한 초점 비행기를 찾습니다. </li><li> 500 MS의 노출 시간 (또는 적절한 값)와 세포 Sla1 - GFP 및 sla1 AAA - GFP의 시간 경과 이미지를 캡처1백50초에 대한 초당 하나의 이미지의 N 간격. 예상 결과 : 신호가 빨리 사라로 GFP 표시 punctae은 세포의 세포막을 제한하는 내부 표면에 나타나는 몇 초 동안 유지하고, 세포의 중앙쪽으로 이동합니다 (해체 코트를 나타내는). </li><li> 반점이 나타 몇 초 동안 유지하고, 사라질 볼 수있는 이미지의 부분을 선택합니다. 시간 경과 영상의 각 프레임에 이미지의이 섹션을 자르기. </li><li> 경과 시간에 해당하는 축을 따라 프레임을 정렬하여 150초 시간 경과 이미지의 각 프레임에있는 이미지의이 섹션을 나타내는 kymograph를 생성합니다. </li><li> (시간 경과 프레임) 명소 kymograph에 존재하는 몇 초에 따라 각 지점의 기간을 계산합니다. 각각의 장소 그것이 코트의 endocytosis와 해체를 반영, 사라와 같이 세포의 내부 향해 "곡선"해야합니다. </li><li> sla1 AAA - GFP와 야생 타입 Sla1 - GFP를 비교합니다. 결과는 통계적으로 의미가 있는지 확인하기 위해 반복합니다. 예상 결과 : sla1 AAA - GFP 명소가 코트 형성 15 결함을 나타내는 야생 유형 (~ 30 초) 이상 (~ 80 초) 이상 크게 유지됩니다. </li></ol> 4. 효모 추출물 cytosolic와 전체 세포 추출물의 준비 <ol><li> 같은 TVY614 21로 적절한 효모 변형과 YPD 3 리터를 예방하고, 30 성장 OD 600 = 1-2 도달 때까지 쉐이크 인큐베이터에서 ° C. </li><li> 3,700 X g에서 20 분 상온에서 효모 문화를 원심 분리기. 뜨는을 취소, 멸균 물 3-5 ML을 추가하고 펠렛 완전히 resuspended 때까지 최대 피펫 아래로. </li><li> 250 ML의 플라스틱 비이커에 액체 질소 ~ 150 ML 하거라. 플래시 동결 냉동 알약의 응집을 방지하기 위해 원형 모양의 액체 질소로 dropwise을 추가하여 효모합니다. 필요한 경우 더 많은 액체 질소를 추가 알약의 해동을하게하지 마십시오. </li><li> 거기에 액체 질소를 따르고하여 스테인레스 믹서 컨테이너를 풀어. 액체 질소는 거의 완전히 증발 수 있습니다. 추위 믹서 컨테이너에 냉동 효모 알약을 추가합니다. 감기에 고무 마개와 함께 믹서 컨테이너를 닫고 10 초 동안 효모 알약을 갈아서. 내용을 섞어 두 번 연삭 단계를 반복 컨테이너 3-4 회 반전. 지면 냉동 누룩은 가루 같은 모양을 가지고 있습니다. </li><li> 액체 질소와 퍼널 및 50 ML 원뿔 튜브를 풀어. 추위 깔때기를 사용하여 튜브에 지상 효모를 전송할 수 있습니다. 언 땅에 효모는 -80 ° C 또는 즉시 사용에 저장할 수 있습니다. </li><li> GST - 융합 단백질 선호도 분석 (5 부), 중량 냉동 지상의 3g 15 ML 원뿔 튜브 TVY614 효모와 실온 버퍼 3 ML에 resuspend위한 cytosolic 추출물을 얻으려면 (10 MM의 HEPES, 산도 7.0, 150 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM DTT)는 테아제 억제제 칵테일 (시그마)를 포함. </li><li> 뚜껑과 관에게 완전히 해동 후 얼음에 넣어 때까지 여러 번 반전. </li><li> 4 추출물을 초원 심 분리기 ° 300000 20 분 C X G. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 원뿔 관에 뜨는 (cytosolic 추출)을 전송합니다. 얼음 cytosolic 추출물 보관하십시오. </li><li> 그것은 구슬을 pipeting 촉진하기 위해 끝의 끝을 잘라 편리 버퍼 A에서 50 % (V / V) 글루타티온 - 세파 로스 슬러리 100 μl를 추가합니다. 4 회전 ° C는 15 분, 4 원심 분리하여 비즈 스핀 다운 ° 2 천 XG에 분, 그리고 새로운 튜브에 뜨는 (cytosolic 추출)을 전송을위한 C. 입력 컨트롤에 대한 추출물의 지역 50 μl. </li><li> 공동 immunoprecipitation 실험에 대한 전체 세포 추출물을 (6 부) 얻으려면, 스트레인 TVY614 (WT SLA1) TVY614 배경으로 제 2 부에서 생성된 AAALQ 변이에 LLDLQ를 들고 sla1 AAA 변형, 그리고의 삭제를 들고 sla1 변형을 사용하여 GPY3130 23 같은 SLA1 유전자. 무게 두 원뿔 튜브에 해당 언 땅에 효모의 g와 실온 버퍼 2 ML에서 그들을 resuspend, 테아제 억제제 칵테일 (시그마)와 2% 트리톤 X - 100을 포함하는. </li><li> 캡 완전히 해동 후 주기적으로 역전에 의해 혼합 10 분 얼음 부화까지 튜브를 여러 번 반전. </li><li> 4 microcentrifuge 튜브와 스핀에 자료를 전송 ° C 16,000 XG (microcentrifuge에서 최고 속도)에서 15 분. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 얼음에 원뿔 관에 뜨는 (총 세포 추출물)를 전송합니다. </li><li> 4 회전 버퍼 A에서 50 % (V / V) 단백질 A - 세파 로스 슬러리 100 μl를 추가 ° 스핀 다운 15 분에 대한 C, 4 원심 분리하여 비즈 ° 1000 XG 2 분 C 및 전송 뜨는 (총 추출) 신선한 튜브 수 있습니다. 입력 컨트롤에 대한 추출물의 지역 50 μl. </li></ol> 5. GST - 융합 단백질 선호도 분석 <ol><li> PCR 조각 containi로 확대NG Sla1p 변종 clathrin - 박스 (VCB) (잔류물 803-807)는 pGEX - 5 배 - VCB를 얻을 pGEX - 5 배로 복제. 순서로 확인합니다. </li><li> 템플릿으로 pGEX - 5 배 - VCB를 사용하고 QuickChange - XL의 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)를 사이트 - 감독, pGEX - 5 배 - vCBmut를 얻을 AAALQ하는 VCB 잔류물 LLDLQ을 변화시키다. 순서로 확인합니다. </li><li> 익스프레스 GST 융합 단백질과 GST - VCB와 E.의 GST - vCBmut 대장균 (BL21 DE3)가 감소 글루타티온와 비즈에서 글루타티온 - 세파 로스, elute를 사용하여 정화, PBS에 대한 dialyze 및 단백질 농도를 결정합니다. </li><li> 라벨 3 microcentrifuge 튜브 : GST, GST - VCB 및 GST - vCBmut하고, PBS 1 ML, 버퍼에 50 % (V / V) 글루타티온 - 세파 로스 슬러리의 30 μl dialized GST, GST의 A, 50 μg을 추가 - VCB 또는 GST - vCBmut의 융합 단백질. </li><li> 바인딩 수 있도록 30 분 상온에서 회전. </li><li> 4 부에 설명된대로 준비 - - 각 튜브에 효모 추출물 cytosolic 1 ML 추가 버퍼 A.있는 비즈에게 PBS로 2 회, 1 시간을 씻으십시오. </li><li> , 5,000 펠렛 비즈에 XG에서 튜브에게 4 1 H ° C, 스핀 10 초 회전 뜨는 폐기하고, 신속하게 버퍼 A.와 버퍼와 비즈에게이 포함된 0.1 % 트리톤 X - 100, 1 시간을 3 회 씻어 </li><li> 한 시간과 젤 로딩 팁을 사용하여 가능한 한 많은 액체로 제거 비즈를 스핀 다운. 이 시점에서 샘플은 나중에 계속 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> ° C 5 분 96에 품어 각 튜브에 2X Laemmli 샘플 버퍼 15 μl를 추가하고, X G. 5000 10 초 스핀 </li><li> clathrin 중쇄하는 항체를 사용하여 immunoblotting하여 샘플을 분석할 수 있습니다. 예상 결과 : clathrin는하지만 GST 또는 GST - vCBmut에 GST - VCB에 바인딩합니다. 또한 샘플은 GST 융합 단백질의 유사한 로딩을 확인하기 SDS - PAGE로 분석합니다. </li></ol> 6. 공동 immunoprecipitation 분석 <ol><li> 라벨 3 microcentrifuge 튜브 : WT (야생 유형 SLA1), sla1 AAA, 그리고 sla1Δ, 그리고 PBS 1 ML, 버퍼에 A - 세파 로스 슬러리 50 % (V / V)는 단백질 30 μl의 A, 2 μg을 추가 토끼 반대 Sla1p 항체. </li><li> 30 분 상온에서 회전. </li><li> 버퍼 포함 1퍼센트 트리톤 X - 100 PBS 1 시간 두 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> SLA1, sla1 AAA 및 sla1Δ : 제 4 준비한 해당 총 효모 추출물 1 ML을 추가합니다. 4 1 H ° C. 회전 </li><li> 스핀 10 초 5,000에서 펠릿 비즈에 XG 뜨는 폐기하고, 신속하게 버퍼와 비즈에게 3 번 씻어 포함 0.1 % 트리톤 X - 100과 버퍼 A. 1 시간 </li><li> 한 시간과 젤 로딩 팁을 사용하여 가능한 한 많은 액체로 제거 비즈를 스핀 다운. 이 시점에서 샘플은 나중에 계속 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> ° C 5 분 96에 품어 각 튜브에 2X Laemmli 샘플 버퍼 15 μl를 추가하고, X G. 5000 10 초 스핀 </li><li> clathrin 중쇄하는 항체를 사용하여 immunoblotting하여 샘플을 분석할 수 있습니다. 예상 결과 : clathrin sla1 AAA 또는 sla1Δ 샘플에서와 싶었지만 야생 유형 Sla1p와 함께 공동 - immunoprecipitates. </li></ol> 7. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 라이브 세포 형광 현미경에 의해 endocytic 사이트에서 Sla1p clathrin 어댑터의 분석. Sla1 - GFP 또는 AAALQ 변이에 LLDLQ를 들고 sla1 AAA - GFP를 표현하는 효모 세포의 비디오와 해당 kymographs (오른쪽)에서 하나의 프레임 (왼쪽). 야생 유형과 Sla1 - GFP 돌연변이 모두 내생 SLA1 로커스에서 표현되었다. Endocytic 사이트는 세포 주변 (왼쪽 이미지) 배포 밝은 반점으로 관찰됩니다. 화이트 라인 사이의 지역 kymographs가 생성된하는 지역에 해당합니다. 영화는 1 프레임 / 초의 프레임 속도로 촬영했다. 야생 유형 (SLA1)에 비해 AAALQ 돌연변이 (sla1 AAA)에 LLDLQ에 Sla1 - GFP의 긴 수명을 확인합니다. <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. clathrin 및 Sla1p - 변형 clathrin 상자 사이의 물리적 상호 작용. GST는 글루타티온 - 세파 로스 구슬로 묶인에서 야생 cytosolic 추출물과 함께 incubated 있던 순서 LLDLQ (GST - VCB), 해당 AAALQ 돌연변이 (GST - vCBmut) 또는 GST 혼자 (GST)를 포함하는 조각 aa798 - 813을 Sla1p하는 융합 유형 효모 세포. 관련 단백질은 clathrin 중쇄에 대한 (IB) immunoblotting에 의해 eluted하고 분석했다.

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<li>Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+sorting+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+isolation+of+mutants+defective+in+the+delivery+and+processing+of+multiple+vacuolar+hydrolases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases.</a> Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li>
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<li>Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Clathrin - 코팅 vesicles (CCV)는 트랜스 잠돌군 Zz 네트워크에서 endocytosis 및 수송에 참여하고, 진핵 세포 생물에 근본 아르 보존 경로를 endosomes. 이 방법은 종이에 설명된 접근 어댑터 단백질과 clathrin 사이에 특히 상호 작용에 CCV 형성에 책임이있는 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용합니다. GST - 융합 단백질의 선호도와 공동 immunoprecipitation의 assays는 어댑터 (후보)와 clathrin 사이의 물리적인 연관 테스트 수 있습니다. GFP - 태그와 형광 현미경 이미징 살 세포의 역동적인 연구를 허용합니다. 특히 효모 세포 따라서 태그 / 변이된 단백질의 정상적인 표현 규제를 유지하는 어댑터 내생 유전자 태그와 변이를 도입하기 쉬운 유전자 조작의 장점을 제공합니다. 마찬가지로, CCV의 clathrin 또는 기타 구성 요소는 살아있는 세포를 16 듀얼 이미징 연구를 촉진하기 위해 RFP 또는 다른 형광 단백질로 태그를...

<table border="1"><th> 자료 </th><th> 회사 </th><tbody><tr><td> QuickChange - XL 사이트 이동 돌연변이 유발 키트 </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> 프로 테아제 억제제 칵테일 </td><td> 시그마 </td></tr></tbody></table>

생체내 및 아답터 - clathrin 상호 작용의 체외 연구에서

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

주요 endocytic 통로가 세포 표면부터 수송화물 1-6 endosomes 것을 clathrin - 코팅 vesicles (CCVs)의 형성과 함께 시작합니다. CCVs는 clathrin되는 외투 소포 막의 polyhedral 격자에 의해 구별하고 기계 발판 역할을하고 있습니다. Clathrin 코팅은 개별 clathrin triskelia 세 무거운 세 가벼운 체인 7,8 subunits로 구성된 clathrin의 수용성 형태의 소포 형성하는 동안 조립하고 있습니다. triskelion 직접 멤브레인에 바인딩하는 기능이 없기 때문에, clathrin 바인딩 어댑터 lipids 및 / 또는 멤브레인 단백질 9 협회를 통해 막으로 형성 clathrin 격자를 연결하기 위해 중요하다. Adaptors 또한 패키지 transmembrane 단백질과 같은 수용체와 같은화물, 그리고 서로와 CCV 형성 기계 9 다른 구성 요소와 상호 작용할 수 있습니다. 스물 이상 clathrin 어댑터는 설명했습니다 몇 가지는 clathrin 매개 endocytosis에 관여하고 다른 사람들은 트랜스 잠돌군 Zz 네트워크에 집중하거나 9 endosomes. HIP1R (효모 Sla2p)를 제외하고, 모든 알려진 clathrin 어댑터 clathrin 중쇄 9 N - 터미널 - 프로펠러 도메인에 바인딩합니다. Clathrin 어댑터는 구조화되지 않은 유연한 linkers로 연결되어 접힌 도메인으로 구성된 모듈형 단백질입니다. 이 링커 지역 내에서 짧은 바인딩 모티프는 clathrin N - 말단 도메인이나 소포 형성 기계 9 다른 구성 요소와 상호 작용을 중재. 별개의 두 clathrin 결합 모티프가 정의되었다 : clathrin - 상자와 W - 박스 9. 합의 clathrin 박스 순서는 원래로 정의했습니다 L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 그러나 변종이 이후 11 발견되었습니다. W - 박스 시퀀스 PWxxW (여기서 x는 모든 찌꺼기가 어디)에 부합. Sla1p는 (굴지 바인딩 단백질 1 합성 치명적인) 원래 굴지 관련 단백질로 식별 및 효모 세포 12 endocytic 사이트에서 정상적인 굴지의 cytoskeleton의 구조와 역학에 대한 필요했습니다. Sla1p 또한 NPFxD endocytic 정렬 신호를 바인딩하고 NPFxD 신호 13,14 베어링화물의 endocytosis를 위해 중요합니다. 최근 Sla1p는 clathrin 상자 LLDLQ과 비슷한 모티프를 통해 clathrin 바인딩하는 시연 되었음 변종 clathrin - 박스 (VCB)라고합니다, 그리고 endocytic clathrin 어댑터 15 기능. 또한, Sla1p 라이브 세포 형광 현미경 연구 16 endocytic 코트에 널리 사용되는 마커되고 있습니다. 여기 어댑터 clathrin 상호 작용 연구를위한 방법을 설명하는 모델로 Sla1p를 사용합니다. 우리가 사는 세포 형광 현미경에 초점을 아래로 GST - 끌어와 공동 immunoprecipitation 방법.

Clathrin - 중재 endocytosis는 화물선 선택과 clathrin 코트 어셈블리를 조정 어댑터 단백질에 따라 달라집니다. 우리가 모델로 효모 endocytic 어댑터 단백질 Sla1p를 사용하여 어댑터 clathrin 물리적 상호 작용과 라이브 셀 이미징 방법을 연구하는 절차를 설명합니다.

주요 내포 작용 경로(endocytic pathway)는 세포 표면에서 엔도솜(endosome)으로 화물을 운송하는 클라트린 피복 소포(clathrin-coated vesicles, CCVs)의 형성으로 시작됩니다1-6. CCV는...

클라트린 매개 세포내섭취 과정에서 클라트린의 다면체 격자는 AP-2와 같은 클라트린 결합 어댑터 단백질을 통해 막 단백질 또는 지질과 연결됩니다. AP-2는 변이 클라트린 박스(variant clathrin box, VCB)를 통해 클라트린과 결합합니다. 이 영상에서는 클라트린-AP-2 상호작용 분석을 위해 세 가지 방법이 사용됩니다. 먼저, GFP 태그가 붙은 야생형 및 VCB 변이체 AP-2를 발현하는 효모 세포를 회전 디스크 공초점 현미경으로 관찰합니다.그 후 타임랩스 영상을 분석하여 돌연변이가 엔도사이토시스(endocytosis)의 역학에 미치는 영향을 결정합니다. 둘째, 클라트린(clathrin)의 공급원으로 사용하기 위해 야생형 세포로부터 효모 세포질 추출물을 준비하고, G-S-T-V-C-B 융합 단백질 풀다운 분석(pull down assay)을 수행하여 인비트로(in vitro)에서 클라트린과 VCB의 상호작용을 조사합니다. 셋째, 천연 VCB 및 VCB 돌연변이를 발현하는 효모 세포로부터 총 추출물을 준비합니다.SLA one 및 coun 침전 반응을 수행하여 in vivo에서 SLA one의 clathrin 결합 친화도에 미치는 유효 돌연변이의 영향을 조사합니다. 최종적으로, 얻어진 데이터는 VCB의 돌연변이가 endocytosis를 지연시키며 SLA one과 clathrin의 결합이 소실됨을 보여줍니다. 이러한 돌연변이체들에서, 이 방법은 endocytosis 과정 중 clathrin 어댑터의 역동성에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.이 방법은 분비 경로 내 소포 내부의 다른 단백질-단백질 상호작용에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 내인성 유전자 자리에서 태그된 단백질의 발현량이 적을 때 광퇴색이 형광 신호를 감소시킬 수 있어 이 방법의 적용이 어려울 것으로 알려져 왔습니다. 본 프로토콜은 이미지 분석과 물리적 상호작용에 대한 생화학적 연구를 결합하므로, 내포 작용을 조절하는 메커니즘을 연구하는 데 매우 강력한 접근 방식이 됩니다. 내포 작용 중 clathrin 어댑터 상호작용을 연구하기 위해, clathrin 어댑터 단백질인 SL one의 야생형 및 돌연변이 버전에 GFP 태그를 발현하는 효모 균주를 생성합니다. 먼저, 상동 재조합을 통해 SL one의 C-말단에 GFP 태그를 추가합니다.다음으로, 특정 SL one 플랭킹 서열(flanking sequences)을 포함하고 RA three

in-vivo-and-in-vitro-studies-of-adaptor-clathrin-interaction

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연구

JoVE Journal

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생물학

세포 투과 crosslinker DSP [dithiobis - (succinimidyl 프로피 온산)] 일시적 안정화와 불안 정한 상호...

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

Bimolecular 형광 Complementation

낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR), 상피 염화물 채널, 각종 단백질과 상호 작용하고 중요한 세포 과정을 조절하는 것으로보고되었습니다; 그들 가운데 CFTR PDZ 모티프-매개 상호 작용이 잘 문서화되었습니다. 이 프로토콜은 우리가 복잡한 신호 PDZ-의존 CFTR의 macromolecular를 조립하기 위해 개발된 방법을...

PDZ-의존 CFTR의 Macromolecular 신호 단지의 체외 분석

관할 transmembrane 수용체를 신호 소설의 식별을위한 높은 콘텐츠를 심사 방법은 설명되어 있습니다. 이 방법은 대규모 자동화 의무가 있으며, 수에 대한...

표현 복제가 Grb2 신호 복합 단지를 공부하기 위해 높은 콘텐츠 이미징 워크 플로우

Clathrin-mediated endocytosis는 빠르고 매우 역동적인 과정으로 신호 수용체를 포함한 많은 단백질을 내부화합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 내포세포 이벤트의 동역학을 직접 시각화합니다. 이는 내포세포 기전의 핵심 구성원이 서로 어떻게 협력하는지, 그리고 단백질 화물이 이 과정에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 필수적입니다.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

세포 내 저장소에서 Ca2+ 방출을 매개하는 호모-테트라머 이온 채널인 리아노딘 수용체의 올리고머화는 골격근 및 심장 근육 수축에 중요합니다. 여기에서는 단백질 자가 결합을 감지하고 호모올리고머 화학량론을 결정하기 위한 상호 보완적인 in vivo 및 in vitro 방법을 제시합니다.

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

여기, 우리는 고정 된 세포에서 소포체와 미토콘드리아의 내생 적 상호 작용을 시각화하고 고감도로 정량화 할 수있는 절차를 설명합니다. 프로토콜은이 미토콘드리아 관련 막 계면에서 이노시톨에게 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 / 혈당 조절 단백질 75 / 전압 가변 음이온 채널 / 시클로 필린의 D 복합체 타겟팅 시츄 근접 결찰 분석법 최적화 기능.

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

초기 endosome 함수 F 말라 합에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 설명 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 반응의 복잡 한 시리즈가 생화학 및 유전 의무가 렌더링 조작입니다.

생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합

여기에 제시된 전자 현미경 검사법과 함께 네이티브 세포막 나노입자 시스템을 활용하는 멤브레인 단백질의 올리고메황 상태의 측정을 위한 프로토콜이 여기에 제시된다.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

이 프로토콜은 관심 단백질에 융합된 비오틴 리가아제에 대한 근접성을 기반으로 단백질에 비오틴의 생체 내 공유 결합 방법을 제시합니다. 이 변형을 통해 단백질 상호작용 연구에서 필요에 따라 스트렙타비딘 비드를 사용하여 단백질을 선택적으로 농축할 수 있습니다.

생체 내 Paramecium tetraurelia의 단백질 상호 작용 연구를 위한 근접 비오티닐화

학습하세요 클라트린 매개 세포내이입에서 Sla1p 어댑터 단백질과 클라트린의 상호작용을 생체내 영상 분석 및 체외 풀다운 분석을 통해 연구하는 방법을. 이 기법은 막 수송 메커니즘 이해에 필수적입니다.

생체내 및 아답터 - clathrin 상호 작용의 체외 연구에서

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