Name: 옥내 핵산 - 수정 Oligonucleotides에 의해 Transfection 및 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 학습하세요 올리고뉴클레오티드를 이용한 Anopheles 모기 세포의 표적 유전자 돌연변이 유발 방법을. 트랜스펙션과 유전자 전환 빈도 측정을 통해 정밀한 유전자 편집 기술을 익히세요.

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우리는 유동세포계측법 그녀 도움 캘리포니아 국립 메이트 연구 센터에서 애비 스피너 감사하고 싶습니다. 이 연구는 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (NIAID) 보건 국립 연구소 (NIH) AI073745, AI080799 및 AI078183의 기금에 의해 지원되었다.

<ol><li> 이전 프로토콜을 시작하기 위해서는 실험에 사용되는 모기 세포가 건강하고 ~ 80 %의 합류에서 자기편 경우 (그림 1). 것을 확인하는 것이 중요합니다 자란하거나 건강하지 못한 세포는 낮은 transfection 효율의 결과하고 일관성 결과를 줄 것이다. </li><li> 30 분 28 ° C의 물을 욕조에 사용하기 전에 모든 미디어를 따뜻하게. <ol class="lalpha"><li> 멤, 얼의 W / 글루타민 5 % 열 inactivated FCS, 0.2 % D - 글루코오스, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신의 항생제,, 1 %가 아닌 - 필수 아미노산 : A. stephensi MSQ43 세포 E5 매체를 필요로합니다. </li><li> 슈나이더의 Drosophila 중간 5 % 열 inactivated FCS,, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신의 항생제 : A. gambiae SUA5B 전지는 S2 매체를 필요로 </li></ol></li><li> 해동 얼음의 모든 transfection 시약 재료, plasmids, 그리고 oligonucleotides를 저장합니다. </li><li> 모든 절차는 무균 기술을 사용하여 조직 문화 후드에서 수행되어야합니다. </li><li> 자기편 세포 (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) 세포를 방해하지 않고 이전 미디어를 대기음 들어, 28 예열되어 신선한 미디어의 상당 볼륨을 추가 ° C 다음의 맨 아래에서 세포를 씻어 내 버리지 피펫을 사용하여 플라스크. </li><li> 세포의 농도는 결정과 1x10 6 세포 / ML의 최종 농도 조정해야합니다. transfection 시약 자료를 준비하는 동안 세포는 상온에서 보관하실 수 있습니다. </li><li> 6 잘 플레이트의 각 잘하는 모기 세포 (1x10 6 셀 / ML) 1 ML을 추가합니다. 각 실험 조건 (아래 참조)에 대한 번호판을 설정합니다. 표 나는 일반적인 transfection을위한 pipetting 방식입니다. 표 II는 BFP 특정 LNA 기능을 사용하여 단일 염기의 돌연변이 유발에 대한 성공적인 테스트 다섯 조건을 설명합니다. 첫 번째 두 pGFP 및 pBFP은 각각 양극과 음극을 제어합니다. 나머지는 BFP 특정 LNA 기능의 증가 농도와 pBFPs의 실험 조건입니다. 12 단계 8 각 상황에 따라 시약의 적절한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 플라스미드 DNA를 전송 및 EC 버퍼의 적절한 볼륨을 추가합니다. <ol class="lalpha"><li> 1 μL 플라스미드 DNA (1 μg / μL)의 경우, EC 버퍼 99 μL를 추가합니다. </li><li> 1 μL pGFP (μL / 1μg)의 경우, EC 버퍼 99 μL를 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP (μL / 1μg)의 경우, EC 버퍼 99 μL를 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP (μL / 1μg) 및 1 μL (μg / μL)의 경우, EC 버퍼의 98 μL를 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP (μL / 1μg) 및 5 μL (μL / 1μg)의 경우, EC 버퍼의 94 μL를 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP (μL / 1μg)와 10 μL (μL / 1μg)의 경우, EC 버퍼 89 μL를 추가합니다. </li></ol></li><li> 그런 다음 천천히 사용되는 DNA 1 μg 당 향상제를 추가합니다. <ol class="lalpha"><li> 1 μL 플라스미드 DNA의 경우, 8 μL 향상제를 추가합니다. </li><li> 1 μL pGFP 들어, 8 μL 향상제를 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP 들어, 8 μL 향상제를 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP 1 μL의 경우, 16 μL 향상제를 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP 5 μL의 경우, 48 μL 향상제를 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP 10 μL 들어, 88 μL 향상제를 추가합니다. </li></ol></li><li> 1 초과 솔루션의 모든 튜브의 맨 아래에 있는지 확인을 위해 소용돌이 DNA / 버퍼 / 확장기는 혼합물. 그렇다면 5 분 실온에서 품어. </li><li> 10 초 1 μg 플라스미드 DNA와 와동 당 Effectene 시약을 추가합니다. 솔루션의 모든 10 분 상온에서 부화 후 튜브의 하단에하고 있는지 확인합니다. <ol class="lalpha"><li> 1 μL 플라스미드 DNA를 10 μL Effectene를 (표 I) 추가합니다. </li><li> 1 μL pGFP 들어, 10 μL Effectene를 (표 II) 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP 들어, 10 μL Effectene를 (표 II) 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP 1 μL의 경우, 20 μL Effectene (표 II)를 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP 5 μL의 경우, 60 μL Effectene를 (표 II) 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP 10 μL의 경우, 110 μL Effectene를 (표 II) 추가합니다. </li></ol></li><li> DNA / 버퍼 / 확장기 / Effectene 혼합물에 dropwise 예열 미디어를 추가하여 1000 μL의 최종 볼륨 각 튜브를 가져와. 미디어가 너무 신속하게 추가하면 DNA 수있다는이 시점에서 침전물. 부드럽게 3-4 회를 아래와 pipetting하여 섞는다. <ol class="lalpha"><li> 1 μL 플라스미드 DNA 들어, 882 μL 미디어 (표 I) 추가합니다. </li><li> 1 μL pGFP 들어, 882 μL의 미디어 (표 II)를 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP 들어, 882 μL의 미디어 (표 II)를 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP 1 μL 들어, 864 μL 미디어 (표 II)를 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP 5 μL 들어, 792 μL 미디어 (표 II)를 추가합니다. </li><li> 1 μL pBFP 10 μL 들어, 702 μL 미디어 (표 II)를 추가합니다. </li></ol></li><li> 다음 천천히 잘 각 한 번에 한 방울에 해당하는 DNA / 확장기 / Effectene 혼합 1 ML를 추가합니다. </li><li> 소용돌이는 플레이트 부드럽게 세포 transfection 혼합물의 균일한 분배를 보장합니다. Incubat정상적인 성장 조건에서 전자 세포. </li><li> 어느날 transfection 후 부드럽게 미디어를 대기음 천천히 신선한 예열 미디어의 상당 볼륨 바꿉니다. 이렇게하면 우물의 하단에있는 세포 레이어를 방해하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> transfection 후 이틀 transfection 효율 (그림 2)를 확인하기 위해 형광 현미경 pGFP와 transfected 긍정적인 제어 세포를 검사합니다. </li><li> SUA5B 전지는 매우 빠르게 성장하고 우거져 될 것입니다. 나흘 기존의 미디어를 aspirating 갓 예열 미디어 천천히 상응하는 볼륨을 추가하여 transfection 얇은 이러한 세포 후에. </li><li> 우물에 새로운 미디어를 추가하면 최대 pipeting하여 각 우물의 바닥에서 모든 세포를 분리하고 아래로, 세포의 혼합물의 절반 볼륨 (1 ML)를 버리고 2 최종 볼륨을 가지고 신선한 예열 미디어 1 ML을 추가 ML. </li><li> 필요한 얇은, 그들은 건강하고 자란되지 않도록 매일 세포를 확인하십시오. </li><li> 세포 분석을 수집하기 전에 5~7일 게시물 transfection을위한 정상적인 조건에서 성장을 허용합니다. </li><li> 5~7일 게시물 transfection에서 모든 우물에서 이전 미디어를 aspirating 각 잘하는 살균 방 온도 PBS 1 ML을 추가하여 세포를 수집합니다. </li><li> 그리고 아래로 pipetting하여 우물의 바닥에서 세포를 분리 5 ML 스냅 캡 튜브에 세포 혼합물을 전송하고 즉시 유동세포계측법를 통해 세포를 분석할 수 있습니다. </li></ol> 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Untransfected 건강한 A. stephensi MSQ43 (A)와 A. 약 80 %에 합류 gambiae SUA5B (B) 세포. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. A. stephensi MSQ43 (A)와 A. gambiae SUA5B (B) 세포가 플라스미드을 표현하는 긍정적인 제어와 GFP transfected. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. BFP 특정 잠금 핵산 - 수정 oligonucleotides (LNA 기능)과 단일 염기 다음 transfection의 돌연변이 유발을 통해 GFP에 BFP의 전환을 확인 유동세포계측법 데이터입니다. SUA5B 세포는 대조군으로 (pBFP) 플라스미드를 표현 BFP와 긍정적인 제어로 플라스미드를 표현 GFP (pGFP)와 transfected 또는 pBFP 및 BFP 특정 LNA 기능의 증가 농도로했다. 왼쪽에서 오른쪽으로 표시 유동세포계측법 데이터 (A) 게이팅 전략 : 라이브 세포, propidium 요오드화물의 (PI) 부정적인 세포와 transfection 다음 GFP 양성 세포 5 일간의 기대 대 측면 산란. (B) GFP 양성 세포의 비율의 그래프는 pBFP와 LNA 기능의 증가와 함께 농도 (A) 다음과 transfection에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table1.jpg" alt="표 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 1"> 표 I. Transfection의 조건. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table2.jpg" alt="표 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 2"> 표 II. 그림 1에서 사용되는 Transfection 조건.

<ol><li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid+%28LNA%29%3A+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li>
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<li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li>
<li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기 A.로 LNA 기능의 transfection 다음 episomal 유전자 대상에서 단일 염기의 목표 전환에 대한 체외 방법 및 증거를 제공 stephensi 및 A. gambiae 세포. LNA - ON - 중재 유전자 변환은 사이트 특정 DNA 수리 대응의 유도가 필요합니다, 우리의 데이터는 모기 세포가 특정 사이트 돌연변이 유발이 메커니즘을 지원할 수 있음을 나타냅니다. 방법 여기서 제시가 episomal 대상의 변환에 기반하지만, 우리의 데이터는 다른 시스템에서 왔습니다으로 LNA - ON - 중재 전환이 모기 세포의 염색체 목표에 대해 최적화할 수 있습니다하는 것이 좋습니다. 유전자 변환 따라서 복잡한 프로토콜 및 장기 약물 선택 정권없이 안정적으로 변형 모기 세포 라인의 생성을 촉진합니다. 또한, 기존 기술의 사용에 따라 mRNA 특정 살 세포에 형광 태그가 5-7 생물 학적 연구에 대한 변환 염색체 유전자의 목표...

<table><tbody><tr><td>Effectene transfection 시약</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>GFP 대조 플라스미드 (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td><td>Invitrogen</td><td>K4935-00</td><td></td></tr><tr><td>BFP 플라스미드 (pcDNA5/FRT/TO)</td><td></td><td></td><td>Concordet 박사의 기증품&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>LNA-ONs </td><td></td><td></td><td>Concordet 박사의 기증품&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>MEM, Earle&amp;rsquo;글루타민 함유 s</td><td>Invitrogen</td><td>11095</td><td></td></tr><tr><td>우태아혈청 (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>슈나이더&amp;rsquo;s &lt;전자현미경&gt;초파리&lt;/em&gt; 배지</td><td>Invitrogen</td><td>11730</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>10% D-글루코스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 항생제</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

옥내 핵산 - 수정 oligonucleotides에 의해 transfection 및 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium의 기생충, 말라리아의 원인이되는 대리인은 만 250 새로운 감염이 매년 발생하는 감염 아노 펠 레스 모기의 물린 통해 전송됩니다. 연구의 수십에도 불구하고, 말라리아에 대한 백신도 새로운 제어 전략의 필요성을 강조 아직 없습니다. 한 혁신적인 접근은 효과적으로 말라리아 기생충 전송을 제어하는​​ 유전자 조작 모기를 사용하는 것입니다. 대상 돌연변이 유발을 통해 모기의 세포 신호 전달 경로의 고의적인 변경은, 기생충 개발 1 조절 발견되었습니다. 이러한 연구에서, 우리는 변화를위한 잠재적인 유전자 목표를 식별하기 시작할 수 있습니다. 타겟 돌연변이 유발은 전통적으로 대상 유전자와 대형 DNA 분자 사이의 동종 재조합에 의존하고 있습니다. 그러나, 안정적으로 변형 세포 라인의 생성 등 복잡한 DNA 분자의 건설 및 사용은 비용, 시간 소요 종종 비효율적이다. 따라서, 고정 핵산 - 수정 oligonucleotides (LNA 기능)을 사용하여 전략 episomal 및 염색체 DNA의 유전자 타겟 (2 검토)에 인공 단일 염기 대체를 소개하는 유용한 대안을 제공합니다. LNA - ON - 중재 대상으로 돌연변이 유발은 효모와 생쥐 3,4 모두 교양 세포에 대한 관심의 유전자에 변이 점을 소개하기 위해 사용되었습니다. 우리는 LNA 기능이 아노 펠 레스 gambiae과 아노 펠 레스 stephensi 세포 모두에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 표현에 파란색 형광 단백질 (BFP) 표현에서 스위치로 이어지는 transfected episomal 대상에서 하나의 염기 변화를 소개하는 데 사용할 수있는 것을 여기에 표시 . 이 변환은 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발 효과가 LNA 기능에 의해 중재이 기술은 체외에서 생체내의 염색체 돌연변이 유발 타겟에 적용 될 수있는 제안이 될 수 있다고 처음으로 보여줍니다.

Oligonucleotides은 특히 모두 transfected 대상 유전자의 단일 염기 대체 사이트로 사용할 수 있습니다<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt;과<em&gt; 아노 펠 레스 stephensi</em&gt; 세포.

옥내 핵산 - 수정 Oligonucleotides에 의해 Transfection 및 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발

말라리아의 원인균인 Plasmodium 기생충은 감염된 Anopheles 모기의 물림을 통해 전파되며, 이로 인해 매년 2억 5천만 명 이상의 신규...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 anomaly 모기 세포에서 부위 특이적 돌연변이 유발을 위한 새로운 전략을 입증하는 것입니다. 이를 위해 먼저 형질전환을 위한 건강한 배양 세포를 준비합니다. 그 후 형질전환 시약을 첨가하여 적절한 대조군 및 실험군 DNA를 세포에 형질전환 시킵니다.다음 절차 단계는 대조군 세포의 형광을 모니터링하고 실험군 세포의 밀도를 낮추는 것입니다. 마지막으로, 형질전환 5~7일 후에 유세포 분석법을 사용하여 실험군 세포에서 유전자 전환 빈도를 결정할 수 있습니다. 궁극적으로, locked nucleic acid 올리고뉴클레오타이드 유도 DNA 복구를 통해 에피좀 유전자 표적의 부위 특이적 돌연변이 유발을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스 의생명 미생물학 및 면역학과의 Shirley Lockhart 박사 연구실 소속 Nazy Pacor 박사입니다. 오늘은 anomalies 모기 세포의 부위 특이적 돌연변이 유발을 위한 새로운 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 부위 특이적 돌연변이 유발을 통해 모기의 선천성 면역 반응 유전자의 기능을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.그럼 시작해 보겠습니다. 프로토콜을 시작하기 전, 건강하고 약 80%confluent 상태인 모기 세포를 준비하십시오. 세포가 부착되어 과성장했거나 건강하지 않은 상태라면 형질전환 효율이 낮아져 일관성 없는 결과가 나올 수 있습니다.이 프로토콜은 ananais Gambier SUA five B 세포를 사용하여 시연되었습니다. 하지만 Ananais ensi MS Q4 three 세포 또한 사용할 수 있습니다. S two 배지를 28 °C 항온수조에서 30분 동안 가온하여 transfection 준비를 시작하십시오.모든 transfection 시약, plasmid 및 oligonucleotide를 얼음 위에 둡니다. 조직 배양 후드 내에서 멸균 기술을 사용하여 세포가 흐트러지지 않게 기존 배지를 흡입하여 제거한 후, 동일한 부피의 가온된 신선한 배지를 넣어 플라스크 바닥의 세포를 헹굽니다. 피펫을 사용하여 세포 농도를 측정하고 최종 농도가 1 × 10⁶ cells/mL가 되도록 조정합니다.최종 농도가 조정되면, 6웰 플레이트의 각 웰에 모기 세포 1 mL를 첨가합니다. 형질전환 시약 재료를 준비하는 동안 세포는 상온에서 보관할 수 있으며, 형질전환 플라스미드 DNA를 멸균된 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 여기서는 녹색 형광 단백질 발현 플라스미드를 양성 대조군으로 사용하고, 청색 형광 단백질 발현 플라스미드를 음성 대조군으로 사용합니다.테스트 DNA에는 BFP 발현 플라스미드가 포함되어 있으며, BFP 특이적 locked nucleic acid 변형 올리고뉴클레오타이드 또는 LNA os의 농도를 점차 높여 구성합니다. DNA를 분주한 후, 플라스마 DNA 및 L-N-A-O-N 1 µg당 99 µL의 kage 및 EC 버퍼를 추가합니다. 그다지 DNA 1 µg당 8 µL의 enhancer를 천천히 첨가한 후, DNA 버퍼 enhancer 혼합물을 볼텍싱합니다.용액을 1초 동안 짧게 원심 분리한 후 샘플을 실온에서 5분 동안 배양하십시오. plasma DNA 1 µg당 10 µL의 영향 시약을 첨가하고 10초 동안 볼텍싱하십시오. 용액을 튜브 바닥으로 짧게 원심 분리한 다음 실온에서 10분 동안 배양하십시오. 배양 후, 따뜻하게 데운 신선한 배지를 DNA buffer enhancer 영향 혼합물에 천천히 첨가하여 각 튜브의 최종 부피를 1000 µL로 맞추십시오. 배지를 너무 빨리 첨가하면 이 시점에서 DNA가 침전될 수 있으므로, 피펫팅으로 3~4회 부드럽게 섞어주십시오.마지막으로, 각 세포 웰에 적절한 DNA 강화제 혼합물 1 mL를 천천히 첨가합니다. 한 방울씩 떨어뜨리십시오. 플레이트를 부드럽게 회전시켜 세포와 형질전환 혼합물이 균일하게 분포되도록 합니다.트랜스펙션 하루 후 세포를 일반적인 성장 조건에서 배양하고, 세포 위의 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거한 뒤 동일한 부피의 따뜻한 새 배지로 천천히 교체합니다. 이때 웰 바닥의 세포층이 손상되지 않도록 주의하십시오. 트랜스펙션 이틀 후, GFP 발현 플라스미드가 트랜스펙션된 양성 대조군 세포를 형광 현미경으로 관찰하여 트랜스펙션 효율을 결정합니다.transfection 후 4일째에 B 세포는 성장 속도가 매우 빨라 과성장할 수 있으므로, 다섯 개의 B 세포 웰을 희석해야 합니다. 이를 위해 세포 위의 오래된 배지를 흡입하여 제거하고, 동일한 부피의 따뜻한 신선 배지를 천천히 추가합니다. 웰에 새 배지를 추가한 후, 피펫팅을 통해 각 웰 바닥에서 모든 세포를 떼어내고, 세포 혼합물 부피의 절반을 버린 뒤 따뜻한 신선 배지 1 mL를 추가하여 최종 부피를 2 mL로 맞춥니다.세포가 건강한 상태인지, 과성장하지 않았는지 매일 확인하십시오. 필요에 따라 세포 밀도를 낮추어 줍니다. 형질전환 후, 분석을 위해 세포를 수집하기 전까지 5~7일 동안 일반 조건에서 세포를 배양하십시오.트랜스펙션 후 5~7일째에 세포 위의 오래된 배지를 흡입하여 제거하고, 각 웰에 실온의 멸균 PBS 1 mL를 첨가하여 세포를 수집합니다. 피펫팅을 통해 각 웰 바닥에서 세포를 떼어냅니다. 마지막으로, 세포 혼합물을 5 mL 스냅 캡 튜브로 옮긴 후 즉시 유세포 분석기로 세포를 분석합니다.방어 기전 확인. MS Q4 3 및 Gambier UA 5 B 세포에 양성 대조군인 GFP 발현 플라스미드를 형질전환하였습니다. 세포는 광학 및 형광 현미경 하에서 관찰되었으며, 병합된 이미지와 유세포 분석 데이터는 BFP 특이적 LNAONs 형질전환 후 단일 뉴클레오타이드 돌연변이화를 통해 BFP가 GFP로 전환되었음을 확인해 줍니다. UA 5 B 세포에 양성 대조군으로 GFP 발현 플라스미드를, 음성 대조군으로 BFP 발현 플라스미드를, 또는 BFP 발현 플라스미드와 함께 농도를 높인 BFP 특이적 LNAONs를 각각 형질전환하였습니다.유세포 분석 데이터의 게이팅 전략은 살아있는 세포, propidium iodide 음성 세포 및 형질전환 5일 후의 GFP 양성 세포의 전방 산란광 대비 측방 산란광을 보여줍니다. BFP 발현 플라스미드와 증가하는 농도의 LNAO NS로 형질전환한 후의 GFP 양성 세포 비율을 여기의 그래프 형태로 확인할 수 있으며, 이를 통해 L aos에 의한 BFP에서 GFP로의 전환을 확인할 수 있습니다. 지금까지 아노펠레스(anopheles) 모기 세포의 부위 특이적 돌연변이 유발을 위한 새로운 절차를 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 형질전환 전 세포가 건강한 상태인지와 적절한 밀도를 유지하고 있는지 확인하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기서 우리는 유충 섭취 RNA 나노 입자 / 키토산의 사용을 통해 질병 벡터 모기 유전자 기능을 억제 간섭하는 절차를 설명한다.

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

RNA interference (RNAi)는 유전자 기능을 밝히는 데 매우 유용한 도구입니다. 그러나 성체 이전 단계에서 RNAi를 사용하여 유전자를 표적으로 하는 능력은 주요 인간 말라리아 매개체인 Anopheles gambiae에서 제한됩니다. 번데기 발달 중 직접 주입을 통해 유전자 기능을 감소시키는 RNAi 프로토콜에 대해 설명합니다.

에 RNAi의 트리거 배달<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt; 번데기

우리는 비 결함 재조합 Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo에서 전달 시스템을 개발 하는 인공 intronic 작은 RNA 식 전략을 사용 하 여 보고 합니다. 건설, 포장, 및 애벌레 감염에 관해서는 뿐만 아니라 rAaeDV 벡터의 정량 분석에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다.

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구와 함께 작동하도록 최적화된 Culex quinquefasciatus 태아를 위한 미세 주입 절차를 기술합니다. 이 기술은 이 저학질병 벡터에 있는 유전 기술을 구축하는 데 사용될 수 있는 사이트 특정, 유전성, 생식선 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

CRISPR/Cas9는 비모델 유기체에서 유전자 기능을 특성화하는 데 점점 더 사용됩니다. 이 프로토콜은 주입 믹스 준비에서 모기 배아를 획득하고 주입하는 것뿐만 아니라 주입 된 모기와 원하는 돌연변이에 대한 자손을 후면, 교차 및 선별하는 방법에 이르기까지 Culex pipiens의녹아웃 라인을 생성하는 방법을 설명합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

이 양파르트 갈4-UAS 시스템은 Anopheles 감비아에서 기능성 유전 분석을 허용하는 제어된 스파티오 측량 방식으로 유전자 발현을 수정하기 위한 다목적 도구입니다. 이 시스템을 사용하기 위해 설명된 절차는 형광 단백질 마커 및 배아 고정을 위한 pupae의 반 표준화된 복제 전략, 섹스링 및 검열입니다.

Anopheles 감비아에서 기능 유전학을 위한 GAL4-UAS 시스템을 이용하십시오

이 프로토콜은 φC31 시스템을 사용하여 Anopheles 말라리아 모기의 게놈에서 사이트 지향적 인 수정을 달성하는 방법을 설명합니다. 설명된 수정은 attP 베어링 도킹 라인의 게놈에 있는 형질전환 카세트의 통합 그리고 교환둘 다 포함됩니다.

말라리아의 아노필스 벡터에서 사이트 지향 φC31 중재 통합 및 카세트 교환

여기에서 보고된 프로토콜은 실험실에 포함된 작은 케이지 예심에서 벡터 통제를 위한 유전으로 조작된 모기의 성능을 평가하는 세 가지 대안을 보여줍니다. 각 프로토콜은 모기 균주 곰 (유전자 드라이브 또는 비 유전자 드라이브)과 측정 된 매개 변수의 유형을 특정 수정에 맞게 조정됩니다.

유전자 조작 된 아노펠리인 모기의 작은 케이지 실험실 시험

이 문서에서는 CRISPR/Cas9에 의해 유도된 인델의 신속한 식별을 위한 프로토콜과 고해상도 용융 분석을 사용하여 모기 Aedes aegypti 의 돌연변이 라인을 선택하는 것에 대해 자세히 설명합니다.

모기 Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/ Cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출

세균에 의해 생산된 dsRNA의 경구 투여는, 예쁜꼬 마선충에서 일상적으로 사용되는 RNA 간섭(RNAi)에 대한 전달 방법으로서, 성인 모기에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 주사를 사용하지 않고도 강력한 역 유전학 연구 및 전송 차단 벡터 연구를 가능하게합니다.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

여기에서는 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 모기 A. aegypti 에서 배아 미세주입을 통한 게놈 편집을 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR-Cas9을 이용한 황열병 모기 이집트숲모기(Mosquito Aedes aegypti )의 게놈 편집

학습하세요 올리고뉴클레오티드를 이용한 Anopheles 모기 세포의 표적 유전자 돌연변이 유발 방법을. 트랜스펙션과 유전자 전환 빈도 측정을 통해 정밀한 유전자 편집 기술을 익히세요.

옥내 핵산 - 수정 Oligonucleotides에 의해 Transfection 및 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발

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