December 10th, 2010
파지 디스플레이 라이브러리는 대상 뼈되는 펩타이드 시퀀스를 식별하는 데 사용되었다. 목표는 mesenchymal 세포 분화에서 이러한 펩티드의 효과를 조사하고 뼈 재생에 대한 그들의 영향을 결정하는 것이었다.
이 실험의 전반적인 목표는 중간엽 세포 분화를 강화하고 뼈 복구를 촉진하는 염기서열을 식별하는 것입니다. 초기 단계는 뼈에 결합하는 파지를 바이옵(biop)으로 패닝하여 분리하는 것입니다. 중간엽 세포에 결합하는 펩타이드 염기서열을 확인하고 유전자 발현의 후속 변화를 결정합니다.
펩타이드 염기서열이 재생 목적으로 뼈에 어떻게 전달될 수 있는지 결정하기 위한 실험을 수행합니다. 마지막 단계로, 뼈 복구를 조직학적으로 조사하면 결과를 종합하여 체외 세포 분화 및 생체 내 뼈 복구 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 파지 디스플레이 라이브러리와 함께 바이옵 패닝 기법을 사용하면 뼈를 표적으로 하는 펩타이드를 식별할 수 있었고 중간엽 세포의 분화를 자극하고 뼈 복구를 강화하는 데 사용할 수
있다는 장점이 있습니다.궁극적으로, 이러한 펩타이드 염기서열은 뼈 복구 및 골감소증 및 골다공증과 같은 뼈 손실 치료를 위한 치료 방식에 유용할 수 있습니다. ULA와 Pascal이 혈관을 표적으로 하는 펩타이드 염기서열을 분리하는 데 바이옵 패닝을 사용할 수 있음을 보여준 연구를 기반으로 당사는 이 방법을 뼈의 쿼리 메커니즘에 적용하기로 결정했습니다. in vivo biop panning 절차의 경우, 10주 된 판막 C 마우스의 심장을 통해 N-E-B-P-H-D 12 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리의 10번째 플라크 수행 단위를 10배 10배로 관류했습니다.
약 5분 후 쥐를 안락사시키고 대퇴골을 노출 및 절개하고 끝을 자르고 골수를 제거합니다. PBS로 왼쪽 대퇴골 안팎을 10회 헹굽니다. 그런 다음 뼈를 ER 2 5 3 7 박테리아에 추가합니다.
결합되지 않은 파지를 제거하려면 21게이지 바늘이 있는 주사기에 2% 건조된 탈지유를 사용하여 오른쪽 대퇴골의 중간관을 10회 헹굽니다. 이제 중간관에서 결합된 파지를 염산 글리신 완충액으로 용리시킵니다. pH 2.2는 1 mol la triss로 중화됩니다.
파지를 증폭하려면 ER 2 5 3 7 박테리아에 EIT를 첨가하고 4.5시간 동안 배양합니다. 상등액을 새 튜브에 조심스럽게 옮기고 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 파지를 3번 침전시킵니다. 염화나트륨 용액은 섭씨 4도에서 밤새 튜브를 배양합니다.
마지막으로, 0.02% 아지드화나트륨으로 TBS에서 펠릿을 재현탁합니다. 증폭된 EIT의 플라크 형성 단위를 결정하기 위해 플레이트에 파지를 플라크합니다. eluded 및 non eluted phage 모두에 대해 in vivo bio panning 절차를 4회 반복합니다.
박테리아 배양에서 풀링된 파지를 증폭합니다. 파지 디스플레이 키트와 함께 제공되는 98 프라이머를 사용하여 최종 파지 DNA인 DNA 염기서열을 정제하고 정량화합니다. 중요한 것은 파지 DNA 염기서열 표현의 빈도를 계산하는 것입니다.
이제 글리신 글리신 글리신 글리신 사인 서열 시드를 포함하는 펩타이드를 합성하고 D one 세포를 증폭합니다. 우리 실험실에서 90% confluence에서 개발된 복제된 마우스 다전위 골수 기질 세포주. 트립신(Trypsin)은 젤라틴으로 코팅된 챔버의 웰 슬라이드 및 24시간 배양에서 펩타이드 염색 플레이트 세포를 펠릿화하고 계수하는 세포 및 원심분리기입니다.
PBS로 세포를 씻고 4% 파라알데히드로 30분 동안 고정합니다. 이제 글리신으로 차단 배양을 수행한 후 BSA Aden 및 BBSA를 수행합니다. 비오틴 차단 솔루션.
100마이크로몰의 비오틴화된 L 7 및 R 1 펩타이드를 추가합니다. PBS로 세포를 각각 5분씩 3회 세척합니다. LOR 스트립핀 커버와 호일을 1에서 1000 희석하여 넣고 어두운 서랍에서 30분 동안 배양합니다.
세포를 세척하고 vector shield Mounting media로 커버 슬립을 장착합니다. 이제 수술 24시간 전에 형광 현미경으로 슬라이드를 분석합니다. 젤 폼 실린더를 담그십시오.
20 마이크로몰 펩타이드(L 7 또는 R 1 또는 펩타이드가 없는 PBS 버퍼)가 있는 겔 폼 실린더를 멸균 12로 옮깁니다. 식기를 잘 배양하고 수술 시 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 냉장 보관합니다. 젤 폰 복합재를 사용할 때까지 얼음 위에 올려 놓습니다.
식염수 관개 하에서 공압 버를 사용하여 너비 3mm, 길이 8mm의 큰 직사각형 단피질 결함을 만듭니다. 부드럽게 두드려 이식된 모든 골격을 삽입하여 준비된 젤 폼으로 뼈 결손을 치료합니다. 쥐를 안락사시키고 정의된 시점에 경골을 채취하고, 뼈 결함을 주의 깊게 확인하고, 파라핀 절편을 위해 10% 중성 완충 포르말린으로 채취한 경골을 고정합니다.
마지막으로 모든 조직 부분을 hematin eosin으로 염색하여 osteo matrix를 표시합니다. Fluorescein isothiocyanate로 표지된 Aden은 in vitro에서 성장한 세포에 대한 펩타이드의 결합을 현미경으로 검출할 수 있습니다. 여기서 펩타이드는 배양 중인 중간엽 세포에 결합하여 세포에 대한 펩타이드의 골형성 효과를 결정합니다.
배양 중인 시험관 내 중간엽 세포는 세포 형태의 변화를 결정하기 위해 테스트 펩타이드로 처리할 수 있습니다. 예를 들어, 4일째가 되면 세포가 응집되기 시작하고 응집체는 시간이 지남에 따라 커져 결절을 형성합니다. 흥미롭게도, 뼈 부분은 자외선 아래에서 h와 e 자가형광으로 염색되었습니다.
뼈 조직과 비뼈 조직 간의 이러한 더 큰 대비는 분석을 용이하게 하고, 젤폼과 펩타이드로 치료된 결함의 뼈 복구를 결정하기 위해 단면의 뼈 존재를 정량화합니다. 여기에서 단독의 gelfoam와 비교하여, 플러스 펩타이드로 채워진 결함은 이 절차를 시도하는 동안 시간이 지남에 따라 가장 많은 양의 피질 복구를 보여주었습니다. 펩타이드의 최종 그룹을 선택할 때까지 시간이 지남에 따라 변함없이 축적되는 많은 수의 검체가 있기 때문에 데이터 입력에서 매우 체계적인 것이 중요합니다.
뼈를 표적으로 하는 펩타이드를 식별하는 기술로서 생체 내 바이옵 패닝(in vivo biop panning)이 개발되었다는 것은 이제 뼈 복구 및 뼈 손실 치료법으로 사용할 수 있는 잠재적인 약물을 갖게 되었음을 의미합니다. 뼈 복구의 기초가 되는 메커니즘 중 하나는 뼈 손실에도 관여합니다. 이러한 메커니즘을 더 자세히 이해하고 지연성 골절 및 골다공증과 같은 질환의 치료에 사용할 수 있는 도구를 갖추면 의료 서비스를 위해 고안할 수 있는 치료법을 개선하는 데 도움이 될 것입니다.
이 연구는 뼈를 타겟팅하는 펩타이드 서열과 그것이 중간엽 세포 분화 및 뼈 재생에 미치는 영향을 조사합니다. 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 연구는 뼈 복구 메커니즘을 강화할 수 있는 펩타이드를 식별하는 것을 목표로 합니다.
This study demonstrates how phage display-derived peptides can modulate mesenchymal cell differentiation to enhance bone repair, offering a target validation strategy for regenerative therapeutics. The approach supports early discovery by identifying bioactive sequences that potentiate osteogenesis in preclinical models. Such target-de-risking tools improve predictive confidence in bone anabolic pathway modulation.
The method fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization to preclinical validation in bone repair models.