파지 디스플레이 도서관에서 펩티드는 Mesenchymal 세포의 유전자 발현을 조절하고 Unicortical 뼈 결함에 Osteogenesis을 힘을 주다

이 실험의 전반적인 목표는 중간엽 세포의 분화를 촉진하고 골 재생을 돕는 서열을 식별하는 것입니다. 첫 번째 단계는 바이오 팬닝(biopanning)을 통해 뼈에 결합하는 파지를 분리하는 것입니다. 이어서 중간엽 세포에 결합하는 펩타이드 서열을 식별하고, 그에 따른 유전자 발현의 변화를 측정합니다.

재생 목적으로 펩타이드 서열을 뼈로 전달할 수 있는 방법을 결정하기 위해 실험을 수행합니다. 마지막 단계로 뼈 재생 상태를 조직학적으로 검사하며, 이러한 결과들을 종합하면 인비트로(in vitro) 세포 분화 메커니즘과 인비보(in vivo) 뼈 재생에 대한 중요한 통찰을 얻을 수 있습니다. 파지 디스플레이 라이브러리를 이용한 바이오패닝 기술의 장점은 뼈를 표적으로 하는 펩타이드를 식별할 수 있어, 중간엽 세포의 분화를 자극하고 뼈 재생을 촉진하는 데 사용할 수 있다는 점입니다.

궁극적으로, 이러한 펩타이드 서열은 골 재생을 위한 치료법 및 골감소증과 골다공증 같은 골 손실 치료에 유용하게 활용될 수 있습니다. ULA와 Pascal이 바이오패닝(biopanning)을 통해 혈관을 표적으로 하는 펩타이드 서열을 분리할 수 있음을 보여준 연구를 바탕으로, 본 연구에서는 이 방법을 골격 내 메커니즘을 탐색하는 데 적용하기로 하였습니다. in vivo 바이오패닝 절차를 위해, 10주 된 valve C 마우스의 심장을 통해 10¹⁰ plaque forming units의 N-E-B-P-H-D 12 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 관류시켰습니다.

약 5분 후, 마우스를 안락사시키고 대퇴골을 노출시켜 절개한 뒤, 양끝단을 잘라내고 골수를 제거합니다. 왼쪽 대퇴골의 내부와 외부를 PBS로 10회 헹굽니다. 그런 다음 해당 뼈를 ER 2 5 3 7 박테리아에 첨가합니다.

결합되지 않은 파지를 제거하기 위해, 21게이지 바늘이 장착된 주사기에 2% 탈지분유를 넣어 우측 대퇴골의 수질강을 10회 세척합니다. 이제 1M Tris로 중화하여 pH 2.2로 맞춘 염산-글리신 완충액을 사용하여 수질강으로부터 결합된 파지를 용출합니다.

파지를 증폭하려면, ER 2 5 3 7 박테리아에 EIT를 첨가하고 4.5시간 동안 배양합니다. 상층액을 새 튜브로 조심스럽게 옮기고, 폴리에틸렌 글리콜 염화나트륨 용액을 첨가하여 파지를 세 번 침전시킵니다. 튜브를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

마지막으로, 0.02% Sodium azide가 포함된 TBS에 펠릿을 재부유합니다. 증폭된 EIT의 plaque forming units를 결정하기 위해 파지를 플레이트에 plaque 합니다. 용출된 파지와 용출되지 않은 파지 모두에 대해 in vivo bio panning 절차를 4회 반복합니다.

박테리아 배양액에서 풀드 파지(pooled phage)를 증폭시킵니다. 파지 디스플레이 키트에 제공된 98 프라이머를 사용하여 최종 파지 DNA인 DNA 서열을 정제하고 정량합니다. 중요한 단계로, 파지 DNA 서열의 표현 빈도를 계산합니다.

이제 glycine glycine glycine serine lysine 서열 시드를 포함하는 펩타이드를 합성하고, 본 연구실에서 개발한 생쥐 다분화 골수 기질 세포주인 D1 세포를 90% confluence까지 증식시킵니다. 세포를 트립신 처리한 후 원심 분리하여 펠렛을 형성하고 수를 측정합니다. 펩타이드 염색을 위해 젤라틴 코팅된 챔버 슬라이드에 세포를 플레이팅하고 24시간 동안 배양합니다.

PBS로 세포를 세척하고 4% paraldehyde로 30분 동안 고정합니다. 이어서 glycine으로 블로킹 배양을 수행한 후, BSA Aden 및 BBSA Biotin 블로킹 용액을 차례로 처리합니다.

100 µM의 biotinylated L seven 및 R one 펩타이드를 첨가합니다. PBS로 세포를 5분씩 3회 세척합니다. LOR strippin을 1:1000로 희석하여 첨가한 후, 커버와 호일로 덮어 어두운 서랍 내에서 30분 동안 배양합니다.

세포를 세척하고 vector shield Mounting media로 커버슬립을 마운팅합니다. 이제 수술 24시간 전에 형광 현미경으로 슬라이드를 분석하십시오. 젤 폼 실린더를 적십니다.

20 µM의 L7 또는 R1 펩타이드, 또는 펩타이드가 없는 PBS 버퍼가 함유된 겔 폼 실린더를 멸균된 12-웰 배양 접시로 옮기고, 수술 전 4 °C에서 하룻밤 동안 냉장 보관하십시오. 사용 전까지 겔 폼 복합체를 얼음 위에 두십시오.

생리식염수 관류 하에 공압식 버(pneumatic burr)를 사용하여 가로 3mm, 세로 8mm 크기의 커다란 타원형 단일 피질 결손을 만듭니다. 부드럽게 두드려 모든 임플란트 스캐폴드를 삽입함으로써 준비된 젤 폼으로 골 결손 부위를 처치합니다. 정해진 시점에 쥐를 안락사시키고 경골을 수집하며, 골 결손 부위를 주의 깊게 확인한 후 수집한 경골을 파라핀 절편 제작을 위해 10% 중성 완충 포르말린에 고정합니다.

마지막으로 모든 조직 절편을 헤마톡실린-에오신으로 염색하여 골 기질을 표지합니다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 표지된 Aden은 in vitro에서 배양된 세포의 펩타이드 결합을 현미경으로 검출할 수 있게 합니다. 본 실험에서는 배양된 중간엽 세포에 펩타이드를 결합시켜 세포에 미치는 펩타이드의 골 형성 효과를 결정합니다.

배양 중인 인비트로(in vitro) 중간엽 세포에 테스트 펩타이드를 처리하여 세포 형태의 변화를 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 4일 차에 세포들이 응집하기 시작하며, 시간이 지남에 따라 응집체가 커지면서 결절을 형성합니다. 흥미롭게도, UV 광원 아래에서 H&E 염색된 뼈 절편이 자가형광을 나타냅니다.

뼈 조직과 비-뼈 조직 간의 대조가 뚜렷해지면, 겔폼(gelfoam)과 펩타이드를 함께 처리한 결손 부위의 뼈 재생 정도를 결정하기 위해 절편 내 뼈의 존재량을 정량화하는 분석이 용이해집니다. 겔폼 단독 처리군과 비교했을 때, 펩타이드를 추가하여 채운 결손 부위에서 시간이 경과함에 따라 가장 많은 피질골 재생이 나타났습니다. 이 절차를 수행할 때, 최종 펩타이드 그룹을 선정할 때까지 필연적으로 축적되는 시료의 수가 매우 많으므로 데이터 입력 시 매우 체계적으로 작업하는 것이 중요합니다.

뼈를 표적으로 하는 펩타이드를 식별하는 기술인 in vivo 바이오팬닝(biopanning)의 개발 덕분에, 이제 골 재생 및 골 손실 치료제로 사용할 수 있는 잠재적 약물을 보유하게 되었습니다. 골 재생의 근간이 되는 메커니즘 중 하나는 골 손실 과정에도 관여합니다. 이러한 메커니즘을 더욱 상세히 이해하고 지연 유합 골절 및 골다공증과 같은 질환의 치료에 사용할 수 있는 도구를 갖추는 것은 보건 의료를 위해 고안될 치료법을 개선하는 데 도움이 될 것입니다.