쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목적은 설치류 말라리아 기생충인 plasmodium yoi의 유전적 교배를 통해 재조합 자손을 생성하는 것입니다. 이를 위해 먼저 교배할 두 가지 부모 클론 기생충이 포함된 혼합 접종물을 마우스 그룹에 주입합니다. 그 후 감염된 마우스를 모기에 피딩시키면, 각 부모 균주의 생식세포가 융합되어 이배체 접합자를 형성합니다. 이 단계에서의 감수 분열은 유전적 재조합을 유도하여 재조합 자손을 생성하게 됩니다.

그 결과 생성된 포자소포체(sporozoites)를 모기의 타액선에서 회수하여 면역되지 않은 수용 마우스에 다시 주입함으로써 혈액 단계 기생충을 얻으며, 이들 중 제한 희석법으로 분리 가능한 개별 재조합 클론이 포함됩니다. 성공적인 실험의 경우, 클론 라인의 5~10%가 재조합체이며, 이는 적절한 유전적 마커에 대한 유전자형 분석을 통해 특성을 규명할 수 있습니다. 이 방법은 말라리아 내성 항원과 말라리아 전염성의 유전적 결정 요인은 무엇인가와 같은 말라리아 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

동결 보관된 혈액 단계의 말라리아 기생충이 들어있는 바이알 2개를 상온에 둡니다. 교배시킬 말라리아 기생충을 준비합니다. 본 예시에서 사용된 두 가지 설치류 말라리아 기생충 균주는 plasmodium yoi와 plasmodium berghei입니다. 22에서 30게이지 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 PBS pH 7.4 400 µL를 흡입합니다.

Thor에 감염된 혈액 100 µL를 흡입한 후, 내용물이 균질하게 섞일 때까지 시린지를 위아래로 뒤집어 줍니다. 본 시연에서는 통증과 스트레스를 최소화하기 위해 마취된 동물을 사용합니다. 마취는 82.5 mg/kg의 ketamine과 7.5 mg/kg의 xylazine이 포함된 마취제 칵테일 50 µL를 마우스의 복강 내에 주입하여 수행합니다.

마우스의 마취 깊이를 모니터링하여 폐사를 방지하십시오. 이 절차를 통해 마우스는 20분에서 30분 동안 마취 상태를 유지하게 됩니다. 회복 전, 기생충이 포함된 용액 200 µL를 마우스의 복강 내로 직접 주입하십시오.

완료 후, 사용한 주사기는 손상성 폐기물 전용 용기에 버리십시오. 이 방법을 사용하여, 교잡시킬 두 종류의 기생충 배양액을 각각 주입한 후 3~5일 뒤에 두 마리의 생쥐에 감염시킵니다. 감염된 생쥐 내에서 혈액 단계 기생충이 발달하게 됩니다.

다양한 기생충 균주에 감염된 공여 마우스의 꼬리 끝부분을 멸균 가위로 자릅니다. 현미경 슬라이드 위에 마우스 꼬리 혈액 한 방울을 채취하여 박층 도말을 수행합니다. guillem 염색법으로 박층 혈액 도말 표본을 염색합니다.

Guillem SA 염색약은 비감염 적혈구에는 핵이 없기 때문에 비감염 적혈구를 염색하지 않습니다. SAI는 감염된 적혈구 내 기생충의 핵을 염색하며, 적혈구는 환상체(ring stages), 영양체(trophozoites), 분열체(schizonts) 및 파열되는 생식모세포(rupturing merozoites) 형태로 나타납니다. 두 마리 쥐 모두에서 기생충 혈증이 1%에서 5%에 도달하면, 혼합 클론 감염을 위해 혈액 단계의 기생충을 수집할 수 있습니다.

서로 다른 기생충에 감염된 공여 마우스의 꼬리 끝부분을 자릅니다. 앞서 설명한 대로 멸균 가위를 사용하여 균주를 처리합니다. 유리 모세관을 사용하여 마우스 꼬리 혈액 1 µL를 1 mL의 멸균 PBS에 수집합니다. 혈액 현탁액 20 µL를 사용하여 cell ome으로 적혈구 밀도를 분석합니다.

적혈구 밀도와 파라 측정을 사용하여, 감염된 적혈구의 농도가 100 µL당 100만 개가 되도록 생리적 시트르산 식염수 용액으로 혈액 샘플을 희석합니다. 두 공여자의 감염된 혈액 샘플을 1:1 비율로 혼합하여 혼합 클론 접종균을 준비합니다. 다음으로, 감염시킬 각 마우스의 복강에 혼합 샘플 100 µL를 주입합니다.

각 부모 균주의 성공적인 전송을 확인하기 위해 단일 클론 감염 시 생쥐 두 마리를 사용하십시오. 수컷 및 암컷 가메토사이트(gametocyte)라고 불리는 기생충의 성 단계는 감염 후 약 4일경부터 생쥐의 혈액에서 나타나기 시작합니다. 앞서 설명한 대로 꼬리 혈액을 수집하고 지속적인 박층 혈액 도말 표본을 제작하여 가메토사이트의 출현 여부를 매일 모니터링하십시오.

수컷과 암컷 세포는 커다란 과립이나 색소의 존재 여부로 구분할 수 있습니다. 수컷 gato 세포의 세포질은 분홍색인 반면, 암컷 TER 세포의 세포질은 파란색입니다. 성숙한 gato 세포만이 커다란 액포를 나타냅니다.

양성 및 음성 모두에서 성숙한 cytes가 검출되면, 해당 마우스를 모기 흡혈용으로 사용할 수 있습니다. 감염된 각 마우스의 복강 내에 50 µL의 케타민, 자일라진 및 마취제 솔루션을 주입합니다. 마우스가 마취되면, 24시간 동안 당분 공급을 제한한 50~100마리의 암컷 Anis defense enzyme 모기가 들어 있는 케이지 상단에 마우스를 엎드린 상태로 배치하고, 30분 동안 중단 없이 모기가 흡혈하도록 합니다.

급여 기간 직후에 생쥐를 인도적으로 안락사시킵니다. 전송이 성공적이었다면, 급여 9일 후 모기가 섭취한 생식모세포는 이배체 접합자로 융합되어 오오시스트로 성숙하며, 이는 곤충의 중장에 관찰될 수 있습니다. 오오시스트가 더 많이 검출될수록 재조합 기생충이 생성되었을 가능성이 더 높습니다.

흡입기를 사용하여 케이지에서 감염된 모기 5~10마리를 수집하여 작은 용기에 옮깁니다. 이산화탄소 가스로 모기를 마취시킨 후, 얼음 위에 놓인 유리 페트리 접시로 옮깁니다. 암컷보다 촉각이 눈에 띄게 더 무성한 수컷 모기는 폐기합니다.

두 개의 주사기에 PBS를 채우고 26 gauge 0.5인치 바늘을 장착합니다. 주사기에서 유리 슬라이드 위에 PBS 약 100 µL를 떨어뜨립니다. 마취된 암컷 모기 5~10마리를 바늘을 사용하여 PBS 방울 위로 옮긴 후, 슬라이드를 해부 현미경 위에 놓습니다.

각 모기의 날개와 다리를 제거한 다음, 흉부와 후복부를 잡아 곤충을 고정합니다. 흰색 주머니 모양의 기관인 중장이 드러날 때까지 몸통을 잡아당겨 분리합니다. 중장을 떼어내고 해부 과정 중 나머지 몸통 부위는 폐기합니다.

해부용 바늘에 묻어 있는 PBS를 사용하여 중장(mid guts)이 마르지 않도록 유지하십시오. 해부가 완료되면 중장 위에 커버슬립을 덮으십시오. 광학 현미경의 100배 배율로 중장을 관찰하십시오.

OOS는 중장의 외표면에 위치한 두꺼운 벽을 가진 원형 구조로 식별할 수 있습니다. 각 중장의 OOS 수를 측정하십시오. sporozoites를 Feeding한 지 17일 후, sys에서 방출된 malaria parasites의 sporozoites는 모기의 SIV glands로 이동했을 것입니다.

스포로조이트를 수확하기 위한 가늘고 방추형인 세포입니다. 먼저, 깨끗한 가위를 사용하여 수집 튜브를 준비합니다. 500 µL 에픈 튜브의 뚜껑 부분을 잘라냅니다.

멸균된 19 gauge 바늘 끝을 가열하여 튜브 바닥에 구멍을 냅니다. 유리벽이 있는 튜브의 1/3을 채워 필터를 만듭니다. 이 필터 튜브를 더 큰 1.5 milliliter einor 튜브 안에 삽입합니다.

여과 장치가 준비되면, 앞서 설명한 대로 모기를 수집하고 마취합니다. 이전과 동일하게 해부를 위해 곤충을 공기 고정(air mount)하고, 모기의 머리, 날개, 다리 및 복부를 제거합니다. 감염된 침샘은 흉부에만 포함되어 있습니다.

미세 팁 핀셋을 사용하여 흉부를 500 µL의 PBS가 들어 있는 1.5 mL 균질기로 옮깁니다. 타액선에서 스포로조이트를 방출시키기 위해 흉부를 얼음 위에서 균질화하고, 유리 피펫을 사용하여 균질액을 여과 장치로 옮깁니다. 필터 튜브를 1000 rpm에서 10~20초 동안 원심분리합니다.

균질액을 원심 분리한 후, 22-30 gauge 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 상층액을 수집합니다. 포자소체 현탁액 100 to 500 µL를 마우스의 복강 내에 주입합니다. 감염 3일 후부터 마우스의 파라사이트 및 적혈구 밀도를 모니터링하기 시작합니다.

클로닝 절차를 위한 공여자로 0.1~1%의 기생률을 보이며 감염된 적혈구에 주로 단일 기생충이 포함된 마우스를 선택합니다. 송아지 혈청과 mammalian ringer 용액을 1:1로 혼합한 냉각 용액에 PBS로 희석한 마우스 꼬리 혈액을 적절한 양만큼 채취하여, 100 µL당 감염된 적혈구 농도가 0.6~1개가 되도록 조절한 후 접종물을 얼음에 보관합니다. 꼬리의 주사 부위를 에탄올로 닦아내어 정맥 내 주사를 준비합니다.

희석된 감염 혈액 100 µL를 마우스 100마리의 각 개체에 주입합니다. 이 방식으로 각 마우스는 1개 또는 0개의 기생충을 보유하게 됩니다. 실험이 성공적일 경우, 8일 차에 마우스의 20~50%에서 0.1~0.5%의 기생충률(parasitemia)이 나타납니다.

5~7일 후, GEM으로 고정된 박층 혈액 도말 표본을 검사하여 마우스 내 혈액 단계 기생충의 존재 여부를 스크리닝합니다. 교배로 인해 생성된 자손 기생충은 마이크로새틀라이트(microsatellites) 및 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms)과 같이 서로 다른 염색체에 있는 유전 마커를 사용하여, 꼬리 혈액 샘플에서 추출한 DNA의 PCR 분석을 통해 유전자형을 분석할 수 있습니다. 독립적인 유전자 궤적이 두 부모 클론 모두로부터 유래된 기생충이 재조합 클론입니다.

재조합 기생충에 감염된 동물로부터 채취한 혈액은 향후 사용을 위해 냉동 보존할 수 있습니다. 실험이 성공적일 경우, 전체 마우스의 5%에서 10%가 독립적인 재조합 자손을 보유하게 됩니다. 이 영상을 시청하고 나면 말라리아의 유전적 공정 생성 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

기생충 및 배지 yoi. 이 방법은 다른 종의 기생충에도 동일하게 적용할 수 있습니다.