Name: 쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: 배우세요 Plasmodium yoelii 유전자 교배 방법을 통해 재조합 후손을 생성하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 말라리아 약물 내성 및 전파력의 유전적 결정인자를 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 원고의 중요한 읽기위한 DRS 랜디 엘킨스, 로빈 Kastenmayer, 테드 토리, 댄 정지 및 Tovi 리먼 감사드립니다. 이 작품은 교내 연구 부문의 교내 연구 프로그램, 알레르기 및 전염병, 보건 국립 연구소 국립 연구소에 의해 중국의 973 국가 기초 연구 프로그램, # 2007CB513103에 의해 지원되었다. 우리는 도움을 NIAID 교내 편집기 브렌다 라에 마샬 감사합니다.

무균 기술은 실험 결과를 혼란시킬 수있는 마우스로 외인성 감염 요원의 실수로 도입을 피하기 위해 동물로 administrated 될 모든 재료에 적용해야합니다. 1. 피를 단계 말라리아 기생충과 실험실 쥐를 감염 <ol><li> 상온에서, 냉동 혈액 단계 말라리아 기생충을 포함하는 두 병이 깨지는 해동. 이 예제에서 사용이 쥐 말라리아 기생충의 종자는 Plasmodium yoelii yoelii 및 Plasmodium yoelii의 nigeriensis입니다. </li><li> 22-30 게이지 (G) 바늘로 주사를 맞게하고 살균, 제약 학년 PBS (산도 7.4) 400 μL를 그립니다. </li><li> 내용이 homogenously 혼합 때까지 주사기를 반전 아래, 같은 주사기를 사용하여 해동 감염된 혈액 100 μL를 그립니다. (옵션 : 피펫이 주사 주사기로 전송하기 전에 컬렉션 튜브에 PBS 및 감염된 혈액을 전송하는 데 사용할 수 있습니다.) </li><li> 기생충이 직접 마우스 복막에 솔루션을 포함하는 200 μL를 주입. 완료되면, 샵스 빈의 주사기를 폐기하십시오. (또한 실험실 마우스의 유지 관리에 대한 보충 자료를 참조). 일반적으로 inoculum의 표준 크기가 원래 냉동 자료에 기생충 감염의 수준에 따라, 100-500 μL 사이입니다. </li><li> 이 마우스 각으로 교차하는 두 기생충의 변종을 주사. 생쥐는 주사 후 미세 3-5일 긍정하게 될 것입니다. parasitemias가 1~5% 사이에 도달하면 다음 단계로 진행합니다. </li></ol> 2. 마우스의 혼합 클론 감염 <ol><li> 사전 혼합 복제 감염으로, Giemsa 스테인드 얇은 피묻은 얼룩에 의해 현미경 검사 (그림 3)에 대한 다른 기생충의 변종에 감염된 두 기증 마우스의 꼬리 혈액을 수집하고, 적혈구 세포 밀도의 측정 (세부 절차에 대한 보충 자료를 참조) . </li><li> 이전 얻은 parasitemia 붉은 혈액 세포 밀도 측정을 사용하여 생리 식염수 (1.5 % W / V trisodium의 구연 산염 이수화물, 0.85 % W / V 나트륨 염화물) 및 inoculum 혼합물을 생산하는 데 필요한 마우스 혈액의 볼륨을 계산합니다. </li><li> 100μl 당 백만 감염된 적혈구의 최종 농도에 기생충 솔루션을 조정합니다. </li><li> 혼합 복제 inoculum를 얻기 위해 1:1 비율에서 두 기증자로부터 감염된 혈액을 결합합니다. 두 부모의 클론이 성장 속도에 차이가하면,의 비율을 조정 1시 2분 또는 1시 5분에 느린 성장하는 부모 복제 부모의 빠른 성장. </li><li> 감염 각 마우스의 복막에 혼합 시료 100 μL를 주입. (주입하는 생쥐의 수를 결정하기 위해 3.9 단계도 참조) </li><li> 이 방법을 사용하여 단일 부모 변종 각이 쥐를 감염. 단일 클론 감염은 두 부모 변종을 성공적으로 전송 결정을하실 수 있습니다. </li></ol> 3. 수유 모기 <ol><li> 300-500 성인 (남성과 여성) 아노 펠 레스 모기 stephensi 각 pupae에서 세 5-7일 게시물의 출현을 포함하는 세 새장을 준비합니다. 용기는 플라스틱이나 금속 뚜껑에 의해 안전 그물로 덮여있다. 두 케이지는 부모의 클론에 이송되며 세 번째 케이지는 유전 십자가의 준비입니다. </li><li> 혼합 복제 감염 후 사일 시작 감염된 생쥐에서 Giemsa - 스테인드 얇은 혈액 꼬리 얼룩을 준비합니다. </li><li> 1000x 확대 최소한 50 미세한 필드를 검사하여 현미경으로 얼룩을 검사하고 남성과 여성의 gametocytes 존재 여부를 결정합니다. </li><li> 남성과 여성 gametocytes 큰 공포 대형 과립의 존재 (그림 3)에 의해 인식할 수 있습니다. 남성과 여성 gametocytes는 각각, 핑크, 파랑 세포질 있습니다. gametocytes가 존재하는 경우, 3.6 단계 따르십시오. </li><li> gametocytes이 결석하는 경우, 그들이 나타날 때까지 매일 계속 모니터링. gametocytes가 존재하는 경우 다음 단계를 계속합니다. </li><li> 마취제와 3 각 감염된 마우스 (20g 마우스 체중 당) 마취에 마우스 복막에 MG / xylazine의 ML 33 MG / ML을 포함한 마취 약물 칵테일 50 μL를 주입. 마취제와 xylazine의 최종 선량은 각각 82.5 및 7.5 MG / kg이다. </li><li> 쥐들이 24 시간을위한 설탕 공급 부족과 모기가 중단없이 30 분 동안 먹을 수있게되었습니다 성인 아노 펠 레스 모기 stephensi을 포함 새장 위에 엎드려서 얼굴을 넣습니다. </li><li> 표준 조건 (; 또한 실험실 모기의 유지 관리에 대한 보충 방법을 참조하십시오 온도가 24-26 사이에 유지 ° C)을 아래 insectary에서 모기를 유지합니다. </li><li> 모든 50-100 여성 모기 한 감염된 마우스를 사용합니다. 쥐가 마취하에 계속하는 동안 수유 후 자궁 전위에 의해 즉시 쥐를 안락사. </li></ol> 4. 해부 모스키토 MidgUTS 카운트 Oocysts <ol><li> 9 일 먹이 후, 모기는 곤충의 midgut에서 oocysts에 대해 검사됩니다. 단일 클론 감염된 생쥐에 피드가 두 부모 변종의 gametocytes을 나타냅니다 모기에 oocysts의 존재는 전염성이 있습니다. </li><li> 모기 midgut을 해부하다하려면, 새장 5-10 감염된 모기를 수집하는 작은 컨테이너에 연결된 흡인기를 사용합니다. </li><li> CO 2 가스를 사용하여 모기를 마취하고 얼음에 유리 페트리 접시에 그들을 전송합니다. 별도의 남성 모기를 폐기하십시오. 남성의 안테나는 암컷에 비해 눈에 띄게 bushier 있습니다. </li><li> PBS 두 주사기를 작성, 26 게이지 절반 인치 (G ½) 바늘과 함께 그들을 맞습니다. 유리 슬라이드에 주사기에서 PBS 100 μL에 대한 보증금. </li><li> PBS의 드롭에 5-10 anesthetized 여성 모기를 전송하고 해부 현미경에서 슬라이드를 놓으십시오. </li><li> 같은 바늘을 사용하면, 흉부 및 복부 뒷부분에서 곤충을 잡고, 다음 각 모기의 날개와 다리를 제거 midgut, 흰 색 같은 몸, 발표 때까지 분리 시체를 가져옵니다. midgut를 분리하고 신체의 나머지 부분을 삭제. </li><li> 슬라이드가 건조하는 경우 midgut에 대한 자세한 PBS를 추가합니다. 건조 해주면 midgut이 타락한 것이다. midguts 통해 커버 전표를 놓습니다. </li><li> 100x 확대에 가벼운 현미경 midguts을 검사합니다. (그림 3) 각 midgut에서 oocysts의 숫자를 세어보세요. Oocysts은 midguts의 바깥쪽 표면에 거짓말 두꺼운 벽 원형 구조로 인식할 수 있습니다. </li><li> 완료되면, 주사기, 주사 바늘 및 샵스 빈의 슬라이드의 폐기. </li><li> oocysts이 midguts에 부재중인 경우, gametocytes의 높은 숫자에 감염된 쥐 모기 먹이를하고 이상 수유 시간을 제공합니다. 온도는이 단계에 중요합니다. 온도가 24-26 ° C.에 설정되어 있는지 확인 </li></ol> 5. 원심 분리에 의해 모기 Sporozoites 모집 <ol><li> 다음과 같이 sporozoite 수집 튜브를 준비 : 깨끗이 0.5 - ML의 원심 분리기 튜브의 뚜껑을 잘라 골조 19 G 바늘을 사용하여 튜브의 하단에있는 구멍 (0.1-0.2 mm 직경)를 펀치. </li><li> 글라스 울로 튜브의 1 / 3을 입력합니다. (한 관 ~ 100 모기에서 수확 sporozoites 충분합니다) 1.5 - ML 수집 관에 필터 튜브를 삽입 </li><li> 17 일 게시물 먹이에서 흡인기를 사용하여 작은 용기에 케이지에서 모기 (4 단계)를 수집합니다. </li><li> 모기를 마취하는 CO 2 가스를 사용합니다. </li><li> 남성 모기의 암컷을 분리. 컨테이너에서 얼음에 유리 페트리 접시에 anesthetized 여성 모기를 전송합니다. </li><li> PBS로 가득한 26 G의 ½ 잎 두 개의 주사기를 준비합니다. 유리 슬라이드에 주사기에서 PBS 100 μL에 대한 보증금. </li><li> 현미경 슬라이드에 모기를 전송합니다. 해부 현미경 모기 '머리, 날개, 다리와 복부를 제거합니다. </li><li> 세부적으로 밀고 집게를 사용하면 1.5 ML 균질 화기 (박격포와 유봉)에서 0.5 ML PBS로 thoraxes를 전송합니다. (sporozoite 2-3 H에 대한 infective 유지) 얼음 thoraxes을 저장합니다. </li><li> (그림 3 참조) 침샘에서 sporozoites를 공개 얼음 thoraxes을 균질하고, 유리 피펫을 사용하여 글라스 울 (단계 5.1-5.2)로 채워진 튜브에 lysates을 (homogenates) 전송. </li><li> 상온에서 1,000 rpm으로 10-20 초위한 원심 분리기. </li><li> 수집 흐름 -을 통해 (정화의 sporozoite 서스펜션)가 22-30 G의 바늘로 주사를 사용합니다. (옵션 : 드롭 흐름을 통해 미세한 슬라이드에 커버가 표준 가벼운 현미경, 400X 배율에서 살고 sporozoites를 실수로 시각화 장소도 참조 그림 3 10-50 μL) </li><li> 마우스 (; 심판이 12 참조 최대 200,000 기생충이 단일 모기에서 수확 가능)로 sporozoite 정지의 IP 0.1-0.5 ML을 주사. 성공적인 경우에, 동물은 주사 후 72 시간을 감염 될 것입니다. </li></ol> 6. 제한 희석을 사용하여 복제 프로 제니 <ol><li> sporozoite 주사 후 72 시간이 얇은 피묻은 얼룩의 Giemsa의 얼룩 후 적혈구 세포 밀도의 측정 현미경 검사에 대한 다른 기생충의 변종 (자세한 절차를 보려면 보충 자료 참조)에 감염된 두 기증 마우스의 꼬리 혈액을 수집합니다. </li><li> 0.1-1 %의 parasitemia을 표시 마우스를 선택하고 그의 감염된 적혈구가 복제 절차 기증자로서 주로 단일 기생충을 포함하고 있습니다. 생쥐가 미세하게 부정하는 경우 6.1 일 다음 단계를 반복합니다. 동물이 14 일 이내에 감염되지 않는 경우) 5 단계 중 2 단계를 반복하고 단계 5.11에서 sporozoites의 존재를 결정합니다. </li><li> 송아지 혈청과 포유 동물 링어의 솔루션 (2.7 MM의 칼륨 염화물, 1.8 MM의 염화칼슘, 154 MM의 나트륨 염화물)의 차가운 1시 1분 솔루션에 수확 꼬리 혈액을 희석해서로 죄수를 달성하기 위해한 감염된 적혈구 100 μL 당 세포, 그리고 얼음에 inoculum를 저장할 0.6의 centration. 이러한 방법으로 개인 마우스의 대부분은 하나 또는 제로 기생충 중 하나를 받으실 수 있습니다. </li><li> 정맥 50-100 생쥐의 각 희석 감염된 혈액 100 μL를 주입. </li><li> 5 ~ 7 일 후, Giemsa - 스테인드 얇은 피묻은 얼룩을 검사하여 혈액 무대 기생충의 존재에 대한 쥐를 화면. 성공적인 실험에서 생쥐의 20~50%가 감염되어 8 일 이후 감염에서 0.1-5.0 %의 parasitemia를 표시합니다. </li></ol> 7. 유전자 표식을 사용하는 제니의 특성화 <ol><li> 냉장 생리학 구연 산염 생리 식염수, 소용돌이 짧게, 그리고 펠렛 혈액 세포로 상온에서 3,000 rpm으로 3 분위한 원심 분리기의 0.2 ML를 포함하는 1.5 - ML의 microcentrifuge 관에서 마우스 꼬리 피가 20-40 μL를 수집합니다. 바로 DNA를 추출하거나 -80시 펠렛 ° C. 유지 </li><li> 표준 DNA 추출 방법을 사용 기생충 DNA를 준비합니다. DNA의 급속한 분리 들어, 높은 순수 PCR 템플릿을 준비 키트 (로체 응용 Bioscience)를 사용합니다. </li><li> 재조합 자손은 microsatellite (MS) 또​​는 유전 십자가의 두 부모의 변종을 차별화 할 수 서로 다른 염색체에있는 단일 염기 다형성 (SNP)를 사용하여 genotyping 후 확인할 수 있습니다. P. MS의 genotyping을위한 단일 형광 라벨이 표시된 primers를 사용하는 단순 방법 yoelii는 (심판이 8,9 참조) 사용할 수 있습니다. </li></ol> 8. 피를 단계 말라리아 기생충의 Cryopreservation <ol><li> 50-10 ML의 50~20%의 parasitemia와 anesthetized 마우스 심장 주사에 의해 감염된 혈액의 0.5-1 ML 수집은 생리 생리 식염수를 차게. </li><li> 상온에서 2,000 rpm으로 5 분 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 혈액 알약에 Glycerolyte 57 솔루션 드롭 현명한 2X 볼륨 (Fenwal 연구소)을 추가하고 잘 섞는다. </li><li> cryotubes (튜브 당 0.2-0.5 ML)에 정지를 전송합니다. </li><li> -80 ° C (최대 1 월) 또는 액체 질소에 cryopreserved 혈액을 저장합니다. </li></ol> 9. 대표 결과 : 성공적인 실험에서 복제된 라인 50~10% 독립 재조합 자손 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 유전자 교차하는 동안 가족 생활주기와 유전자 재조합 이벤트 도식 표현. 유전자 재조합 이벤트 모기의 발전의 초기 단계에서 이루어집니다. 모기의 midgut 다른 유전 배경을 "haploid"남성과 여성 gametes의 수정에 따라, "diploid"zygotes가 형성됩니다. 접합자는 기생충의 생활주기의 유일한 diploid 단계를 구성, 감수 분열은 수정 12 시간 이내에 다음과 모기와 포유류의 모든 후속 단계가 haploid 남아있다. 결과 zygotes는 ookinetes 및 oocysts으로 개발합니다. 각 oocyst의 성장과 mitotic 사업부는 모기 'hemoceal에 출시되는 sporozoites 수천을 생산하고 있습니다. 침샘으로 마이 그 레이션하는 사람 sporozoites는 간과 적혈구 세포 단계의 개발이 이루어지는 포유류의 호스트로 전송하는 위치에 있습니다. 붉은 혈액 세포주기의 과정에서, 몇몇 기생충은 성숙한 남성과 여성의 gametocytes로 구별하실 수 있습니다. 이러한 gametocytes 다른 모기, 영속 전송에 의해 촬영 때 기생충의 생활주기가 완료되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 말라리아 기생충 및 재조합 자손의 생산에 핵 유전자의 상속. 유전자 재조합은 염색체 reassortment이나 크로스 오버 이벤트에 의해 생성하실 수 있습니다. Homozygous 자손 같은 부모 클론 1 개 또는 2 개 (A와 D), 각각의 gametes 사이 selfing에 의해 생산. B) 두 개의 다른 부모 클론 혼자 염색체 reassortment에 의해 형성되는 재조합 핵 (블루 타원)의 gametes 사이의 교차 수정에 의해 만들어진 Heterozygous 자손. C) 상동 염색체의 비 자매 chromatids 사이 crossovers에 의해 형성되는 두 개의 다른 부모 클론, 재조합 핵 (적색 타원)의 gametes 사이의 교차 수정에서 생산 Heterozygous 자손. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 설치류 말라리아 기생충 Plasmodium yoelii의 형태론. 10 일째 게시물 oocysts와) 링 단계, B) trophozoite, C) schizont, D) merozoites, E) 미숙한 남성 gametocyte, F) 성숙 남성 gametocyte, G) 미숙한 여성 gametocyte, H) 성숙 여성 gametocyte 전) midgut 먹이 (화살표로 표시 성숙 oocysts, 200x 배율), J) 모기 침샘 (100x 배율), K) sporozoites (400x 배율).

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</ol>

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우리는 또한 다른 쥐 malarias의 유전 십자가의 생산에 적용되는 설치류 말라리아 Plasmodium yoelii에서 유전자 십자가의 생산을위한 기술을 보여줍니다. 단일 클론 부모와 생쥐의 감염은 대개 부모가 십자가를 수행하기 전에 기능 gametes를 생산 능력이 있는지 확인하는 부모 기생충의 성공적인 전송을 결정하기 위해 수행됩니다. 모기를 통해 성공적인 전송이 insectary의 온도, 사용 쥐 말라리아 기생충의 종, 그리고 혈액 무대 기생충의 복용 (inoculum 크기)를 포함한 여러 요인에 의해 영향을받습니다. P. berghei의 전송은 보통 19-21 ° C 13, P.의 전송에 달성되는 동안 yoelii와 P. chabaudi는 정기적으로 23-25 ​​° C 14에서 수행됩니다. P.의 Ookinetes bergh...

보충 자료 : <ul><li> 실험실 생쥐들의 유지 보수 </li><li> 연구실 모기 유지 </li><li> Giemsa 물들다 얇은 피묻은 얼룩의 현미경 검사는 얼룩 </li><li> 붉은 혈액 세포 밀도의 측정 </li></ul> 실험실 생쥐들의 유지 보수 근친 실험실 마우스 스트레인 5~8주 오래된 세 BALB / C,의 여성이 연구에 사용됩니다. 마우스는 피더와 물통을 갖춘 와이어 바 뚜껑이있는 표준 솔리드 하단에 폴리 카보 네이트 케이지에 보관되어 있습니다. 마우스가 일정한 온도 유지 (25 ± 1 ° C) 12시 12분 시간에 조명 : 어두운주기. (sterilizable, 할란 - Teklad에서) 생쥐 2018S 할런 Teklad 글로벌 19 % 단백질 압출 쥐 다이어트 피드를 허용하고 산성의 식수 광고 libitum와 함께 제공된. 동물 실험 프로토콜 LMVR11E (건강, 베데스다, 메릴랜드 국립 연구소)에서 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 동물 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행됩니다. 연구실 모기 유지 아노 펠 레스 모기 stephensi의 실험실에서 자란 식민지에서 있습니다. 성인은 온도 및 습도 제어 방 (25 23 보관 나일론 새장에 유지됩니다 ° Plasmodium yoelii 및 Plasmodium chabaudi에 대한 C, 21 to 19 ° Plasmodium berghei에 대한 C, 80~95% 습도; 12시 12분에 시간 라이트 : 어두운 사이클). 성인 모기가 10 % 포도당과 2.00 % 파라 아미노 벤의 산성 (PABA) 보충 물 솔루션을 공급하고 있습니다. 고품질의 성인을 얻으려면, 500 애벌레는 중탄산 약 1 MG와 함께 제공되는 1000 cm 3 열 접시에 증류수 1 L에 낮은 밀도 상태로 재배하고 있습니다. 그들은 번데기 단계로 발전하기 전까지 부화 후 유충은 tetramin 분말 (페트코에게) 부여되고 신흥위한 성인 모기 케이지으로 전송됩니다. Giemsa 물들다 얇은 피묻은 얼룩의 현미경 검사는 얼룩 를 사용하여 깨끗한 가위는 감염된 마우스의 꼬리의 끝 (1.0 mm)를 해제 싹둑. 깨끗한 표본 슬라이드에 꼬리 혈액 플레이스 한방울 (0.5-1.0 μL). 마우스 1-2 분에 출혈이 중단됩니다. 표본 슬라이드에 45 ° 각도로 상대에 그것을 유지, 혈액 드롭 위에 깨끗한 확장기가 슬라이드를 삽입하고, 혈액이 확장기의 전체 너비 adsorb 수 있습니다. 표본 슬라이드를 잡고 얇은 얼룩을 만들어 빠르게하고 원활하게 전달 확장기 슬라이드를 밀어. 절대 메탄올에 슬라이드를 담가 후 혈액 영화 건조 해합니다. Giemsa 얼룩 (증류수에서 10 % Giemsa 염색)로 덮는 전에 한 번 더 건조 공기에 슬라이드를 허용합니다. 실온에서 10-15 분 얇은 혈액 영화를 잠복기 후, 신중하게 수돗물로 슬라이드를 씻어하고 공기가 건조 보자. 1000x 배율 (100x 객관적인 렌즈)와 계산 parasitemia (RBC는 계산 100 당 iRBC의 숫자)에 침지 기름 가벼운 현미경, 감염된 적혈구 (감염된 RBC의 형태에 대한 그림 3 참조 iRBC)의 번호를 확인합니다. 말라리아 기생충의 다른 변종 성장 속도와 pathogenicity에 따라 다릅니다. 혈액 무대 parasitaemias의 모니터링은 혈액 단계 말라리아 기생충의 복용량에 따라 주사 후 24 시간 수행할 수 있습니다. 10 7 감염된 RBC intraperitoneally 또는 정맥 10 6 감염된 RBC와 함께 주입하면 예를 들어, 마우스가 미세하게 긍정적인 24 시간 것입니다. 붉은 혈액 세포 밀도의 측정 parasitaemias, 감염된 생쥐의 적혈구 세포 (RBC) 밀도의 수준과 같은 감염의 과정에 걸쳐 다릅니다. RBC 밀도는 단일 및 혼합 복제 감염의 시작과 복제 실험을하기 전에 1-2 시간 이내에 측정한다. Cellometer를 사용하여 노이 바 우어 hemocytometer 및 자동 계산 (Nexcelom Bioscience)를 사용하여 수동으로 계수 : RBC 밀도 측정을위한 두 가지 방법이 있습니다. 두 방법에서는 모세관 유리 (VWR)를 사용하여 마우스 꼬리 혈액 1 μL를 철회하고 PBS의 10 ML에 희석하여 잘 섞는다. 노이 바 우어의 hemocytometer를 사용하려면 hemacytometer에 정지 20 μL를로드합니다. 10X 객관적인 렌즈와 가벼운 현미경에 hemacytometer 놓으십시오. hemacytometer 추가 16 작은 사각형으로 나뉩니다 9 큰 사각형과 모서리에 4 큰 사각형으로 나누어 그리드가 포함되어 있습니다. 네 개의 코너 광장에서 16 작은 사각형의 각 세포의 총 수를 계산합니다. 바이어스를 계산하거나 그리드 라인을 중첩 셀을 계산하지 않으려면, &quot;에&quot;로 셀 계산이 중복하는 경우 상단 또는 오른쪽 라인과 &quot;아웃&quot;이 중복 아래쪽이나 왼쪽 라인을 경우. 작은 평방 당 세포의 숫자를 추정하고 0.00625 (작은 사각형의 볼륨이 6.25 NL이다)로 나눕니다. 이것은 microliter 당 세포 (&amp;의 개수를 산출무, L). 이 데이터에서 10,000 (희석 계수)과 곱하여 최종 적혈구 세포 밀도를 계산합니다. 공기 건조, 증류수와 70 % 에탄올로 커버 슬립과 집계 실 린스. 또는 Cellometer의 계수 챔버 슬라이드에 정지 20 μL를로드합니다. Cellometer 슬라이드 챔버 (독자)에 슬라이드를 삽입합니다. , Cellometer 소프트웨어를 시작하고 &quot;적혈구 세포&quot;옵션을 선택하고, 10,000 희석 요소를 입력합니다. RBC 밀도를 기록합니다.

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

antimalarial 약물에 대한 응답과 말라리아 기생충의 pathogenicity의 변화는 생물 학적 및 의료 중요하다. 연계 매핑 1-3 설치류와 인간의 4-6 말라리아 기생충의 다양한 특성을 기본 유전자 또는 loci 성공적으로 확인되었다. 말라리아 기생충 Plasmodium yoelii 야생 아프리카 설치류로부터 분리된 많은 말라리아 종 중 하나이며 실험실에서 성장에 적응되었습니다. 이 종족은 인간의 말라리아 기생충의 생물 학적 특성 중 많은 것들을 재현한, 같은 microsatellite 및 증폭 단편의 길이 다형성 (AFLP) 마커와 같은 유전자 마커 또한 기생충 7-9 위해 개발되었습니다. 따라서, 쥐 말라리아 기생충의 유전자 연구는 Plasmodium falciparum에 대한 연구를 보완하기 위해 수행할 수 있습니다. 여기, 우리는 P.의 유전 십자가를 생산을위한 기술을 보여줍니다 첫째 DRS에 의해 개척되었다 yoelii. 데이비드 Walliker, 리차드 카터와 에딘버러 (Edinburgh) 10 대학에서 동료. P.의 유전 십자가 yoelii 및 기타 설치류의 말라리아 기생충은 관심의 phenotypes와 모기가 사일 감염 후 감염된 생쥐에서 피드 수에 따라 다릅니다 두 유전자 별개의 클론의 gametocytes를 포함 inoculum와 쥐 뮤스의 musculus를 감염에 의해 실시하고 있습니다. 마우스 혈액에서 남성과 여성 gametocytes의 존재는 미세 이송하기 전에 확인합니다. 수유 후 48 시간 이내에 모기의 midgut에서 haploid gametocytes은 남성과 여성의 gametes에 차별 비옥하고, diploid의 접합자 (그림 1) 형태. ookinete에 접합자의 개발 과정, 감수 분열 11 발생 나타납니다. 접합자는 두 유전자 별개의 기생충, 유전자 교류 (. 상동 염색체의 쌍 비 자매 chromatids 사이의 염색체 reassortment 상호 오버, 그림 2) gametes 사이의 교차 수정을 통해 파생하는 경우는 재조합의 결과가 발생할 수 있습니다 동종 loci에서 유전 물질. 각 접합자 네 haploid의 핵 이어지는 두 개의 연속 핵 분열을 겪습. ookinete 추가 oocyst으로 개발하고 있습니다. oocyst가 성숙되면, sporozoites (십자가의 자손)의 수천이 형성 및 모기 hemoceal로 출시됩니다. Sporozoites는 침샘에서 수확 및 사전 erythrocytic 및 erythrocytic 단계 개발이 이루어지는 새로운 murine 호스트로 주입됩니다. Erythrocytic 양식은 복제와 유전 결합 매핑하기 전에 부모의 라인을 구분 문자에 관한 분류됩니다. 개별 부모 클론 제어 감염은 유전 십자가의 생산과 같은 방식으로 수행됩니다.

쥐 말라리아 기생충의 유전자 십자가는 모기에 두 유전자 별개의 기생충을 먹이에 의해 수행됩니다. 재조합 자손은 모기가 감염된 쥐를 물어 수 있도록 후 마우스 혈액에서 복제됩니다. 이 비디오의 유전자 십자가를 생산하는 방법을 보여줍니다<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; 기타 설치류의 말라리아 기생충에 적용됩니다.

항말라리아제에 대한 반응 및 말라리아 기생충의 병원성 차이는 생물학적 및 의학적으로 중요합니다. 연관 매핑을 통해 ...

이 절차의 전반적인 목적은 설치류 말라리아 기생충인 plasmodium yoi의 유전적 교배를 통해 재조합 자손을 생성하는 것입니다. 이를 위해 먼저 교배할 두 가지 부모 클론 기생충이 포함된 혼합 접종물을 마우스 그룹에 주입합니다. 그 후 감염된 마우스를 모기에 피딩시키면, 각 부모 균주의 생식세포가 융합되어 이배체 접합자를 형성합니다. 이 단계에서의 감수 분열은 유전적 재조합을 유도하여 재조합 자손을 생성하게 됩니다.그 결과 생성된 포자소포체(sporozoites)를 모기의 타액선에서 회수하여 면역되지 않은 수용 마우스에 다시 주입함으로써 혈액 단계 기생충을 얻으며, 이들 중 제한 희석법으로 분리 가능한 개별 재조합 클론이 포함됩니다. 성공적인 실험의 경우, 클론 라인의 5~10%가 재조합체이며, 이는 적절한 유전적 마커에 대한 유전자형 분석을 통해 특성을 규명할 수 있습니다. 이 방법은 말라리아 내성 항원과 말라리아 전염성의 유전적 결정 요인은 무엇인가와 같은 말라리아 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.동결 보관된 혈액 단계의 말라리아 기생충이 들어있는 바이알 2개를 상온에 둡니다. 교배시킬 말라리아 기생충을 준비합니다. 본 예시에서 사용된 두 가지 설치류 말라리아 기생충 균주는 plasmodium yoi와 plasmodium berghei입니다. 22에서 30게이지 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 PBS pH 7.4 400 µL를 흡입합니다.Thor에 감염된 혈액 100 µL를 흡입한 후, 내용물이 균질하게 섞일 때까지 시린지를 위아래로 뒤집어 줍니다. 본 시연에서는 통증과 스트레스를 최소화하기 위해 마취된 동물을 사용합니다. 마취는 82.5 mg/kg의 ketamine과 7.5 mg/kg의 xylazine이 포함된 마취제 칵테일 50 µL를 마우스의 복강 내에 주입하여 수행합니다.마우스의 마취 깊이를 모니터링하여 폐사를 방지하십시오. 이 절차를 통해 마우스는 20분에서 30분 동안 마취 상태를 유지하게 됩니다. 회복 전, 기생충이 포함된 용액 200 µL를 마우스의 복강 내로 직접 주입하십시오.완료 후, 사용한 주사기는 손상성 폐기물 전용 용기에 버리십시오. 이 방법을 사용하여, 교잡시킬 두 종류의 기생충 배양액을 각각 주입한 후 3~5일 뒤에 두 마리의 생쥐에 감염시킵니다. 감염된 생쥐 내에서 혈액 단계 기생충이 발달하게 됩니다.다양한 기생충 균주에 감염된 공여 마우스의 꼬리

protocol-for-production-genetic-cross-rodent-malaria

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 실험실에서 뒤쪽 아노 펠 레스 gambiae하는 데 사용되는 일반적인 기법을 보여줍니다. 실험실 모기를 돌보는위한 방법은 혈액 먹이 어른 pupae에 애벌레에서 유기체의 생명주기의 모든 단계를 통해 증명하고 있습니다.

모스키토 리어링 (A. gambiae)에 대한 프로토콜

유전자가 말라리아에 대한 잠재적 내화물로 식별되면, 그것은 모기 이내 Plasmodium 감염을 예방의 역할에 대해 평가해야합니다. 이 프로토콜은 모기의 plasmodium 감염의 범위가 assayed 수있는 방법을 보여줍니다. gametocyte 문화, 멤브레인 수유 모기 인간의 혈액을 준비하고 모기 midgut에서 바이러스 titers을 시금에 대한 기술은 증명됩니다.

모기와 감염 표현형 결정에서 Plasmodium falciparum 감염에 대한 프로토콜

이 비디오는 뇌성 말라리아의 실험용 마우스 모델의 생성을 보여줍니다. Plasmodium berghei에 감염된 암컷 모기에서 분리된 포자암을 구속된 쥐의 꼬리 정맥에 주입하여 혈액-뇌 장벽 파괴 및 뇌 염증을 유발하여 뇌성 말라리아를 유발합니다. 이 감염된 마우스 모델은 뇌성 말라리아와 관련된 생체 내 미세혈관 병리학을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

숙주 모기 유래 포자동물을 이용한 실험적 뇌성 말라리아의 마우스 모델 생성

결핵 및 말라리아는 인간과 열대 빈곤 인구의 사망률과 사망의 주요 원인에서 가장 널리 감염의 두 가지입니다. 우리는 감염의 자연 경로를 통해 두 병원체 공격 후 마우스에서 말라리아 결핵 동시 감염의 결과를 연구하는 실험 모델 시스템을 구축.

자연의 전송에 결핵 말라리아 동시 감염을 연구하는 실험 모델 결핵균와 변형체 berghei</i

말라리아 전염 모기는 분자 기술을 통해서만 감지할 수 있는 역학적으로 중요한 여러 가지 특성을 가지고 있습니다. MALDI-TOF 기반 SNP 유전형 분석 플랫폼을 활용하여 말라리아 매개체의 여러 주요 특성(종, 살충제 내성, 기생충 감염 및 숙주 선택)을 동시에 검출할 수 있는 분석을 개발했습니다.

말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석

인간 말라리아 기생충에 설치류 말라리아 기생충의 생활 주기 그리고 생물학의 눈에 띄는 유사성 때문에, 설치류 말라리아 모형은 말라리아 연구를 위해 필수불가결하게 되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 야생형 및 형질전환 설치류 말라리아 종의 표현형 분석에 사용되는 가장 중요한 기술중 일부를 표준화하였다.

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

우리 glmS생성 하는 방법에 설명- 변형 체 falciparum 게놈 편집 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 조건부 최저의 돌연변이 체를 기반으로.

CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집

이 양파르트 갈4-UAS 시스템은 Anopheles 감비아에서 기능성 유전 분석을 허용하는 제어된 스파티오 측량 방식으로 유전자 발현을 수정하기 위한 다목적 도구입니다. 이 시스템을 사용하기 위해 설명된 절차는 형광 단백질 마커 및 배아 고정을 위한 pupae의 반 표준화된 복제 전략, 섹스링 및 검열입니다.

Anopheles 감비아에서 기능 유전학을 위한 GAL4-UAS 시스템을 이용하십시오

이 프로토콜은 φC31 시스템을 사용하여 Anopheles 말라리아 모기의 게놈에서 사이트 지향적 인 수정을 달성하는 방법을 설명합니다. 설명된 수정은 attP 베어링 도킹 라인의 게놈에 있는 형질전환 카세트의 통합 그리고 교환둘 다 포함됩니다.

말라리아의 아노필스 벡터에서 사이트 지향 φC31 중재 통합 및 카세트 교환

말라리아는 감염된 모기에 의한 Plasmodium의 sporozoite 단계 접종을 통해 전염됩니다. 형질전환 플라스모디움 은 말라리아의 생물학을 더 잘 이해할 수 있게 해주었고 말라리아 백신 개발 노력에 직접적으로 기여했습니다. 여기에서는 형질전환 Plasmodium berghei sporozoites를 생성하는 간소화된 방법론을 설명합니다.

유전자 변형 Plasmodium berghei Sporozoites 생성

화학 유전학은 표적 유전자좌에서 다른 곁사슬을 포함하는 아미노산으로 게이트키퍼 잔기를 치환하는 것을 포함합니다. 여기에서 우리는 cdpk1 의 hypomorphic 대립 유전자를 포함하는 돌연변이 기생충을 생성하고 돌연변이 배경에서 기생충이 채택한 보상 경로를 확인했습니다.

식물 유사 키나아제의 저형성 대립유전자를 품고 있는 돌연변이 말라리아 기생충의 보상 경로 개발 이해

배우세요 Plasmodium yoelii 유전자 교배 방법을 통해 재조합 후손을 생성하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 말라리아 약물 내성 및 전파력의 유전적 결정인자를 연구하는 데 활용됩니다.

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

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