유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

이 실험 절차의 전반적인 목표는 분리된 마우스 망막 내 유전적으로 표지된 신경절 세포로부터 빛 유발 반응을 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스 안구에서 망막을 박리합니다. 절차의 두 번째 단계는 잔여 유리체를 제거하기 위해 망막을 효소로 처리하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 망막 신경절 세포 측이 위로 향하게 하여 기록 챔버에 장착하고, 챔버를 현미경 스테이지에 고정한 뒤 유전적으로 표지된 신경절 세포를 식별하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 식별된 신경절 세포의 전체 세포 기록(whole cell recording)을 수행하고 빛 유발 반응을 기록하는 것입니다. 궁극적으로, 단일 세포 패치 클램프 기록을 통해 생쥐 망막 내 특정 신경절 세포 유형의 기능적 특성을 보여주고, 해당 세포가 뇌로 전달하는 신호를 정의하는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 미네소타 대학교(University of Minnesota) Paulo Ka Fuji 박사님 연구실의 신경과학 대학원생 티파니 슈미트(Tiffany Schmidt)입니다. 본 기술을 통해 유전적으로 표지된 특정 신경절 세포군을 식별하여 기록하고, 이후 형태학적 분석을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 서로 다른 신경절 세포 하위 유형이 시각 자극의 주요 특징을 어떻게 처리하는지와 같은 시각 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 됩니다. 수술을 수행하기에 앞서,

망막을 제거하기 위해 가장 먼저 수행해야 할 작업은 실험에 필요한 8가지 용액을 혼합하는 것입니다. 본 실험에 사용되는 모든 용액의 성분은 첨부된 텍스트에 제공되어 있습니다. 망막 보관을 위해 extracellular solution 200 milliliters를 250 milliliter 비커에 옮깁니다.

기록 중 중력 관류를 위해 남은 세포외 용액을 분별 깔때기에 넣습니다. 이 두 용액은 항상 95% oxygen, 5% carbon dioxide로 포화 상태를 유지해야 합니다. 실험 중 수지상 돌기를 시각화하려면 LOR 5 94와 같은 형광 추적자를 세포내 용액에 첨가하십시오.

전세포 기록 후 면역조직화학 염색을 수행할 계획이라면, 세포 내 용액에 0.3% neuro biotin을 첨가하십시오. 필요한 용액이 모두 준비되면, 이산화탄소 질식법으로 마우스를 안락사시킨 후, 각도가 있는 2번 포셉을 안구 뒤쪽으로 조심스럽게 삽입하여 안구를 들어 올림으로써 적출하십시오. 안과용 가위를 사용하여 외안근을 제거하고 시신경을 절단하십시오.

안구를 세포외 용액이 채워진 35 millimeter 페트리 접시에 놓습니다. 안과용 가위로 각막을 잘라내고, 5번 포셉을 사용하여 수정체를 꺼냅니다. 5번 포셉으로 공막을 찢어 열고, 망막과 공막이 만나는 지점에서 남은 시신경을 절단합니다.

포셉을 망막과 공막 사이의 공간에 넣어 망막을 안구 컵으로부터 조심스럽게 분리합니다. 시간을 절약하기 위해, 다음 단계로 넘어가기 전 양쪽 망막에 대해 각각의 단계를 수행하십시오. 매우 중요한 단계는 망막에 부착된 유리체를 제거하는 것입니다. 먼저 포셉을 사용하여 망막 위의 투명한 유리체를 잡습니다.

유리체를 성공적으로 제거했다면, 핀셋 끝에 작고 투명한 젤라틴질 물질이 보일 것입니다. 가용 조직의 양을 최대화하고 기록 챔버에 망막을 더 쉽게 장착하기 위해 각 망막을 절반으로 자릅니다. 망막을 상온의 산소 공급된 세포외 용액에 넣고, 컴퓨터 화면에서 나오는 빛과 같은 최소한의 주변광만 허용하여 빛 노출을 최소화하면, 망막은 약 6시간 동안 생존 상태를 유지합니다.

박리 후, 망막 외 조직이 보관된 용액에서 세포외액 500 µL를 취합니다. 여기에 콜라게나제 히알루로니다제 효소 용액의 일정량을 첨가하여 희석합니다.

효소 용액을 35mm 페트리 접시에 넣고, 절제된 망막 중 하나를 페트리 접시로 옮깁니다. 용액에 95% 산소와 5% 이산화탄소를 지속적으로 부드럽게 공급하면서 페트리 접시를 15분 동안 회전시킵니다. 효소 용액은 남아 있는 유리체를 제거하여 신경절 세포층에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 유리체가 적은 어린 동물의 망막을 사용하거나 부작용이 관찰되는 경우, 소화 시간을 5분으로 단축할 수 있습니다.

팁 끝을 자른 플라스틱 전이 피펫을 사용합니다. 효함 함유 배지에서 망막을 꺼냅니다. 망막을 세포외 용액으로 충분히 세척합니다.

망막을 기록 챔버로 옮깁니다. 광수용체 층이 아래를 향하게 한 상태에서 피펫이나 티슈를 사용하여 남아 있는 액체를 흡수하고, 망막의 가장자리를 펴서 조직을 평평하게 만듭니다. 이때 망막의 가장자리만 만져야 하며 신경절 세포 층에는 닿지 않도록 주의합니다.

망막을 고정하려면 나일론 메시가 포함된 백금 링을 망막 위에 배치한 다음, 즉시 챔버를 세포외액으로 채웁니다. 기록 챔버를 현미경 스테이지에 장착하고, 세포외액 중력 관류용 튜브, 진공 흡입 튜브 및 접지선을 연결합니다. 중력을 조절하여 분당 1mL 또는 그 이상의 속도로 액체가 떨어지게 합니다.

관류 속도가 너무 느리면 조직에 산소 공급이 충분히 이루어지지 않아 시냅스 신호 전달이 방해받을 수 있습니다. 다음 단계는 전체 세포 패치 기록(whole cell patch recording)을 위한 전극을 설정하는 것입니다. 3~5 MΩ 범위의 저항을 가진 피펫을 선택하십시오.

해동된 세포 내 용액 분주액을 기록 피펫에 채우고, 10배 대물렌즈 하에서 적외선 조명과 미분 간섭 대비 또는 DIC 광학계를 사용하여 피펫 홀더에 삽입합니다. 망막과 기록 피펫을 시각화합니다. 망막의 가시광선 노출과 광 적응을 최소화하기 위해 적외선을 사용하며, 40배 대물렌즈로 전환하여 전극이 조직 바로 위에 보이도록 맞춥니다.

본 연구에 사용된 마우스 라인은 신경절 세포에서 EGFP를 발현하며, 따라서 신경절 세포는 에피 형광 하에서 관찰 가능합니다. 현미경은 480 nanometers의 에피 형광으로 망막을 조명합니다. 망막이 건강하다면 개별 신경절 세포가 보여야 합니다.

건강하지 않은 망막은 과립형의 큰 핵을 가지고 있으므로 폐기해야 합니다. 기록을 위해 형광 신경절 세포 중 하나를 선택하고, 실험용 테이프를 사용하여 컴퓨터 모니터에 선택한 세포를 표시하십시오. 선택한 신경절 세포체가 보이도록 적외선 광학계로 전환하십시오.

기록 전극을 대상 신경절 세포 근처에 배치합니다. 기록 전극으로 부드럽게 양압을 가해 세포를 직접 덮고 있는 영역을 세척합니다. 전극 압력은 증폭기 제로 상태에서 폴리에틸렌 튜브로 피펫 홀더에 연결된 12 cc 플라스틱 시린지를 통해 가합니다.

모든 전압 오프셋을 제거하십시오. 선택한 신경절 세포 표면에 딤플(dimple)이 나타날 때까지 전극을 세포 위에 배치합니다. 증폭기를 전압 클램프 모드로 설정하고, 테스트 펄스를 가하여 피펫을 통해 흐르는 전류를 모니터링하십시오.

전극과 세포 사이에 씰(seal)을 형성하기 위해 음압을 가합니다. 씰이 형성되기 시작하면 음압을 해제하고, 유지 전류(holding current)가 세포막과 피펫 사이에 기가씰(giga seal)이 형성되었음을 나타낼 때까지 기다립니다. 용량성 과도 현상(capacitive transients)이 나타나 전체 세포 기록 모드(whole cell recording mode)에 진입했음이 확인될 때까지 부드럽게 음압 펄스를 가한 후, 가하던 모든 압력을 해제합니다.

접근 저항이 30 mega ohms보다 큰 경우, 매우 부드러운 음압 펄스를 추가로 가함으로써 이를 완화할 수 있는 경우가 많습니다. whole cell mode가 형성되면 적외선을 끄고 현미경을 검은 천으로 덮으십시오. 세포가 5분 동안 암적응하도록 둡니다.

5분 후면 기록 준비가 완료됩니다. 전류 클램프 모드에서 전면 백색광 자극을 가하고 신경절 세포의 반응을 기록하십시오. 신경절 세포를 여러 번 자극해야 하는 경우, 자극 사이에 필요에 따라 망막이 암적응할 수 있도록 해야 합니다.

이 시점에서 신경절 세포의 반응 특성을 평가하기 위해 광자극을 패턴화된 자극이나 색채 자극으로 수정할 수 있으며, 기록 후 세포 내 용액에 포함된 형광 추적자가 수지상 돌기까지 확산되었을 것이므로 에피 형광(epi fluorescence)과 DIC 적외선 광학계 사이를 전환하여 확인합니다. 추적자는 594 nanometers의 에피 형광 하에서 시각화할 수 있으며, 수지상 돌기를 조사하여 해당 신경절 세포가 on-off형인지 또는 층판형(stratified)인지 결정할 수 있습니다. 세포 내 용액에 첨가된 neuro biotin이 신경절 세포 내로 확산되었으므로, 다음 단계는 면역조직화학 염색을 위해 망막을 준비하는 것입니다.

세포막의 손상을 최소화할 수 있도록 피펫을 조심스럽게 회수하십시오. 준비물당 하나의 망막 신경절 세포만 기록하고 충전하면, 기록된 신경절 세포와 그 상세한 형태학적 구조 사이의 구체적인 상관관계를 도출할 수 있다는 점에 유의하십시오. 다음으로, 망막을 Paraform aldehyde 용액에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 고정하십시오.

고정된 망막을 PBS로 헹구되, 2시간 이상에 걸쳐 PBS 용액을 최소 6회 교체하십시오. 헹굼 단계가 끝나면 망막을 블로킹 용액이 담긴 플레이트로 옮기고, 플레이트를 쉐이커 위에 올려 2시간 동안 둡니다. 상온에서 블로킹 용액을 strep evidence solution으로 교체한 후, 망막을 다시 쉐이커에 올리고 4 °C에서 2일 동안 배양하십시오.

이틀 후, 망막을 마운팅하기 위해 PBS로 20분씩 6회 헹굽니다. Vector shield를 사용하여 망막의 신경절 세포 쪽이 위로 향하게 유리 슬라이드 위에 놓습니다. 마운팅 용액을 덮고 유리 커버 슬립으로 덮은 뒤 매니큐어로 밀봉하면, 라벨링된 신경절 세포를 공초점 현미경으로 관찰할 수 있습니다.

이 그림은 왼쪽의 40배 배율 에피 형광 조명 하에서 그리고 오른쪽의 DIC 조명 하에서 시각화된 GFP 양성 망막 신경절 세포를 보여줍니다. 망막이 건강하고 박리 과정이 성공적이었다면, 고배율 DIC 하에서 개별 신경절 세포들이 보입니다. 건강하지 않은 망막은 핵이 크고 과립형이며, 이러한 샘플은 폐기해야 합니다.

이 그림은 층상 내인성 광민감성 망막 신경절 세포(stratifying intrinsically photosensitive retinal ganglion cell)의 M2 유형에서 전형적으로 나타나는 빛 반응을 보여줍니다. 특정 표본에서 유전적으로 표지된 망막 신경절 세포의 유형에 따라 반응 특성이 달라집니다. 특정 신경절 세포의 시냅스 반응이 온전하다면, 해당 세포는 빛이 켜지거나 꺼질 때 활동 전위로 반응해야 합니다.

본질적으로 광민감성인 신경절 세포의 경우, 지속적인 탈분극이 일어납니다. 뉴로바이오틴(neuro biotin)으로 채워진 신경절 세포의 이 그림은 전형적인 M1-off 층판형 본질적 광민감성 망막 신경절 세포의 형태를 보여줍니다. 전체 세포 기록(whole cell recording) 후 면역조직화학법을 통해 수지상 돌기의 형태와 망막 신경절 세포의 전기생리학적 반응 간의 상관관계를 분석할 수 있습니다. 이 과정을 수행할 때는 시냅스 반응을 보존하기 위해 망막 웰(well)에 산소를 공급하고 조직을 빠르게 관류시키는 것이 중요합니다.

시연 영상을 시청해 주셔서 감사합니다.