Name: 유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: 배우세요 절연된 마우스 망막에서 유전적으로 라벨된 신경절 세포의 빛 반응을 기록하는 방법을. 전체 세포 패치 클램프 기법을 사용하여 특정 신경절 세포 유형의 기능적 특성을 분석하고 뇌로 전달되는 신호를 규명할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 그의 기술 지원 다윈 잡아 주셔서 감사합니다.

동물 사용 정책 : 동물 미네소타 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학 승인 프로토콜을 사용하여, 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 안내서에 설명된 지침에 따라 치료를 받았다. 솔루션 1) 준비 <ol><li> electrophysiological 녹화를 수행하기 전에, 세포 세포와 효소 솔루션 대비해야합니다. </li><li> 세포외 솔루션 : H 2 O 1 L 앤드 중탄산 1.9 g (23 ㎜)과 가루 에임스 '매체의 혼합 한 병 (8.8g) (시그마). 모든 지점에서 세포외 솔루션 95% O 5분의 2 %의 CO 2 가스 혼합물로 포화 수 있습니다. 망막 스토리지 비커 200 ML을 전송합니다. 망막가 탑재되면 중력 재관류에 대한 재관류 시스템 컨테이너에 남아있는 솔루션을 놓으십시오. </li><li> 세포내 솔루션 : 세포 솔루션은 이전에 만들어진 후 aliquoted 500-1000 μL aliquots로하고 -20 ° C.에 저장된 있었어야했는데 125 K - 글루 콘 산, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 나 2 ATP, 0.5 MM NaGTP : 세포 솔루션은 우리가 사용하는 현재 표시된 전류 클램프 레코딩 (MM)를 위해 필요한 실험에 따라 달라집니다 코 5 7.2 산도. 같은 10 μm의 Alexafluor - 594 히드라 지드 (Invitrogen)로 형광 추적기는 실험, 그리고 neurobiotin (0.3 %) 중 dendrites을 시각화에 추가할 수있는 것은 또한 촬영 다음 세포 해부학 분석을 위해 포함될 수 있습니다. 언제 녹음 준비, 세포 솔루션을 녹여. </li><li> 효소 용액 : 세포 솔루션의 ML 4.150에 83 MG의 Hyaluronidase (워싱턴 화학 물질)로 10,000 유닛 Collagenase를 (워싱턴 화학) 결합합니다. -20 ° C. 50 μL aliquots에 저장 Aliquots은 몇 주 동안 사용할 수 있습니다. 때 망막을 치료하는 준비 부풀어 오른 세포외 용액 500 μL로 나누어지는를 희석. </li><li> 인산은 솔루션 (PBS)를 버퍼 : H 2 O 800 ML에서 NaCl의 8g, KCl의 0.2 g, 나 2 HPO 4 1.4 g와 KH 2 PO 4 0.24 g을 추가합니다. NaOH로 pH를 7.4로 가져와. 1 L.로 볼륨을 조정 </li><li> 0.2 M 인산 버퍼 : H 2 O 800 ML에서 나 2 HPO 4 21.8 g과 아니 2 PO 4 6.4 g을 추가합니다. 1 L.에 볼륨을 가지고 </li><li> 4 % Paraformaldehyde 솔루션 : 열 60 50ml H 2 O ° C. , 4g의 paraformaldehyde를 추가합니다 몇 분 동안 저어. 1M NaOH의 몇 방울을 (5 방울) 추가, 솔루션은 분명 때까지 저어 유지. 비커에 50 ML 0.2 M 인산 버퍼를 추가합니다. 산도 스트립을 (~ 7.4)를 사용하여 산도를 확인합니다. 필터와 냉각. </li><li> 차단 솔루션 (10 % 염소 혈청, 0.5 % TritonX100가) : PBS의 1.8 ML에서 염소 혈청 10 μL 트리톤 X - 100 0.2 ML를 추가합니다. TritonX - 100은 조직을 permeabilise을 제공합니다. </li><li> Streptavidin 솔루션 (5 % 염소 혈청, 0.5 % TritonX100, 1:500 Streptavidin 594) : PBS의 1.9 ML에서 염소 혈청 0.1 ML 10 μL 트리톤 X - 100 Streptavidin 594 4 μL를 추가합니다. </li></ol> 마우스 망막 2) 분리 필요한 해부 도구 : 1 # 2 포셉, 2 # 5 포셉, ophthalmologic 가위 <ol><li> 이 경우, 승인된 프로토콜에 따라 마우스를 안락사는 부드럽게 눈 뒤에 직각 # 2 포셉를 삽입하고 눈알을 리프팅로 2 질식과 명백히하다의 안구 CO. </li><li> 세포외 솔루션 35mm 페트리 접시에 안구를 놓습니다. 시신경 및 ophthalmologic 가위를 사용하는 연결된 extraocular 근육이나 결합 조직을 잘라. ophthalmologic 가위로 각막 버려야하고 # 5 포셉를 사용하여 렌즈를 빼낸다. # 5 포셉 한 켤레를 사용하여 공막엔 테어와 망막과 공막엔가 광학 디스크에서 만나 시신경을 도려 포셉을 사용합니다. 부드럽게 멀리 세안 컵에서 망막 껍질. 팁 : 시간을 최소화하기 위해 다음 단계로 이동하기 전에 두 망막의 각 단계를 수행합니다. </li><li> 망막에 부착된 유리를 제거하는 집게를 사용하십시오. 이것은 집게와 망막 위에 투명 유리 "를 잡아"에 의해 수행할 수 있습니다. 유리체는 성공적으로 제거한 경우, 포셉에 대한 명확하고 젤라틴 물질로 표시되어야합니다. 팁 : 유리체의 절반 아래의 제거에 망막을 칼자국 것은 가능한 조직의 양을 극대화하고 쉽게 챔버에 장착하게됩니다. </li><li> 그들이 소화 준비되기 전까지는 최소한의 주변 조명과 어두운 환경에서 상온에서 산소를 세포 솔루션 망막 보관하십시오. 망막은 ~ 6 시​​간 동안 이러한 방식으로 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3) 효소 혼합과 망막의 처리 및 기록 챔버에 장착 <ol><li> 35mm 페트리 접시에 500 μL 세포 솔루션, 장소 솔루션 collagenase / hyaluronidase의 나누어지는을 희석하여 망막을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 망막은 -이 포함되어 유지부드러운 교반과 함께 15 분에 대해 95 % O2 / 5 % CO 2 환경에서 주입 페트리 접시, 커버와 어둠 속에서. 이 단계는 남아있는 유리를 소화에 에이즈와 신경절 세포 레이어에 쉽게 액세스할 수 있습니다. 팁 : 더 적은 유리 또는 불리한 영향을 관찰하는 경우 어린 동물에서 망막에 대해, 시간이 ~ 5 분 정도 단축하실 수 있습니다. </li><li> 효소 함유 매체에서 망막을 제거하고 세포 솔루션에 광범위하게 세척 </li><li> 아래로 향하게 photoreceptor 레이어와 챔버 6 녹음에 망막을 전송합니다. 피펫 또는 조직 중 하나와 함께 남아있는 액체를 멀리 윅 특히 신경절 세포 계층과 접촉을 피하 망막만을 가장자리를 만지지 않도록주의하는 조직을 버리고 망막의 측면을 롤. 조직 앵커 즉시 세포 솔루션으로 챔버를 채우기 위해 망막 이상의 나일론 메쉬와 플래티넘 반지를 놓습니다. </li><li> , 현미경 단계에 기록 챔버 마운트 중력 재관류와 진공 흡입을위한 튜브를 연결하고 접지 와이어를 연결합니다. </li></ol> 4) EGFP 표현 신경절 세포의 현지화 가벼운 자극 <ol><li> 1 ML / 분 또는 더 빠른 속도로 세포 솔루션으로 중력에 의해 망막을 Perfuse. 팁 : 재관류 속도가 너무 느린 경우, 조직은 충분히 산소와 시냅스 신호가 중단될 수 있습니다되지 않습니다. </li><li> 세포내 솔루션으로 녹음 피펫을 기입하여 피펫 홀더에 삽입. 팁 : 3 5MΩ의 범위에서 resistances와 Pipettes이 최상의 결과를 제공합니다. </li><li> 레코딩 피펫을 집중하기 위해 낮은 배율 (10X 목표, NA 0.3)에서 적외선 차등 간섭 대비 (DIC) 광학에서 망막을 시각화. 적외선은 가시 광선이 망막에 노출을 최소화하고 가벼운 적응을 최소화하는 데 사용됩니다. 높은 배율 (40X 목표, NA 0.8)로 이동하고 단지 조직 위의보기에 전극을 가지고. </li><li> 높은 배율 (40X 목적)에서 epifluorescence (EGFP에 대한 480 nm의)와 망막을 조명하고 테이프 (그림 1A)를 사용하여 컴퓨터 모니터에 형광 신경절 세포와 마크를 선택합니다. </li><li> DIC와 적외선 조명에서 대상 신경절 세포 (그림 1A) 근처에 기록 전극을 위치. 청정 지역은 즉시 폴리에틸렌 튜브와 피펫 홀더에 연결된 12cc 플라스틱 주사기를 통해 기록 전극에 부드러운 긍정적인 압력을 적용하여 세포를 덮고. 앰프에 어떤 전압 오프셋을 제로. 플레이스 전극 선택한 신경절 세포에 보조개가 세포 표면에 나타날 때까지. </li><li> 전압 클램프 모드에서 앰프로 테스트 펄스를 적용하고 피펫을 통해 현재의 통과를 모니터링합니다. 전극과 세포 사이에 도장을 만드는 부정적인 압력을 적용합니다. 세포 현재는 세포의 막이과 피펫 사이 GΩ 전기 인감을 나타내는 것입니다 개최 때까지 봉인하고 기다리는 시작하면 부정적인 압력을 릴리스합니다. 용량성 과도가 나타나지 그리고 압력의 모든 응용 프로그램을 릴리스하기 전까지 부정적인 압력을 부드럽게 펄스를 적용합니다. 도움말 : 액세스 (시리즈) 저항 (&gt; 30MΩ) 높으면, 이것은 종종 부정적인 압력을 추가, 아주 부드러운, 펄스에 의해 ameliorated 수 있습니다. </li><li> 일단 안정적인 도장은 부정적인 압력의 펄스를 적용 도달했습니다. 전체 셀 모드가 얻은 후에, 세포는 어두운 5 분 적응할 수 있습니다. 기록, 전체 필드, 흰색 가벼운 자극 (그림 1B)로 현재 클램프 모드, 응답 인치 </li><li> 기록에 따라, Alexafluor - 594은 dendrites으로 확산됩니다. 추적기는 594 nm의에서 epifluorescence에 따라 시각하고 신경절 세포가 여부에 -, epifluorescence 및 DIC 적외선 광학 5 사이의 전환에 의해 오프, 또는 이중 층상. 결정하기 위해 사용할 수 </li><li> neurobiotin가 피펫과 망막은 immunohistochemistry에 대한 처리 될 수 있습니다에 포함되어있다면, 피펫은 부드럽게 막의 최소한의 중단을 제공하기 위해 철회해야합니다. </li></ol> 기록 신경절 세포의 해부학 5) 분석 neurobiotin로 작성하면 다음과 같은 기록 신경절 세포의 형태학의 자세한 분석을 위해 수 있습니다. 팁 : 기록 신경절 세포와 세부 형태 사이의 구체적인 상관 관계가 필요한 경우, 그것이 준비 당 하나의 RGC를 기록하고 작성하는 것이 가장 수 있습니다. <ol><li> neurobiotin은 세포내 솔루션에 포함되어 있었다면 다음 paraformaldehyde 용액에 망막을 배치하고 4 박 수정 ° C. </li><li> , PBS에서 최소한 6 변경 사항을 최소한 2 시간 린스. 차단 솔루션을 포함하는 접시에 망막을 전송합니다. 쉐이크에 2 시간 실내 온도를 솔루션을 차단에 둡니다. </li><li> Streptavidin 솔루션으로 차단 솔루션을 교체합니다. 4 이일 ° 뿌리에서 C를 품어. PBS에서 망막 6 rinses, 20 분 각각 린스. </li><li> 유리 슬라이드에 Vectashield와 망막를 탑재합니다.망막은 신경절 세포와 배치해야합니다. 공촛점 현미경 (그림 1C)을 수행합니다. </li></ol> 대표 결과 망막 건강하고 절개가 성공했다면, 개별 신경절 세포는 높은 배율 (그림 1A)에서 DIC 아래에 표시해야합니다. 건강에 해로운 망막은 큰 과립 핵을하고 폐기해야합니다. 주어진 신경절 세포의 시냅스 반응이 그대로있다면, 세포는 본질적으로 - 감광성의 신경절 세포 (그림 1B), 지속적인 탈분극의 경우, 가벼운 증상에 반응 또는 행동 잠재력과 오프셋과해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 현지화, 녹음, 그리고 찬란 표시 망막 신경절 세포의 얼룩이. (A) GFP 긍정적인 RGC는 40X 배율 (왼쪽 패널)와 DIC 조명 (오른쪽 패널)에서 epifluorescent 조명 아래에서 시각. 찬란 분류 RGC에서 전체 셀 전류 클램프 모드에서 기록된 M2 본질적으로 감광성의 망막 신경절 세포의 (B) 시냅틱 라이트 반응. (C) 전체 셀 녹음 대상 epifluorescence 아래에서 확인되었다 M1 본질적으로 감광성의 망막 신경절 세포는 neurobiotin 가득 다음 immunohistochemistry에 대한 처리.

<ol><li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
<li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li>
<li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li>
<li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+address+book+for+retinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li>
<li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li>
<li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li>
<li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li>
<li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li>
</ol>

이 기술은 격리된 망막 망막 신경절로부터 세포 레코딩에 적용됩니다. 비록 위에서 사용된 마우스 라인에서 본질적으로 감광성의, melanopsin - 표현 RGCs 것은 EGFP 2, 5 표시되며,이 프로토콜은 다른 찬란 표시 RGC 라인 즉시 양도하거나뿐만 아니라 무작위로 선택된 RGCs에서 레코드에 일반 수 있습니다. 각 RGC 및 각 입력 뉴런의 돌기 아버가 전적으로 그대로 유지되기 때문에이 기술은 특히 중요합니다. 녹음은, 쉽게 전류 또는 전압 클램프 모드, 구성 세포에 연결된 또는 느슨한 - 패치에 수행할 수 있습니다, 심지어 nucleated 패치에 사용할 수있는 내부 또는 망막 신경절 세포 점막에서 외부 출력 패치 구성. 이 기술은 쉽게 망막이 항상 녹화하기 전에 RGC 식별 빛에 노출되어야합니다 신경절 세포를 집중하기 위해 더욱 찬란 분류 있질 amacrine 세포 7 비 있질 amacrine 세포에서 형광의 활용 8 하나는 한계를 기록 적응 수 . 외인성...

<table><tbody><tr><td>Ames&amp;rsquo; 배지</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS005273</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>탄산수소나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 Hydrazyde</td><td>Invitrogen</td><td>A10442</td><td></td></tr><tr><td>Neurobiotin</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP1120</td><td></td></tr><tr><td>전극</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>포셉</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>안과용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin 594</td><td>Invitrogen</td><td>S32356</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr></tbody></table>

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

빛이 망막 1 매를과 원추형 photoreceptors을 자극하면 척추 비전의 첫 번째 단계는 이루어집니다. 이 정보는 다음 ON과 OFF 경로로 알려져 있습니다 무엇으로 차별되어 있는데. 빛의 강도 증가 (BCS에서) 또는 감소 (BCS 오프)에 대한 응답으로 depolarize 바이폴라 세포에 photoreceptors 신호 조명 정보 (BCS). 빛의 정보를이 분리들은 오프 BCS 직접 흥분성의 입력을받을 내부 plexiform 층 (IPL), 중 끄기 sublamina에 stratifying dendrites이있는 망막 신경절 세포 (RGCs)의 수준에서 유지 또는 stratifying입니다 그들은 BCS에 직접 흥분성의 입력을받을 IPL의에 sublamina. 조명 (온과 경로 끄기)의 증가 또는 감소에 대한 정보는 이러한 분리는 병렬로 보존하고 뇌에 신호입니다. RGCs은 망막의 출력 세포이며, 따라서 빛의 정보가 두뇌에 시각 핵으로 신호를 얼마나 이해하기 위해 연구하는 중요한 세포입니다. 최근 년간 마우스 유전학의 진보는 특정 RGC 인구가 electrophysiological 녹음 대상 RGC subtypes 2 3 4 특정의 식별이 가능하도록하기 위해서 형광 단백질로 분류 아르 형광 기자 마우스 라인의 다양한 결과있다. 여기, 우리는 그대로 고립되어 망막 준비에 찬란 표시 신경절 세포에서 빛을 응답을 기록하는 방법을 제시. 이 고립된 망막 준비 돌기 아버가 온전하고 전체 RGC 돌기의 아버 전체의 입력이 보존됩니다 RGCs에서 레코딩을 허용합니다. 이 방법은 신경절 세포 subtypes 다양한 걸쳐 적용되며 단일 세포 생리학 기법의 다양한 의무가 있습니다.

이 문서는 해부하다와 마우스에서 분리된 망막 준비에서 기록하는 방법에 대한 설명을 제공합니다. 특히, 우리는 찬란 표시 신경절 세포 인구의 빛을 반응을 기록하고 이후 식별하고 그 형태를 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

척추동물의 시각 작용의 첫 단계는 빛이 망막의 간상 및 원추 광수용기를 자극할 때 일어납니다 1. 이후 이 정보는 ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 분리된 마우스 망막 내 유전적으로 표지된 신경절 세포로부터 빛 유발 반응을 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스 안구에서 망막을 박리합니다. 절차의 두 번째 단계는 잔여 유리체를 제거하기 위해 망막을 효소로 처리하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 망막 신경절 세포 측이 위로 향하게 하여 기록 챔버에 장착하고, 챔버를 현미경 스테이지에 고정한 뒤 유전적으로 표지된 신경절 세포를 식별하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 식별된 신경절 세포의 전체 세포 기록(whole cell recording)을 수행하고 빛 유발 반응을 기록하는 것입니다. 궁극적으로, 단일 세포 패치 클램프 기록을 통해 생쥐 망막 내 특정 신경절 세포 유형의 기능적 특성을 보여주고, 해당 세포가 뇌로 전달하는 신호를 정의하는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 미네소타 대학교(University of Minnesota) Paulo Ka Fuji 박사님 연구실의 신경과학 대학원생 티파니 슈미트(Tiffany Schmidt)입니다. 본 기술을 통해 유전적으로 표지된 특정 신경절 세포군을 식별하여 기록하고, 이후 형태학적 분석을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 서로 다른 신경절 세포 하위 유형이 시각 자극의 주요 특징을 어떻게 처리하는지와 같은 시각 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 됩니다. 수술을 수행하기에 앞서,망막을 제거하기 위해 가장 먼저 수행해야 할 작업은 실험에 필요한 8가지 용액을 혼합하는 것입니다. 본 실험에 사용되는 모든 용액의 성분은 첨부된 텍스트에 제공되어 있습니다. 망막 보관을 위해 extracellular solution 200 milliliters를 250 milliliter 비커에 옮깁니다.기록 중 중력 관류를 위해 남은 세포외 용액을 분별 깔때기에 넣습니다. 이 두 용액은 항상 95% oxygen, 5% carbon dioxide로 포화 상태를 유지해야 합니다. 실험 중 수지상 돌기를 시각화하려면 LOR 5 94와 같은 형광 추적자를 세포내 용액에 첨가하십시오.전세포 기록 후 면역조직화학 염색을 수행할 계획이라면, 세포 내 용액에 0.3% neuro biotin을 첨가하십시오. 필요한 용액이 모두 준비되면, 이산화탄소 질식법으로 마우스를 안락사시킨 후, 각도가 있는 2번 포셉을 안구 뒤쪽으로 조심스럽게 삽입하여 안구를 들어 올림으로써 적출하십시오. 안과용 가위를 사용하여 외안근을 제거하고 시신경을 절단하십시오.안구를 세포외 용액이 채워진 35 millimeter 페트리 접시에 놓습니다. 안과용 가위로 각막을 잘라내고, 5번 포셉을 사용하여 수정체를 꺼냅니다. 5번 포셉으로 공막을 찢어 열고, 망막과 공막이 만나는 지점에서 남은 시신경을 절단합니다.포셉을 망막과 공막 사이의 공간에 넣어 망막을 안구 컵으로부터 조심스럽게 분리합니다. 시간을 절약하기 위해, 다음 단계로 넘어가기 전 양쪽 망막에 대해 각각의 단계를 수행하십시오. 매우 중요한 단계는 망막에 부착된 유리체를 제거하는 것입니다. 먼저 포셉을 사용하여 망막 위의 투명한 유리체를 잡습니다.유리체를 성공적으로 제거했다면, 핀셋 끝에 작고 투명한 젤라틴질 물질이 보일 것입니다. 가용 조직의 양을 최대화하고 기록 챔버에 망막을 더 쉽게 장착하기 위해 각 망막을 절반으로 자릅니다. 망막을 상온의 산소 공급된 세포외 용액에 넣고, 컴퓨터 화면에서 나오는 빛과 같은 최소한의 주변광만 허용하여 빛 노출을 최소화하면, 망막은 약 6시간 동안 생존 상태를 유지합니다.박리 후, 망막 외 조직이 보관된 용액에서 세포외액 500 µL를 취합니다. 여기에 콜라게나제 히알루로니다제 효소 용액의 일정량을 첨가하여 희석합니다.효소 용액을 35mm 페트리 접시에 넣고, 절제된 망막 중 하나를 페트리 접시로 옮깁니다. 용액에 95% 산소와 5% 이산화탄소를 지속적으로 부드럽게 공급하면서 페트리 접시를 15분 동안 회전시킵니다. 효소 용액은 남아 있는 유리체를 제거하여 신경절 세포층에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 유리체가 적은 어린 동물의 망막을 사용하거나 부작용이 관찰되는 경우, 소화 시간을 5분으로 단축할 수 있습니다.팁 끝을 자른 플라스틱 전이 피펫을 사용합니다. 효함 함유 배지에서 망막을 꺼냅니다. 망막을 세포외 용액으로 충분히 세척합니다.망막을 기록 챔버로 옮깁니다. 광수용체 층이 아래를 향하게 한 상태에서 피펫이나 티슈를 사용하여 남아 있는 액체를 흡수하고, 망막의 가장자리를 펴서 조직을 평평하게 만듭니다. 이때 망막의 가장자리만 만져야 하며 신경절 세포 층에는 닿지 않도록 주의합니다.망막을 고정하려면 나일론 메시가 포함된 백금 링을 망막 위에 배치한 다음, 즉시 챔버를 세포외액으로 채웁니다. 기록 챔버를 현미경 스테이지에 장착하고, 세포외액 중력 관류용 튜브, 진공 흡입 튜브 및 접지선을 연결합니다. 중력을 조절하여 분당 1mL 또는 그 이상의 속도로 액체가 떨어지게 합니다.관류 속도가 너무 느리면 조직에 산소 공급이 충분히 이루어지지 않아 시냅스 신호 전달이 방해받을 수 있습니다. 다음 단계는 전체 세포 패치 기록(whole cell patch recording)을 위한 전극을 설정하는 것입니다. 3~5 MΩ 범위의 저항을 가진 피펫을 선택하십시오.해동된 세포 내 용액 분주액을 기록 피펫에 채우고, 10배 대물렌즈 하에서 적외선 조명과 미분 간섭 대비 또는 DIC 광학계를 사용하여 피펫 홀더에 삽입합니다. 망막과 기록 피펫을 시각화합니다. 망막의 가시광선 노출과 광 적응을 최소화하기 위해 적외선을 사용하며, 40배 대물렌즈로 전환하여 전극이 조직 바로 위에 보이도록 맞춥니다.본 연구에 사용된 마우스 라인은 신경절 세포에서 EGFP를 발현하며, 따라서 신경절 세포는 에피 형광 하에서 관찰 가능합니다. 현미경은 480 nanometers의 에피 형광으로 망막을 조명합니다. 망막이 건강하다면 개별 신경절 세포가 보여야 합니다.건강하지 않은 망막은 과립형의 큰 핵을 가지고 있으므로 폐기해야 합니다. 기록을 위해 형광 신경절 세포 중 하나를 선택하고, 실험용 테이프를 사용하여 컴퓨터 모니터에 선택한 세포를 표시하십시오. 선택한 신경절 세포체가 보이도록 적외선 광학계로 전환하십시오.기록 전극을 대상 신경절 세포 근처에 배치합니다. 기록 전극으로 부드럽게 양압을 가해 세포를 직접 덮고 있는 영역을 세척합니다. 전극 압력은 증폭기 제로 상태에서 폴리에틸렌 튜브로 피펫 홀더에 연결된 12 cc 플라스틱 시린지를 통해 가합니다.모든 전압 오프셋을 제거하십시오. 선택한 신경절 세포 표면에 딤플(dimple)이 나타날 때까지 전극을 세포 위에 배치합니다. 증폭기를 전압 클램프 모드로 설정하고, 테스트 펄스를 가하여 피펫을 통해 흐르는 전류를 모니터링하십시오.전극과 세포 사이에 씰(seal)을 형성하기 위해 음압을 가합니다. 씰이 형성되기 시작하면 음압을 해제하고, 유지 전류(holding current)가 세포막과 피펫 사이에 기가씰(giga seal)이 형성되었음을 나타낼 때까지 기다립니다. 용량성 과도 현상(capacitive transients)이 나타나 전체 세포 기록 모드(whole cell recording mode)에 진입했음이 확인될 때까지 부드럽게 음압 펄스를 가한 후, 가하던 모든 압력을 해제합니다.접근 저항이 30 mega ohms보다 큰 경우, 매우 부드러운 음압 펄스를 추가로 가함으로써 이를 완화할 수 있는 경우가 많습니다. whole cell mode가 형성되면 적외선을 끄고 현미경을 검은 천으로 덮으십시오. 세포가 5분 동안 암적응하도록 둡니다.5분 후면 기록 준비가 완료됩니다. 전류 클램프 모드에서 전면 백색광 자극을 가하고 신경절 세포의 반응을 기록하십시오. 신경절 세포를 여러 번 자극해야 하는 경우, 자극 사이에 필요에 따라 망막이 암적응할 수 있도록 해야 합니다.이 시점에서 신경절 세포의 반응 특성을 평가하기 위해 광자극을 패턴화된 자극이나 색채 자극으로 수정할 수 있으며, 기록 후 세포 내 용액에 포함된 형광 추적자가 수지상 돌기까지 확산되었을 것이므로 에피 형광(epi fluorescence)과 DIC 적외선 광학계 사이를 전환하여 확인합니다. 추적자는 594 nanometers의 에피 형광 하에서 시각화할 수 있으며, 수지상 돌기를 조사하여 해당 신경절 세포가 on-off형인지 또는 층판형(stratified)인지 결정할 수 있습니다. 세포 내 용액에 첨가된 neuro biotin이 신경절 세포 내로 확산되었으므로, 다음 단계는 면역조직화학 염색을 위해 망막을 준비하는 것입니다.세포막의 손상을 최소화할 수 있도록 피펫을 조심스럽게 회수하십시오. 준비물당 하나의 망막 신경절 세포만 기록하고 충전하면, 기록된 신경절 세포와 그 상세한 형태학적 구조 사이의 구체적인 상관관계를 도출할 수 있다는 점에 유의하십시오. 다음으로, 망막을 Paraform aldehyde 용액에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 고정하십시오.고정된 망막을 PBS로 헹구되, 2시간 이상에 걸쳐 PBS 용액을 최소 6회 교체하십시오. 헹굼 단계가 끝나면 망막을 블로킹 용액이 담긴 플레이트로 옮기고, 플레이트를 쉐이커 위에 올려 2시간 동안 둡니다. 상온에서 블로킹 용액을 strep evidence solution으로 교체한 후, 망막을 다시 쉐이커에 올리고 4 °C에서 2일 동안 배양하십시오.이틀 후, 망막을 마운팅하기 위해 PBS로 20분씩 6회 헹굽니다. Vector shield를 사용하여 망막의 신경절 세포 쪽이 위로 향하게 유리 슬라이드 위에 놓습니다. 마운팅 용액을 덮고 유리 커버 슬립으로 덮은 뒤 매니큐어로 밀봉하면, 라벨링된 신경절 세포를 공초점 현미경으로 관찰할 수 있습니다.이 그림은 왼쪽의 40배 배율 에피 형광 조명 하에서 그리고 오른쪽의 DIC 조명 하에서 시각화된 GFP 양성 망막 신경절 세포를 보여줍니다. 망막이 건강하고 박리 과정이 성공적이었다면, 고배율 DIC 하에서 개별 신경절 세포들이 보입니다. 건강하지 않은 망막은 핵이 크고 과립형이며, 이러한 샘플은 폐기해야 합니다.이 그림은 층상 내인성 광민감성 망막 신경절 세포(stratifying intrinsically photosensitive retinal ganglion cell)의 M2 유형에서 전형적으로 나타나는 빛 반응을 보여줍니다. 특정 표본에서 유전적으로 표지된 망막 신경절 세포의 유형에 따라 반응 특성이 달라집니다. 특정 신경절 세포의 시냅스 반응이 온전하다면, 해당 세포는 빛이 켜지거나 꺼질 때 활동 전위로 반응해야 합니다.본질적으로 광민감성인 신경절 세포의 경우, 지속적인 탈분극이 일어납니다. 뉴로바이오틴(neuro biotin)으로 채워진 신경절 세포의 이 그림은 전형적인 M1-off 층판형 본질적 광민감성 망막 신경절 세포의 형태를 보여줍니다. 전체 세포 기록(whole cell recording) 후 면역조직화학법을 통해 수지상 돌기의 형태와 망막 신경절 세포의 전기생리학적 반응 간의 상관관계를 분석할 수 있습니다. 이 과정을 수행할 때는 시냅스 반응을 보존하기 위해 망막 웰(well)에 산소를 공급하고 조직을 빠르게 관류시키는 것이 중요합니다.시연 영상을 시청해 주셔서 감사합니다.

an-isolated-retinal-preparation-to-record-light-response-from

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 수생 호랑이 도롱뇽의 망막 통에 전체 셀 전압 클램프 레코딩 과정을 보여줍니다. 우리는뿐만 아니라 망막의 시각적인 자극하는 동안 패치 클램프 레코딩을 수행하는 방법으로 슬라이스의 준비를 보여줍니다.

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

우리는 그대로 마우스 망막에서 막대와 원뿔 photoresponses를위한 transretinal electroretinogram (에르그) 레코딩 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 가벼운 반응을 분리하고 분리된 평면 마운트 망막에 걸쳐 배치 필드 전극을 사용하여 그들을 기록하는 photoreceptors에서 시냅스 전송 블록의 활용합니다.

마우스 망막에서 Transretinal 에르그 레코딩 :로드 및 원뿔 Photoresponses

이 문서는 그대로 마우스 망막에서 찬란 태그의 연결 인구에서 각각의 세포의 녹음을 묘사. 두 광자 여기 적외선을 사용하여 transgenetically 라벨이 세포들은 빛의 반응, 수용 필드 속성 및 형태학을 연구하기 위해 패치 - 클램프 녹음 대상으로했다.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

출처: Laboissonniere, et. al입니다. 망막 신경절 세포의 정의된 부분 집합의 단일 세포 RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).   이 비디오는 형질전환 마우스 망막에서 망막 신경절 세포(RGC) 아형을 식별하는 형광 추적 기술을 보여줍니다. 이 프로세스에는 기록 챔버에 분리된 망막을 고정하고, 산소 관류로 세포 생존력을 유지하고, 추적자가 있는 피펫을 사용하여 형광 표지된 망막 신경절 세포를 표적으로 하는 것이 포함됩니다. 이 방법은 수지상 형태 및 성층화를 분석함으로써 별개의 망막 신경절 세포 아형을 분류할 수 있습니다.

Identification of Mouse Retinal Ganglion cell subtypes via fluorescent tracing (형광 추적을 통한 마우스 망막 신경절 세포 아형의 식별)

이 비디오 문서에서는 세포 기관을 패치하는 셋업 절차 및 방법 전체 마운트 마우스 망막의 신경절 세포에서 동적 클램프 레코딩을 구현하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 흥분성과 억제 시냅스 입력의 정확한 기여도 조사 및 신경 스파이크에 대한 상대적인 크기와 타이밍을 할 수 있습니다.

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

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녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

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수백만 명의 사람들이 망막 퇴행성 질환으로 고통 받아 돌이킬 수없는 실명을 경험합니다. 이 질병의 많은 공통점은 망막 신경절 세포 (RGCs)의 소실이다. 이 상세한 프로토콜은 유동 세포 계측법을 이용한 양성 및 음성 선택에 의한 1 차 쥐 RGC의 분리를 기술합니다.

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