2010년 11월 11일
여기, 우리는 효율적인 cryopreservation을위한 방법을 설명하고 매우 풍부한 문화의 연결을 생성하는 대뇌 피질의 뇌 조직 블록의 해동. 이 간단한 프로토콜은의 연결을 astrocyte와의 연결을 전구체 세포 배양 이후 세대 유연성을 제공합니다.
안녕하세요, 제 이름은 Alan이고 University of California Irvine의 신경생물학 및 행동학과의 Horney Lu 박사 연구실입니다. 그리고 저는 밥입니다. 오늘 Dr.Haro는 고품질 1차 신경 세포 배양의 후속 변성을 위한 피질 조직 블록의 일상적인 동결 보존을 위한 빠르고 효율적이며 신뢰할 수 있는 프로토콜을 보여줄 것입니다.
시작하겠습니다. 세척 및 다진 조직은 10% TMSO를 함유한 극저온 바이알에 적재됩니다. 냉동 매체.
극저온 바이알은 냉동 용기에 적재되어 최소 4시간 동안 섭씨 영하 80도에 놓입니다. 그런 다음 냉동 냉동 바이알을 액체 질소에 넣어 장기간 보관합니다. 배양을 위해 AC 크라이오 바이알을 따뜻한 수조에서 녹이고 따뜻한 HBSS로 헹궈 남아 있는 DMSO를 제거합니다.
해리를 위한 tryin d ns와 함께 새로운 HBSS가 추가된 후 EBS가 10%인 DMM이 추가됩니다. 해리성 효소 활성을 중지하기 위해 세포를 회전시키고 펠릿을 신선한 DMM과 10%EBS에 재현탁시키고 사전 코팅된 폴리리신 접시에 도금합니다. 24시간 후, DMM은 보충된 신경 기저 배지로 변경되고 10일 동안 성장합니다.
이 프로토콜은 사용하기 전에 피질 조직을 절단하기 위해 강철 면도날을 사용합니다. 면도기는 최소 2시간 동안 70% 에탄올로 살균해야 합니다. Hank의 완충 염 용액 HBSS는 10 x 스톡 용액을 멸균 된 물에 희석하여 생성되며, 1 개의 X-H-B-S-S는 조직 처리 될 때까지 얼음 또는 섭씨 4도에서 보관됩니다.
디메틸 황산화물 또는 DMSO는 동결 매체에서 보호되는 극저온으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 10%의 부피 및 부피 희석을 사용합니다: 하나의 X-H-B-S-S-D-M-S-O는 섭씨 4도에서 저장하기 전에 완전히 혼합되어야 합니다. Nalgene 및 냉동 용기는 샘플의 동결 속도를 제어하는 데 사용됩니다.
냉동 용기에는 사전에 라벨이 부착된 2.5ml 극저온 바이알이 적재되어 있습니다. 냉동 용기가 두 개 이상인 경우 냉동 용기 자체에 라벨을 붙이고 담즙에 해당 용기를 기록하는 것도 좋은 생각입니다. 이전에 냉각된 10% DMSO, 동결 매체 및 냉동 용기는 멸균 생물학적 안전 캐비닛으로 옮겨집니다.
여기에서 1ml의 동결 매체를 각 극저온 바이알에 천천히 추가합니다.캡이 단단히 고정되었는지 확인한 후 조직 처리 직전 최소 2시간 동안 바이알이 있는 냉동 용기를 섭씨 4도에 놓습니다. 이전에 멸균된 면도날은 철저히 헹궈야 합니다. 세 번, 세 번 씻습니다.
멸균된 물을 사용하면 남아 있는 에탄올을 충분히 제거할 수 있습니다. 이 세척 절차는 면도기가 장기간 침수와 멸균수로 인해 산화되기 쉽기 때문에 빨라야 합니다. 청소하기 전에 티슈를 얼음 팩에 올려 놓아야 합니다.
차가운 X-H-B-S-S로 살짝 헹구어 자유롭게 떠다니는 파편을 제거합니다. 멸균된 바늘은 남아 있는 막과 혈관의 조직 조각을 청소하는 데 사용됩니다. 청소하는 동안 조직의 구조적 무결성을 보존하기 위해 주의를 기울여야 합니다.
이것이 증가함에 따라 깨끗한 조직을 자르는 효율성은 원시 조직과 눈에 띄게 다르며 대부분의 막이나 혈관을 제거해야 합니다. 티슈를 세척하고 헹구고 나면 자르기를 시작할 수 있습니다. 약 1mm 크기의 블록을 만드는 조직을 깨끗하게 자르는 것이 중요합니다.
너무 큰 블록은 해동 시 세포 수율이 낮습니다. 그러나 더 작은 블록은 과도한 처리도 피해야 합니다. 다진 조직은 자동 피펫과 멋진 X-H-B-S-S를 사용하여 수집 할 수 있습니다.
수집된 모든 조직을 회수하기 위해 HBSS로 접시를 헹굽니다. 그런 다음 조직을 많은 양의 X-H-B-S-S에 넣고 바닥으로 떨어뜨려 느슨하게 포장된 펠릿을 만듭니다. 이렇게 하면 조직이 HBSS에 침전될 때 존재할 수 있는 잔여물을 청소하고, 조직을 할당하기 전에 이전에 냉각된 냉동 용기 및 극저온 바이알을 회수합니다.
조직을 채우는 과정을 서두르기 위해 모든 바이알의 뚜껑을 열어야 합니다. 실온에서 DMSO에 대한 노출은 10분 이하로 제한해야 합니다. 모든 조직이 사용될 때까지 한 번에 하나의 냉동 용기로 작업하는 것이 좋습니다.
느슨한 조직의 상층을 흡인하기 시작하고, 옥수수를 방해하지 않고 가능한 한 펠릿에 가깝게 펠릿 옥수수를 빽빽하게 빽빽이 빽빽하게 한다. 그런 다음 200마이크로리터 너비의 오리피스 팁을 피펫에 끼웁니다. 더 작은 팁 오리피스는 조직 블록 펠릿의 바닥으로 가는 블록의 구조를 손상시킬 수 있으므로 사용하지 마십시오.
200마이크로리터의 조직을 천천히 수집합니다. 이 조직을 극저온 바이알에 추가하고 모든 바이알이 채워질 때까지 다음 조직으로 이동합니다. 10분 규칙이 필요할 수 있습니다.
냉동 용기를 섭씨 80도의 마이너스 냉동고인 극저온 바이알에 최소 4시간 동안 또는 시간이 제한된 경우 하룻밤 동안 빠르게 놓습니다. 충분한 시간이 지난 후 냉동실에서 냉동 용기를 꺼내 가능한 한 빨리 극저온 상자에 극저온 바이알을 할당하십시오. 장기 보관을 위해 극저온 상자를 액체 질소 상자 랙에 넣습니다.
가능한 한 빨리 액체 질소에서 극저온 바이러스를 제거하여 극저온 상자를 제한합니다.실온에 노출되면 섭씨 37도의 수조에 담가 샘플이 빠르게 녹습니다. 항상 캡을 물 위에 두십시오. 자주 확인하고 작은 얼음 P가 관찰될 때까지 해동하십시오.
안전 캐비닛에 넣기 전에 cryo vile을 70% 에탄올로 살균하십시오. 조직이 cryo vile의 벽에 남아 있는 경우 많은 양의 따뜻한 X-H-B-S-S에 해동 조직을 추가합니다. HBSS로 부드럽게 수집됩니다.
일단 모든 조직이 수집되었습니다. 튜브를 3-4회 뒤집고 조직이 바닥에 가라앉도록 합니다. 이 단계는 DMSO의 충분한 희석을 보장합니다.
조직이 안정되면 슈퍼 나틴을 최대한 많이 흡인합니다. 그런 다음 여기에 따뜻하고 신선한 X-H-B-S-S 10ml를 추가합니다. 300마이크로리터의 0.25%트립신과 50마이크로리터의 DNA를 추가합니다.
부드러운 교반으로 조직을 해리하여 조직이 해리된 후 흐린 세포 현탁액을 생성합니다. 1200G에서 5분 동안 따뜻한 DM과 10% 농축 소 혈청 EPS 원심 세포 현탁액을 추가하여 효소 활성을 중지합니다. 세포 펠릿을 새로운 DMEM에 10%EBS를 더한 상태로 재현탁하고 폴리리신 코팅된 플레이트로 플레이트합니다.
세포가 접시에 30분 동안 부착되도록 합니다. 그런 다음 미디어를 새 DM과 10%EBS로 교체합니다. 24시간 후, DM이 함유된 배지를 N 2 및 B 27이 보충된 신경 기저 배지로 교체하고 10일 동안 성장합니다.
우리는 피질 조직 블록의 일상적인 울음 보존과 함께 방대하고 효율적이며 신뢰할 수 있는 프로토콜에 대해 자세히 설명했습니다. 행운을 빕니다.
이 기사는 피질 뇌 조직 블록의 효율적인 동결 보존 및 해동 방법을 제시하여 농축된 뉴런 배양물의 생성을 용이하게 합니다. 이 프로토콜은 뉴런, 성상교세포 및 뉴런 전구체 세포 배양물의 후속 배양을 가능하게 합니다.
Standardized cryopreservation of cortical tissue blocks enables reliable generation of highly enriched neuronal cultures, supporting consistent early discovery and assay development in neurobiology-focused R&D. This protocol increases operational flexibility and resource efficiency by decoupling tissue collection from downstream culture initiation, reducing biological variability and supporting scalable, reproducible workflows. The approach is directly relevant for biopharma teams seeking robust, bankable sources of primary neuronal and glial cells for target validation and screening.
This cryopreservation protocol positions tissue banking as a foundational capability from early discovery through preclinical research, enabling on-demand generation of neuronal and glial cultures for diverse R&D needs.