Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

이 절차의 전반적인 목표는 포유류 세포에서 mRNA 핵 수출의 동역학을 측정하는 것입니다. 이는 포유류 조직 배양 세포의 핵에 mRNA 또는 DNA를 먼저 마이크로 주입함으로써 달성됩니다. 미세주입 후, 샘플은 다양한 배양 기간 후에 고정됩니다.

그런 다음 mRNA는 형광 현장 교잡 또는 물고기에 의해 염색됩니다. 절차의 마지막 단계는 세포를 이미지화하고 세포질과 핵의 형광량을 정량화하는 것입니다. 궁극적으로 mRNA 내보내기 속도는 마이크로 주입과 형광 현미경의 조합을 통해 측정할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 토론토 대학교 생화학과 Alex Palazzo 연구실의 SRG AV입니다. 저는 Palazzo Lab의 Stefan Toski입니다. 저는 Palazzo 실험실의 Amy이고 Palazzo 실험실의 Khi Maha David입니다.

오늘 우리는 미세 주입을 통해 포유류 조직 배양 세포의 핵에 mRNA를 도입하는 절차를 보여 드리겠습니다. 또한 C 2 혼성화에서 형광으로 mRNA를 염색하는 방법을 시연합니다. 우리는 실험실에서 이러한 절차를 사용하여 포유류 세포에서 mRNA 핵 수출의 동역학을 연구합니다.

시작하겠습니다. 마이크로주입 듀트 이전에는 주입 버퍼에서 밀리리터당 50-200마이크로그램 사이의 혈장 DNA를 준비했습니다. 다음으로 Oregon Green 4 88 또는 OG를 70 킬로달톤 덱스트란과 혼합물에 접합하여 주입 된 세포를 식별 할 수 있습니다.

OG 접합 덱스트란은 핵에 주입된 유체의 양과 세포질 원심분리기로 누출된 양을 결정하는 데 도움이 됩니다. 13, 000 G 및 섭씨 4도에서 최소 20 분 동안 샘플을 사용하여 바늘 끝을 잠재적으로 방해 할 수있는 미립자 물질을 펠릿으로 만듭니다. 서면 프로토콜 비용에 설명된 기준에 따라 마이크로 주입할 포유류 세포주를 선택합니다.

이 시연 시드에는 7개의 셀이 사용됩니다. 산으로 세척된 덮개의 세포는 미세 주입 최소 24시간 전에 30mm 페트리 접시에서 미끄러집니다. 이상적으로, 세포 단층은 주입된 세포를 쉽게 식별할 수 있도록 주입 시 대략 70-90% 합류해야 하며, 세포 단층은 200마이크로리터 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 주입 전에 상처를 입습니다.

커버 슬립에 십자 상처를 에칭하고 주입 전 최소 15분 동안 조직 배양 인큐베이터에서 세포가 회복되도록 둡니다. 미세주입의 경우, 미세주입 과정에 방해가 될 수 있는 진동을 최소화하기 위해 공기 테이블에 격리된 도립 현미경을 사용하십시오. einor 겔 로더 팁을 사용하여 원심분리기 샘플의 상단에서 약 1마이크로리터를 제거하여 펠릿이 중단되지 않도록 합니다.

피펫 끝을 조립식 미세주입 바늘의 뒤쪽 끝에 삽입하고 액체를 배출합니다. 액체는 모세관 작용에 의해 바늘 끝으로 당겨집니다. 끝 부분의 반월판은 5초에서 30초 이내에 볼 수 있어야 합니다.

액체로 채워진 바늘을 막대에 넣고 clamp 마이크로 매니퓰레이터에 넣습니다. 45도 각도에서 10 x 대물렌즈를 사용하여 바늘을 시각화하고 초점면 근처의 시야 중앙에 배치합니다. 거친 마이크로 매니퓰레이터 손잡이를 사용하여 지팡이는 튜브로 유리 주사기에 연결되며, 이는 바늘 끝에서 유체를 배출하는 데 필요한 압력을 생성하는 데 사용됩니다.

일정한 압력을 유지하기 위해 주사기는 파이프 클램프에 장착됩니다. 두 개의 고무 마개와 두 개의 금속 클램프를 사용하여 바늘을 몇 밀리미터 올려 이후 단계에서 손상되지 않도록 한 다음 현미경을 뒤로 밀어 넣습니다. 기둥, 주사기 플런저를 눌러 압력을 높입니다.

0.5에서 2 입방 센티미터. 상처 입은 단층이 있는 커버 슬립이 들어 있는 페트리 접시를 놓습니다. 에 viewstage, 현미경을 뒤로 당깁니다.

기둥을 앞으로 세우면 콘덴서가 바늘에 정렬되어 액체로 들어갑니다. 이것은 커버 슬립에서 바늘이 부러지지 않도록 조심스럽게 수행해야 합니다. 10 x 대물렌즈를 사용하여 교차 상처의 중심을 식별하고 주사할 세포 위에 바늘을 놓습니다.

40 x 대물렌즈로 전환하여 배율을 높입니다. 그런 다음 조이스틱의 미세 조정 손잡이를 사용하여 바늘을 내리고 중앙에 놓습니다. 바늘을 내려 핵과 접촉하여 상처 십자가의 한쪽 모서리에서 주입을 시작합니다.

일단 주입되면 세포는 위상 밝기에 현저한 변화를 일으킵니다. 상처 십자가의 한쪽 가장자리를 따라 계속하십시오. 시각화하는 동안 주입된 세포를 쉽게 식별하려면 각 바늘에 대해 주입 압력을 적절하게 조정하는 것이 중요합니다.

압력은 원형질과 핵막을 뚫을 수 있을 만큼 높아야 하지만 세포를 죽일 정도로 높아서는 안 됩니다. 고정된 시간 동안 상처 가장자리를 따라 세포를 마이크로 주입합니다. 연습을 통해 이 간격 동안 수백 개의 세포를 주입할 수 있습니다.

혈장 DNA를 주입하는 경우, 미세 주입된 세포를 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 고정 전 20분 동안 배양한 다음 전사를 종료합니다. 세포를 밀리리터 알파당 1마이크로그램으로 처리하여 성장 배지에 용해된 만틴을 사용합니다. 이 농도는 마이크로 주입된 플라스미드의 전사를 효과적으로 억제합니다.

세포를 다시 인큐베이터에 넣고 세포가 새로 합성된 mRNA를 내보낼 수 있도록 합니다. 단일 바늘을 재사용하여 여러 개의 커버 슬립을 주입할 수 있습니다. 마이크로 주입된 DNA 또는 RNA의 유형이 변경된 경우 바늘을 교체해야 합니다.

또한, 바늘이 지팡이에서 제거되면 mRNA 핵 수출 역학의 정확한 측정을 위해 폐기해야 합니다. 별도의 샘플은 0분, 15분, 30분, 60분 및 120분으로 고정해야 합니다. 적절한 시간에 알파 마닌 치료 후 성장 배지를 흡인하고 PBS 용액 2ml에 세포를 두 번 세척합니다.

덮개 슬립이 액체에 잠기지 않는 시간을 최소화하여 덮개를 촉촉하게 유지하는 것이 중요합니다. PBS에 2ml의 4%알데히드를 첨가하여 세포를 고정하고 실온에서 최소 15분 동안 세포를 배양합니다. 고정 된 샘플을 PBS에서 0.1 % Triton X 100의 2 밀리리터로 세포를 투과시킨 후 다시 실온에서 최소 15 분 동안 세포를 배양합니다.

마지막으로, 샘플을 두 번 더 세척하여 혼성화를 위해 샘플을 준비합니다. 25-60 %를 함유 한 하나의 XSSC 용액의 세척 버퍼로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 150mm 페트리 접시의 바닥을 물로 덮고 그 위에 파라폼 조각을 띄워 혼성화를 위해 염색 챔버를 준비합니다.

접시를 뒤집어 물을 제거하여 파라폼이 접시 바닥에 부착되도록 합니다. 얼룩이 질 각 커버 슬립의 기포를 수동으로 제거합니다. 피펫 : 100 마이크로 리터의 혼성화 용액을 파라 폼에 떨어 뜨립니다.

포마지의 양은 집게의 도움으로 사용되는 특정 물고기 프로에 맞게 최적화되어야 합니다. 30mm 페트리 접시에서 고정 셀이 있는 커버 슬립을 제거합니다. watman 여과지를 사용하여 커버 슬립의 뒷면을 말리고 셀을 건조시키지 않고 앞면에서 여분의 버퍼를 심어줍니다.

그런 다음 덮개 슬립을 생선 용액에 뒤집어 놓습니다. 각 커버 슬립에 대해 이 과정을 반복합니다. 염색 챔버 뚜껑을 다시 씌운 후 섭씨 37도에서 5-18시간 동안 샘플을 배양합니다.

염색 챔버를 준비한 것과 동일한 방식으로 여러 세척 챔버를 준비하고, 각 커버에 대해 1ml의 세척 버퍼를 세척 챔버의 파라폼에 슬립 피펫으로 밀어 넣습니다. 배양 후 1ml의 세척 완충액을 피펫팅하여 염색 챔버에서 커버 슬립을 제거합니다. 커버 슬립 옆에, 액체는 모세관 작용에 의해 각 샘플 아래로 당겨져야 합니다.

그런 다음 집게로 커버 슬립을 제거하고 각각 5분 동안 실온에서 배양된 세척 버퍼 한 방울에 놓습니다. 각 커버 슬립을 두 번 더 세척하여 각 커버 슬립 피펫에 대해 총 3회 세척 피펫을 이전에 세척한 슬라이드에 dappy와 함께 사용합니다. 각 슬라이드는 집게와 watman 여과지를 사용하여 두 개의 커버 슬립을 수용할 수 있습니다.

커버 슬립의 뒷면을 건조시키고 커버 앞면에서 과도한 액체를 흡수하여 샘플을 건조시키지 않고 미끄러뜨립니다. 각 덮개 슬립 면이 아래를 향하도록 하여 장착 용액 한 방울에 놓습니다. 장착된 시료는 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다.

여기서 주입된 플라즈마 DNA의 전사에 대한 알파 만틴의 효과는 NIH가 다양한 농도의 알파 만틴으로 전처리된 3개의 T 3개의 섬유아세포 세포를 보여주었습니다. TFL의 델타 i, 플라스미드 DNA 및 OG를 접합 70 킬로 및 덱스트란을 주입하였다. 각 행은 OG 70 킬로달톤 덱스트란 및 T uts 델타 I mRNA에 대해 이미지화된 단일 시야에 해당합니다.

약물의 고농도는 T UTS 델타 I 전사체의 생성을 완전히 억제하는 반면, 이는 낮은 농도에서는 관찰되지 않았음이 분명합니다. 표시. 다음은 mRNA 핵 수출 비용의 시간 경과입니다. 7개의 세포에 T UTS 델타 i 플라즈마 DNA와 OG가 70킬로달톤 덱스트란을 접합하여 주입했습니다.

주입 후 30분 후 세포를 알파 만틴으로 처리하고 섭씨 37도에서 0분, 60분 및 120분 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 고정하고 T UTS 델타 I mRNA에 대한 프로브로 염색했습니다. 그리고 ER 마커 트랩 알파에 대한 항체가 있으면 각 행은 단일 세포 필드에 해당합니다.

mRNA 내보내기를 정량화하는 방법에 대한 자세한 내용은 여기에서 온라인 텍스트를 참조하십시오. 120분이라는 시점이 날아갔습니다.er에서 TFS delta I mRNA의 공동 국소화를 보여주기 위해 T UTS delta I mRNA의 오버레이가 녹색으로, 트랩 알파가 빨간색으로 표시됩니다. 단백질로 mRNA를 염색하는 방법에 대한 정보는 온라인 텍스트에서 찾을 수 있습니다.

방금 미세주입으로 mRNA의 핵 수출 동역학을 측정하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 성공적인 미세주입을 위해서는 적절한 준비가 필요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. DNA 및 RNA, 시료 준비, 바늘 당기기, 광학 장비 정렬 및 미세 주입 문제 해결과 같은 주요 단계는 당사의 서면 프로토콜에 설명되어 있습니다.

마이크로 주입된 mRNA를 이미징하고 분석할 때 주입된 액체의 90% 이상을 핵으로 받은 세포로 정량화를 제한하는 것이 중요합니다. 성공적인 핵 주입은 핵과 세포질에서 장기 녹색 덱스트란의 분포를 시각화하여 평가할 수 있습니다. 어류 프로브 설계 및 핵 내 세포질의 mRNA 분포를 분석하기 위한 이미지 분석 소프트웨어 사용에 대한 자세한 내용은 온라인 프로토콜을 참조하십시오.

그게 다야. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.