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접시의 배양 삽입물에서 배양된 마우스 뇌의 해마 절편으로 시작합니다.
슬라이스가 들어 있는 인서트를 자르고 현미경으로 전기천공 챔버에 고정합니다.
과잉 흥분을 억제하고 세포 독성을 방지하기 위해 전압 개폐 나트륨 채널 차단제가 포함된 완충액으로 챔버를 관류합니다.
관심 유전자가 있는 플라스미드가 포함된 피펫을 슬라이스 근처에 배치합니다.
막 보조개가 형성될 때까지 표적 해마 뉴런에 접근하는 동안 피펫 막힘을 방지하기 위해 양압을 유지합니다.
음압으로 전환하여 멤브레인과 밀봉을 만듭니다.
세포 손상을 최소화하기 위해 양압과 음압을 번갈아 가며 사용합니다.
전기천공 펄스를 적용하여 멤브레인을 일시적으로 투과시켜 플라스미드 진입을 촉진합니다.
양압을 유지하면서 피펫을 빼내고 인접한 표적 뉴런에 대해 전기천공을 반복합니다.
전기천공된 슬라이스를 새로운 삽입물로 옮기고 배양하여 관심 유전자의 발현을 허용합니다.
전기천공을 위한 슬라이스 배양을 준비하려면 관심 배양 삽입물을 900마이크로리터의 배양 배지가 로드된 개별 3센티미터 페트리 접시로 옮기고 배양액을 탁상용 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 다음으로, 신선한 배양 인서트를 3.5cm 페트리 접시에서 인서트당 1밀리리터의 슬라이스 배양 배지와 함께 최소 30분 동안 사전 배양하고 10% 표백제로 전기천공 장비의 라인을 5분 동안 멸균합니다.
관류가 끝나면 0.001밀리몰 테트로도톡신을 함유한 필터 멸균 aCSF로 관류하기 전에 이온화된 고압멸균수로 최소 30분 동안 라인을 헹굽니다. 전기천공기 펄스를 마이너스 5볼트의 진폭, 정사각형 펄스, 500밀리초의 트레인, 50Hz의 주파수, 500마이크로초의 펄스 폭으로 설정합니다. 유리 피펫에 플라스미드 함유 내부 용액 5마이크로리터를 채우고 팁을 여러 번 부드럽게 튕기고 두드려 갇힌 기포를 제거합니다.
해부 현미경을 사용하여 팁이 손상되지 않았는지 확인하고 피펫 팁을 전극에 단단히 부착합니다. 팁이 aCSF와 접촉하면 전기천공기의 피펫 저항 판독값을 기록합니다. 슬라이스 배양액을 분리하려면 날카로운 칼날로 배양 삽입물 멤브레인을 자르고 날카로운 각진 겸자를 사용하여 슬라이스 배양액을 전기천공 챔버로 조심스럽게 옮깁니다.
그런 다음 슬라이스 앵커로 배양 위치를 고정합니다. 관심 세포의 전기천공을 위해 입으로 피펫에 양압을 가하고 3차원 손잡이 컨트롤을 사용하여 피펫 팁을 슬라이스 배양 표면 근처로 조작합니다. 현미경으로 배양액을 관찰하면서 팁으로 표적 세포에 접근하여 세포 표면에 보조개가 형성될 때까지 양압을 가한 상태를 유지합니다.
딤플이 시각화되면 피펫 팁과 원형질막 사이에 느슨한 밀봉이 형성되도록 입으로 약한 음압을 빠르게 가합니다. 멤브레인이 피펫에 약간 들어갑니다. 스피커의 톤 증가로 표시되는 것처럼 피펫의 초기 저항이 약 2.5배 증가하는 것을 관찰해야 합니다.
보조개가 재형성되도록 양압을 빠르게 다시 가하십시오. 그런 다음 일시 중지하지 않고 방금 시연한 대로 최소 두 번의 압력 주기를 즉시 완료합니다. 마지막 압력 펄스 후 음압을 1초 동안 유지합니다.
스피커의 톤이 피치의 안정적인 정점에 도달하면 풋 페달을 사용하여 전기 천공기를 빠르게 펄스합니다. 전기천공 후 압력을 가하지 않고 피펫을 셀에서 약 100미크론 정도 부드럽게 집어넣고 양압을 다시 가하여 저항이 기준선 판독값과 유사한지 확인한 후 다음 셀에 접근합니다. 관심 세포가 모두 전기천공되면 슬라이스 배양액을 준비된 신선한 배양 인서트 중 하나로 옮기고 인서트를 섭씨 35도에서 최대 3일 동안 놓습니다.
