Name: 차 모터 및 Electrospun 폴리 - L - lactide Nanofiber 공사장 공중 발판을에 정의된 미디어 감각 뉴런의 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: 배우세요 정렬된 전기방사 나노섬유를 이용한 쥐 감각 및 운동 뉴런의 원발 배양 방법을. 이 기술은 신경 재생 및 세포 지형 연구에 활용됩니다.

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NIH K08 EB003996

1. 솔루션 스피닝 폴리 - L - 젖산 (PLLA) <ol><li> 낮은 열 이상의 감동으로 9 ML 클로로포름에 0.4 g PLLA을 디졸브. </li><li> DMF 9시 1분 (V / V) : 클로로포름에 4% PLLA (W / V)로 솔루션의 최종 농도를 데리고, 솔루션 1 ML의 dimethylformamide를 추가합니다. </li><li> 뭉툭한 23ga 금속 팁이있는 폴리 프로필렌이나 유리 주사기의 솔루션을 놓으십시오. </li></ol> 2. 기판 준비 1 스피닝 <ol><li> 낮은 열 이상의 감동에 의해 클로로포름에 85:15 PLGA의 8 % (W / V) 솔루션 (폴리 - 락트 - 공동 glycolic 수 소산​​)합니다. </li><li> PLGA 솔루션으로 각 표지 전표의 표면을 커버하여 PLGA의 외투 깨끗한 유리 커버 풀렸는데. PLGA는 박막 (약 30 분)로 건조 수 있습니다. </li></ol> 3. Electrospinning이 <ol><li> 보안 PLGA 코팅 유리 커버 전도성 카본 테이프 수집기에 전표. 정렬된 섬유 들어, 컬렉터는 모터 구동 바퀴입니다. 임의 섬유 들어, 컬렉터는 고정 플레이트입니다. </li><li> 컬렉터 휠에서 팁 20cm와 펌프에 넣어 주사기. 약 2 ML / 시간에 펌프를 설정하고 바퀴를 사용하여 300-400 RPM으로 모터를 설정하는 경우. 가능하면, -2 KV 직류 수집기에 바이어스와 15 KV 금속 팁로 적용됩니다. 바이폴라 전원 공급 장치에 대한 액세스 권한이없는에서는 수집기를 지상. </li><li> 섬유 주사기 팁에서 제트와 회전 바퀴를 수집합니다. 섬유 원하는 밀도를 얻을 때까지 회전을 계속합니다. 문지은 종이 타월로 금속 팁 정기적으로 끝에 막히는 것을 방지하기 위해 비 전도성 막대에 붙인. </li></ol> 4. 1 Moating <ol><li> 다음 회전, 커버 슬립의 주위에 PLGA의 라인을 pipetting하여 '해자'electrospun 샘플. PLGA 건조하도록 허용합니다. 이것은 문화 중에 섬유의 정렬을 유지합니다. </li></ol> 5. 단백질 코팅 <ol><li> Electrospun 섬유 및 유리 컨트롤은 세포 배양하기 전에 단백질 코팅해야합니다. 적어도 한 시간 동안 단백질 용액에 기판을 커버하고 초과 솔루션을 기음과 기판 건조 때까지 aspirating 계속합니다. 가능한 단백질 솔루션은 다음과 같습니다 : PLL (폴리 - L - 라이신) (100 μg / ML), laminin (25 μg / ML) 또는 fibronectin (50 μg / ML). PLL을 사용하는 경우, 기판은 무균 물에 씻어서 초기 코팅 다음 번 건조해야합니다. </li></ol> 6. E15 랫 태아에게 3 획득 * 모든 실험은 관리와 같은 동물의 사용 및 관리에 대한 미시간위원회의 대학에 의해 승인된 실험실 동물의 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 수행되었다. <ol><li> 준비 : 동물이 임신 있는지 확인하십시오. 3 ML 트립신, 3 ML FBS 및 L15의 따뜻한 한 병 해동. 화재 파스퇴르 피펫을 폴란드어. 30 분 70 % 에탄올의 모든 수술기구를 소독. </li><li> (표 1 참조) 도금 미디어를 준비하고 따뜻하게. </li><li> 안락사 : 마취제 / xylazine의 IP 주사를 수행합니다. 10-15분 후에 각막의 부족 확인하고 인출 반사 신경 페달. 반사 신경이 부재되면, pentobarbital (FatalPlus)의 IC 주사를 수행합니다. </li><li> 텐트 복부의 피부를. 복강을 노출하기 위해 피부와 근육층을 통해 잘라. 자궁을 찾아 자궁 경부와​​ 난소에서 그것을 분리합니다. </li><li> 가위로 자궁에서 배아를 제거하고 따뜻한 L15에 바로 놓으십시오. (모든 다음 절차는 해부 현미경 및 배아에 따라 완료하고 해부하는 코드는 항상 따뜻한 L15에 빠져들해야합니다.) 턱 주위 포셉을 폐쇄하고 아래 후두 골이 두개골에 의해 배아 목을 벨. </li></ol> 7. 해부 3 <ol><li> 한쪽에있는 배아를 놓습니다. 다리와 복부 장기를 벗겨 다른 세트를 사용하는 동안 포셉 한 세트로 척수를 보호합니다. </li><li> 배아를 켜고 포셉 한 세트로 잡을. 전체 코드가 노출 때까지 목에 꼬리로 배아의 길이를 따라 싹둑. </li><li> 조심스럽게 코드의 끝 부분을 파악하고 제거하는 꼬리쪽으로 자체를 통해 그것을 당겨. 코드가 막과 지느러미 루트 신경 (DRG) 첨부와 함께 무료로 끌어 것입니다. </li><li> explant 또는 dissociated 감각 신경 세포의 문화를 DRG하면 수행되어야하는 경우, 코드에서 DRG를 싹둑 따뜻한 L15의 신선한 요리로 전송할 수 있습니다. <ol><li> explant 문화를 DRG 들어, 10.2 단계로 건너 뜁니다 </li><li> dissociated 감각 신경 세포 배양을위한 9 단계로 건너 뜁니다 </li><li> 모터 신경 세포의 문화, DRG는 7.5 단계에서 막과 함께 제거됩니다 </li></ol></li><li> 긴 양말을 제거하기 위해 유사한 코드의 맨 끝에 쥐고 그것을 아래로 필링하여 척수에서 멤브레인를 제거합니다. 모든 배아에 대한 반복하고 소형 (2-3 ㎜) 조각으로 코드를 들어온다. </li></ol>5,6,7 <ol><li> 펠렛 조각에 2-3 분 1,000 RPM에서 원뿔과 스핀에 다진 코드와 L15 하거라. </li><li> 뜨는을 붓고하고 pelleted 코드에 트립신 3 ML를 추가합니다. 20 분 37 ° C의 물을 욕조에 품어. </li><li> 원뿔 다시 펠렛으로 2-3 분 1,000 RPM에서 스핀 3 ML FBS를 추가합니다. </li><li> 뜨는와 코트 FBS와 화재 광택 파스퇴르 피펫을 하거라. </li><li> 원뿔 하나 파스퇴르 피펫 - L15의 완전을 추가하고 솔루션은 눈에 띄는 대단히 짧은 시간과 동질 때까지 부드럽게 가루로 빻다. 거품을 피하십시오. </li><li> L15의 Optiprep의 9 % 용액을 준비합니다. 생명의 배아 (배아의 홀수가있다면, 최대 원형)에 대한 Optiprep 솔루션 3 ML 하나의 튜브를 준비합니다. </li><li> 모든 튜브 사이에 균등하게 그것을 나누어, Optiprep 솔루션에 균질 솔루션을 놓으십시오. 15 분 2000 RPM에서 튜브를 스핀. </li><li> 조심스럽게 50 ML 원뿔 각 관과 수영장에서 최고 2 ML를 수집합니다. Optiprep의 세포를 씻어 5 분 1,000 RPM에서 L15과 스핀으로 원뿔을 입력합니다. </li><li> 뜨는을 붓고 및 도금 미디어 (250-500 μl)의 소량의 세포를 resuspend. 라이브 세포를 식별하는 trypan 파랑 배제를 사용하여 셀을 계산합니다. 10.1 단계로 건너 뜁니다 </li></ol> 9. 감각 신경 세포 (SN) 가공 7 <ol><li> 펠렛 조각에 2-3 분 1,000 RPM에서 원뿔 관과 스핀으로 척추 코드와 L15 제거 DRG 하거라. </li><li> 뜨는을 붓고하고 pelleted DRG에 트립신 3 ML를 추가합니다. 10 분 37 ° C의 물을 욕조에 품어. </li><li> 원뿔 다시 펠렛으로 2-3 분 1,000 RPM에서 스핀 3 ML FBS를 추가합니다. </li><li> 뜨는와 코트 FBS와 화재 광택 파스퇴르 피펫을 하거라. </li><li> 원뿔 하나 파스퇴르 피펫 - L15의 완전을 추가하고 솔루션은 눈에 띄는 대단히 짧은 시간과 동질 때까지 부드럽게 가루로 빻다. 거품을 피하십시오. </li><li> 5 분 1,000 RPM의 homogenate를 스핀. 뜨는을 붓고 및 SN 도금 미디어 (250-500 μl)의 소량의 세포를 resuspend. 라이브 세포를 식별하는 trypan 파랑 배제를 사용하여 셀을 계산합니다. 10.1 단계로 진행 </li></ol> 10. 도금 문화 <ol><li> : dissociated SN 또는 MN 문화 <ol><li> 미디어 몇 방울로 기판을 커버하는 것은 다음 세포 현탁액의 적절한 볼륨을 추가합니다. Dissociated 세포는 저밀도 (25-50 셀 / mm 2) 도금되어야합니다. 세포 미디어 우물 홍수 전에 적어도 한 시간 준수하도록 허용합니다. </li></ol></li><li> explant 문화를 DRG 경우 : <ol><li> 미디어 몇 방울로 기판 커버는 다음 미디어에 DRG 추가할 수 있습니다. 그들이 골고루 기판 (약 4 DRG는 22x22 mm 커버 슬립에 맞게)를 통해 배포됩니다 그래서 DRG를 정렬. DRG 미디어와 우물 홍수 전 최소한 4 시간에 대한 준수하도록 허용합니다. </li></ol></li><li> 문화가 미디어 변화없이 사일을 위해 유지하실 수 있습니다. 더 이상 문화 절반 미디어 변경 피드 매체와 완료해야합니다. 피드 미디어 도금 미디어 마이너스 L - 글루타민과 같은 구성입니다. </li></ol> 11. Immunocytochemistry 1,5,8 <ol><li> 세포를 고정 : 대기음 미디어는 30 분 따뜻한 4퍼센트 PFA (paraformaldehyde)로 대체합니다. 그런 다음 배 5 분 1X PBS의 세척을 수행합니다. </li><li> / permeabilization를 차단하면 차단 / 파마 솔루션 (1X PBS에서 알부민 1.25 % 소 혈청, 0.05 % 트리톤 X - 100과 2.0 % 정상 염소 혈청)를 준비합니다. 대기음 PBS는 30 분 동안 샘플 차단 / 파마 솔루션을 적용할 수 있습니다. 다음 1X 5 분 1X PBS의 세척을 수행합니다. </li><li> 차 항체 : 항체 기본 작업 솔루션을 준비 (10 % 정상 염소 혈청, 1.25 % 소 혈청 알부민, 0.1 % 나 azide, 1X PBS로 0.05 % 트리톤 X - 100 10 ML). (표 2 참조) 기본 항체의 적절한 금액을 추가합니다. parafilm과 일치 여러 요리. 각 기판에 대한 parafilm에 기본 항체 솔루션의 200μl 비드를 놓습니다. 기판 반전, 하룻밤 차 항체 작업 솔루션을 그들에게 휴대 쪽 떠내려하기 (객실 에어컨하거나 특히 건조한 경우에, 물, 포화 종이가 작업 솔루션의 증발을 방지하기 위해 요리의 코너에 추가할 수 있습니다) . </li><li> 차 항체 (작업 솔루션 ° 4 저장, C를 수집하고 활용할 수 있습니다) 기본에서 기판을 제거하고 2X 5 분 1X PBS의 세척을 수행합니다. 4 시간을위한 PBS (또한 parafilm 줄지어 접시에 거꾸로)에서 1:200 희석 200 μl 차 항체를 적용합니다. </li><li> 보조에서 제거 후 배 5 분 1X PBS의 세척을 수행합니다. 와 슬라이드 마운트 기판은 DAPI 또는 다른 적합한 핵 카운터를 포함하는 골드 얼룩 연장. </li></ol> 12. 대표 결과 : 정렬 및 무작위 엘의 전형적인 형태ectrospun 섬유는 그림 1에 표시됩니다. 우리는 일반적으로이 프로토콜과 함께&gt; 90 % 7,8 뉴런의 MN 순도를 얻을 우리는 어떤 중요한 fibroblast의 성장없이 한 것과 주일 동안 문화를 DRG 유지합니다. 그림 2는 문화와 immunostaining의 24 시간 이후 유리 섬유 전형 MN의 모습을 보여줍니다. 유리 섬유에 사흘 동안 교양 Immunostained DRG는 그림 3에 그려져 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 광섬유 정렬은 컬렉터의 선택에 의해 조작할 수 있습니다. A.)) 회전 바퀴 수집기와 B에 늘인 섬유 연합 무작위 섬유는 고정 플레이트 수집기에 불러 냈어요. 스케일 바 = 20 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2.) PLL 코팅 A.에 대한 문화의 24 시간 이후 TuJ1 (녹색) 및 DAPI (파란색)에 대한 섬유와 B를 스테인드 대표 모터 뉴런) 유리. 스케일 바 = 20 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. PLL 코팅 A.에 대한 문화의 3 일 후에 neurofilament에 대한 대표 DRG 자국 (녹색)) 유리와 B.) 섬유. 스케일 바 = 200 μm의. <table border="1"><tbody><tr><td> 증권 솔루션 : </td><td> MN 미디어 : </td><td> DRG / SN 미디어 : </td></tr><tr><td> 10 MG ML -1 알부민 </td><td> 12.5 μl </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 MG ML -1 APO - 트랜스페린 </td><td> 50 μl </td><td> 40 μl </td></tr><tr><td> 50 μg ML -1 β - estradiol </td><td> 2.7 μl </td><td> 2.2 μl </td></tr><tr><td> 0.1 MG ML -1 비오틴 </td><td> 50 μl </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 MG ML -1 카탈 라 아제 </td><td> μl 8 </td><td> - </td></tr><tr><td> 15 MG ML D - 갈락토 오스 -1 </td><td> 50 μl </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 μg ML -1 하이드로코티손 </td><td> 3.7 μl </td><td> 2.9 μl </td></tr><tr><td> 0.63 MG ML -1 progesterone </td><td> 0.5 μl </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 MG ML -1 putrescine </td><td> 50 μl </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 μg ML -1 셀레늄 </td><td> 3.4 μl </td><td> 4.1 μl </td></tr><tr><td> 2.5 MG ML -1 초과 산화물의 dismutase </td><td> 50 μl </td><td> - </td></tr><tr><td> * 500 NG ML -1 신경 성장 인자 </td><td> - </td><td> 1 ML </td></tr><tr><td> * 100X PSN </td><td> 0.5 ML </td><td> 0.5 ML </td></tr><tr><td> * B27 </td><td> 1 ML </td><td> 1 ML </td></tr><tr><td> * 2 MM L - 글루타민 </td><td> 35 μl </td><td> 35 μl </td></tr><tr><td> * Neurobasal </td><td> 50 ML에 </td><td> 50 ML에 </td></tr></tbody></table> 표 1. 사용하기 직전 미디어 (*) 구성 요소를 별표를 추가합니다. 나머지 구성 요소는 주식 솔루션으로 준비하고 6,7 필요한 때까지 -20 ° C에서 보관하실 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 차 (농도) </td><td> 뉴런 : </td><td> Glia : </td><td> 섬유아 세포 : </td></tr><tr><td> 안티 - β - tubulin (TuJ1) (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> 엑스 </td><td> 엑스 </td></tr><tr><td> 안티 neurofilament (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> 엑스 </td><td> 엑스 </td></tr><tr><td> 안티 - S - 100 (1:250) </td><td> 엑스 </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td></tr><tr><td> 안티 NGFR p75 (1:500) </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td><td> 엑스 </td></tr></tbody></table> 표 2. 차 항체의 선택은 조사의 목적에 따라 달라집니다. 위의 몇 가지 항체와 우리 연구실에 성공 사용한 농도입니다. S - 100은 Schwann 세포 및 / 식별하거나 섬유아 세포를 오염 확인하지만, 그것이 glia와 fibroblasts4을 구별하기 NGFR p75와 함께 사용해야합니다 특히 유용합니다. 우리는 또한 목표가 개별 neurites을 시각화하는 경우 neurofilament 또는 TuJ1이 우수한 선택하는 동안 NGFR p75 얼룩이 매우 가볍게 neurites 것으로 나타났습니다.

<ol><li>Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+electrospun+PLLA+nanofiber+scaffolds+compatible+with+serum-free+growth+of+primary+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons.</a> Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).</li>
<li>Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+nanofiber+morphologies+using+modulated+electrospinning+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mat.+Res.+Soc.+Symp.+Proc%22%5BJournal%5D)">Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications.</a> Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).</li>
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<li>Kameda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+glial+progenitor+markers+p75NTR+and+S100+protein+in+the+developing+mouse+parathyroid+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland.</a> Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).</li>
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<li>Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-I+prevents+apoptosis+in+neurons+after+nerve+growth+factor+withdrawal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal.</a> J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).</li>
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<li>Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+parameter+study+for+ultra-fine+fiber+fabrication+via+electrospinning+process%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process.</a> Polymer. 46, 6128-6134 (2005).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 electrospun 섬유 기판의 적절한 생산을 포함한다. 액체 미디어, PLLA 섬유, PLGA 필름과 PLGA의 해자는 단일 단위로 유리 커버 슬립에서 분리합니다. PLGA가 생략되면, PLLA 섬유 평면 시트 유지되지 않습니다 - 그들은 사용할 수 없게 탱글로 내면됩니다. 따라서 PLGA 필름은 문화 중 광섬유 정렬을 유지하기 위해 적당한 기판으로 포함되어 있습니다. 해자는 섬유가 안전하게 PLGA 필름으로 고정되고 필름 구조적 강성을 추가할 수 있도록 모두 회전 후 추가됩니다. 기판은, 고정 얼룩 및 장착 중에 조작하는 경우 해자는 또한 유용한 손잡이 역할을합니다. 가루약 두 번째 중요한 단계입니다. 모든 노력은 거품의 형성을 피하기 위해하여야한다. 불타는 광택 피펫이 단계에 사용되는 경우 또한, 우리는 훨씬 높은 수익률을 획득했습니다. 폴란드어 화재, 알콜 램프를 조명하고 피펫에 전구를 연결합니다. 지속적으로 압박하고 전구를 발표하면서 불꽃을 통해 신속하게 2-3 번 피펫의 팁을 패스 - 피펫을 통해 공기 흐름을 완전히 닫는에서 팁을 방지하는 데 도움이됩니다. 구멍이 아직 열려 있도록 피펫의 팁을 확인하고 사용하기 전에 약간 둥글게 가장자리가 보인다. Electrospinning은 매우 다양한 과정, electrospinning 매개 변수가 morphologies의 다양한 섬유를 생산하는 수정할 수 있습니다. 탄 외. (2005) 자세한 내용 PLLA electrospun 섬유의 직경에 영향을 미치는 매개 변수의 체계적 연구를. 왕 외. (2009) electrospun PLLA 섬유의 정렬에 영향을 미치는 매개 변수에 대한 자세한 연구를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>PLLA</td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>Resomer L210</td><td></td></tr><tr><td>PLGA 85:15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43471</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2289</td><td></td></tr><tr><td>아포-트랜스페린</td><td>Akorn Inc</td><td>AK8227</td><td></td></tr><tr><td>비오틴</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC 23009-0010</td><td></td></tr><tr><td>갈락토오스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>푸트레신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>셀레늄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-에스트라디올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E 1132</td><td></td></tr><tr><td>히드로코르티손</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>카탈라아제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼옥사이드 디스뮤타아제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4636</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PSN</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1680149</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1689149</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>2011</td><td></td></tr><tr><td>PLL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 4759</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TuJ1</td><td>BD Biosciences</td><td>556321</td><td></td></tr><tr><td>Anti-neurofilament</td><td>EMD Millipore</td><td>AB1987</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NGFR p75</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3908</td><td></td></tr><tr><td>정상 염소 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>카본 테이프</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13073-1</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold +DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

차 모터 및 electrospun 폴리 - l - lactide nanofiber 공사장 공중 발판을에 정의된 미디어 감각 뉴런의 문화

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Electrospinning은 나노 규모의 섬유 마이크로로 생산을위한 기법입니다. 섬유는 높은 완전히 무작위로 정렬에서 정렬의 학위를 변화와 electrospun 수 있습니다. 또한, 섬유 등 폴리 - L - 젖산 (PLLA)와 같은 생분해성 고분자를 포함하여 재료의 다양한에서 냈지 수 있습니다. 이러한 특성은 조직 공학 비계의 다양한 어플 리케이션에 적합한 electrospun 섬유를합니다. 우리의 초점은 신경 재생에 대한 정렬 electrospun 섬유의 사용에 있습니다. 우리는 이전에 정렬 electrospun PLLA 섬유는 체외에서 모두 기본 감각과 운동 신경의 가지를 직접 것으로 나타났습니다. 우리는 밀접하게 가능한 생체내에있는 모델을 실제 뉴런에 biomaterials을 평가할 때 기본 세포 배양 시스템의 사용이 필수적입니다 유지합니다. 여기, 우리는 섬유 공사장 공중 발판과 문화 등의 루트 신경의 explants뿐만 아니라 electrospun의 공사장 공중 발판 dissociated 감각과 운동 뉴런을 electrospin 우리의 실험실에서 사용되는 기법을 설명합니다. 그러나, electrospinning 및 / 또는 여기에 소개 문화 기술은 쉽게 다른 응용 프로그램에서 사용하기 위해 적응하고 있습니다.

정렬 electrospun 섬유는 체외에서 뉴런의 성장을 직접 신경 재생 공사장 공중 발판의 잠재적인 구성 요소입니다. 우리는 electrospun 섬유 기판 및 기본 쥐 E15 감각 (DRG)와 모터 뉴런의 혈청이없는 문화를 준비 절차를 설명합니다. immunocytochemistry에 의해 뉴런의 시각화도 포함되어 있습니다.

차 모터 및 Electrospun 폴리 - L - lactide Nanofiber 공사장 공중 발판을에 정의된 미디어 감각 뉴런의 문화

전기방사는 마이크로에서 나노 규모의 섬유를 제조하는 기술입니다. 섬유는 고도로 정렬된 상태부터 ...까지 다양한 정렬도로 전기방사할 수 있습니다.

정렬된 Electros bun 섬유는 in vitro에서 뉴런의 성장을 유도하며, 신경 재생 지지체의 잠재적 구성 요소입니다. 본 영상에서는 Electros BUN 섬유 지지체를 제작하고 그 위에서 쥐의 일차 감각 및 운동 뉴런을 배양합니다. 먼저, 유리 커버슬립 위에 섬유성 지지체를 전기방사합니다.그 후 배아 15일차 쥐로부터 일차 신경세포를 얻어 전기방사 섬유 지지체 위에서 배양합니다. 신경세포가 부착되어 성장하도록 한 다음, 면역세포화학 기법을 사용하여 고정 및 염색합니다. 이미징 결과, 전기방사 섬유에서 배양된 신경세포의 형태 변화가 나타났으며, 이는 전기방사 섬유의 나노 지형이 신경돌기 성장을 유도할 수 있음을 시사합니다.형질전환 세포주를 사용하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 일차 배양 신경세포가 vitro에서 vivo의 신경세포 거동을 형질전환 세포보다 더 밀접하게 모사한다는 점입니다. 이러한 기술을 통해 시청자는 electro fun fibers를 다른 세포 유형과 함께 사용할 수 있습니다. 또는, 시청자의 필요에 따라 다른 연구 목적으로 배양된 운동 신경세포 및 감각 신경세포를 사용할 수도 있습니다.일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 전기 방사가 매우 까다로운 공정이기 때문에 어려움을 겪을 수 있으며, 이에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 비디오 논문에서 설명합니다. 전기 방사 섬유 기판을 준비하려면, 먼저 클로로포름에 85:15 비율의 폴리락틱-코-글리콜산(PLGA) 8% 용액과 폴리 L-락타이드(PLLA) 4% 용액을 각각 만들고 낮은 온도에서 가열하며 교반합니다. 다음으로, 깨끗한 유리 커버슬립 표면에 PLGA 용액을 도포하여 코팅합니다. 도포된 PLGA가 얇은 막으로 건조될 때까지 약 30분 동안 기다립니다.PLGA가 건조되면, 전도성 카본 테이프를 사용하여 PLG 코팅 커버슬립을 정렬된 섬유를 생성하기 위한 모터 구동 휠이나 무작위 섬유를 위한 고정 플레이트에 고정합니다. 4% PLLA 용액이 담긴 시린지를 팁이 장착된 펌프에 장착하고, 컬렉터로부터 20 centimeters 거리에 위치시킵니다.펌프를 시간당 약 0.22 milliliters로 설정하십시오. 휠 모터를 분당 300에서 400회 회전으로 설정하십시오. 콜렉터에는 -2 kilovolt DC 바이어스를, 금속 팁과 접촉해 있는 전도성 플레이트에는 +15 kilovolt를 인가하십시오.양극성 전원 공급 장치 접지에 접근할 수 없는 경우, 컬렉터가 시린지 펌프를 시작하면 섬유가 시린지 팁에서 분사되어 회전 휠에 수집됩니다. 원하는 섬유 밀도가 얻어질 때까지 방사를 계속하십시오. 금속 팁의 막힘을 방지하기 위해 비전도성 막대에 고정된 종이 타월로 주기적으로 팁을 닦아내십시오. 방사 후 커버 슬립의 둘레를 따라 PLGA 라인을 피펫으로 도포하십시오. 이는 기본적으로 전극 주변에 해자(moat)를 만드는 것입니다.샘플을 건조시켜 PLGA를 말립니다. 이는 배양 동안 섬유의 정렬 상태를 유지하기 위함입니다. 전기 방사된 섬유와 유리 대조군은 세포 배양 전에 단백질로 코팅해야 합니다.이를 위해 기질을 폴리올, 라이신, 라미닌 또는 피브로넥틴으로 최소 1시간 동안 덮어둡니다. 그런 다음 기질이 마를 때까지 과잉 용액을 흡입하여 제거합니다. 폴리올 라이신을 사용하는 경우, 초기 코팅 후 기질을 멸균수로 헹구고 두 번 건조시켜야 합니다.기질이 건조되면, 전도성 방사 섬유 위에서 배양할 세포를 준비하기 위해 기질을 6-웰 조직 배양 플레이트에 넣고 세포 배양을 수행합니다. 안락사시킨 임신한 쥐로부터 E 15 배아를 얻습니다. 먼저 70% ethanol로 해당 부위를 소독한 다음, 복부 피부를 텐트 모양으로 들어 올립니다.피부와 근육층을 절개하여 복강을 노출시킵니다. 자궁의 위치를 확인하고 자궁경부와 난소 부위를 분리합니다. 분리한 자궁을 멸균 접시에 옮깁니다.그런 다음 가위로 자궁에서 배아를 제거하고 즉시 따뜻한 L 15에 넣습니다. 배아의 머리를 제거한 후, 한 쌍의 핀셋으로 척수를 보호하면서 배아를 옆으로 눕힙니다. 다른 핀셋을 사용하여 사지와 복부 기관을 제거합니다.다음으로, 배아를 돌려 핀셋 한 쌍으로 고정합니다. 목부터 꼬리까지 배아의 길이를 따라 걷어내어 척수가 완전히 노출되도록 합니다. 척수의 끝부분을 조심스럽게 잡은 다음, 꼬리 방향으로 척수를 겹쳐 당깁니다.이를 제거하려면, 척수를 당기면 막과 후근신경절(dorsal root ganglia)이 함께 분리됩니다. 후근신경절 x explan 또는 해리된 감각 신경세포 배양을 수행하려는 경우, 척수에서 후근신경절을 잘라내어 따뜻한 L 15가 담긴 새 배양 접시로 옮깁니다. 운동 신경세포 배양의 경우.척수 앞쪽 끝부분에서 막을 잡고 아래로 벗겨냅니다. 긴 양말을 벗기는 것과 유사한 방식으로 모든 배아에 대해 이 과정을 반복한 다음, 핀셋을 사용하여 척수를 작은 조각으로 자릅니다. 이를 통해 운동 뉴런 배양물을 얻을 수 있습니다.다진 척수와 L 15를 원심분리관에 붓고 180 ×g에서 2~3분 동안 원심분리합니다. 조각들을 펠릿화하기 위해 상층액을 제거하고 펠릿화된 척수에 3 mL의 trypsin을 첨가합니다. 튜브를 37 °C 항온수조에 넣고 20분 동안 배양합니다.배양 후, 원추형 튜브에 FBS 3 mL를 추가합니다. 그 다음 180 ×g에서 2~3분 동안 원심분리하여 이를 제거합니다. 그동안 FBS를 피펫으로 흡입했다가 배출하여, FBS로 화염 멸균된 파스퇴르 피펫을 코팅합니다.이렇게 하면 분쇄 과정 동안 조직 조각이 유리에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 원심분리 후, 상층액을 제거하십시오. 그런 다음 L 15 한 파스퇴르 피펫 분량을 원추형 튜브에 추가하고, 용액이 덩어리 없이 균질해질 때까지 FBS 코팅 피펫을 사용하여 부드럽게 분쇄하십시오.기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 배아 2개당 L 15에 9%opre 3 mL를 넣은 튜브 1개를 준비합니다. 배아의 수가 홀수일 경우, 한 방울을 더 추가하십시오.균질액을 OptiPrep 용액 위에 얹어 모든 튜브에 균등하게 나누어 담습니다. 균질액은 OptiPrep 용액 상단에 가시적인 혼탁층을 형성합니다. 튜브를 700 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다.각 튜브의 상층액 2 mL를 조심스럽게 수집하여 50 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 원심분리관에 L 15를 채우고 180 ×g에서 5분간 원심분리하여 세포의 opre를 세척합니다. 상층액을 제거합니다.펠렛은 육안으로 거의 보이지 않습니다. 이 단계에서 Reese는 소량의 플레이팅 배지로 세포를 부유시키십시오. 트리판 블루 배제법을 사용하여 세포 수를 측정하고 살아있는 세포를 식별하십시오.이제 세포를 플레이팅할 준비가 되었습니다. 감각 신경세포 배양을 얻으려면 90% 이상의 신경세포 순도가 기대됩니다. 먼저 척수에서 분리한 dorsal root ganglia와 L 15를 원심분리관에 붓는 것으로 시작하십시오.원심분리 후, 180 ×g에서 2~3분간 원심분리하여 조각들을 펠렛화합니다. 상층액을 따라내고 펠렛화된 DRG에 3 mL의 trypsin을 넣은 후 37 °C 항온수조에서 배양합니다. 10분 후, 튜브를 항온수조에서 꺼내 3 mL의 FBS를 넣고 180 ×g에서 2~3분간 원심분리하여 다시 펠렛화합니다.그동안, 화염 연마된 파스퇴르 피펫을 FBS로 코팅하십시오. 이전과 마찬가지로 FBS가 코팅된 피펫을 사용하여 펠릿에 L 15 한 피펫 분량을 추가하고, 가시적인 덩어리가 없이 용액이 균질해질 때까지 부드럽게 트리투레이션하십시오. 균질화된 용액을 180 ×g에서 5분 동안 원심 분리한 후 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.상층액을 제거하고 소량의 감각 뉴런 플레이팅 배지에 세포를 재현탁합니다. 트라이판 블루 배제법을 사용하여 세포 수를 측정하고 살아있는 세포를 확인합니다. 이제 세포를 배양하여 감각 또는 운동 뉴런을 플레이팅할 준비가 되었습니다.먼저 단백질이 코팅된 전도성 나노섬유 기질에 배지를 몇 방울 떨어뜨려 덮어줍니다. 그 다음 적절한 부피의 세포 현탁액을 첨가합니다. 해리된 세포는 낮은 밀도로 분주해야 합니다.웰을 배지로 가득 채워 인큐베이터로 옮겨 배양하기 전, 세포가 인큐베이터 내에서 최소 1시간 동안 부착되도록 둡니다. 단백질이 코팅된 전기방사 섬유 기판 위에 배지 몇 방울을 떨어뜨려 덮어줍니다. 그 다음 배지에 후근신경절을 추가합니다.배양 기질 전체에 후근 신경절이 균등하게 분포되도록 배치합니다. 22 by 22 millimeter 커버슬립 하나에 약 4개의 후근 신경절이 들어갑니다. 후근 신경절 배양물을 37 °C 인큐베이터에 넣고, 배양 후 최소 4시간 동안 부착되도록 둡니다.웰에 배지를 가득 채운 후 인큐베이터로 되돌립니다. 배지 교체 없이 최대 4일까지 배양을 유지할 수 있습니다. 더 장기간 배양하는 경우, 공급 배지를 사용하여 배지의 절반을 교체해야 합니다.배양 배지는 L-glutamine을 제외하고 플레이팅 배지와 동일한 조성으로 준비합니다. 세포가 원하는 시점에 도달하면, 동봉된 서면 프로토콜의 지침에 따라 면역세포화학 염색을 수행할 수 있습니다. 이 SEM 이미지는 정렬된 전기방사 섬유와 무작위 전기방사 섬유의 전형적인 형태를 보여줍니다.섬유의 정렬은 컬렉터의 선택에 의해 조절됩니다. 회전 휠 컬렉터 위로 방사된 섬유는 균일하게 정렬된다는 점에 유의하십시오. 반면, 고정식 컬렉터 위로 방사된 섬유는 무작위한 형태를 가집니다.이 이미지들은 녹색으로 표시된 beta tubulin의 운동 뉴런 염색과 청색으로 표시된 DPI 핵 염색을 보여줍니다. PLL 코팅 섬유 및 섬유 위의 유리에 24시간 동안 배양한 후, 운동 뉴런은 일반적으로 세포체로부터 섬유 정렬 방향(이 이미지에서는 왼쪽에서 오른쪽)과 평행하게 뻗어 나오는 소수의 돌기를 가집니다. 섬유에서 배양된 세포의 주요 돌기는 동일한 시간 동안 유리에서 배양된 세포의 주요 돌기보다 훨씬 깁니다.유리 위에서 배양된 운동 뉴런은 일반적으로 24시간 후에 세포체로부터 방사형으로 뻗어 나가는 돌기를 더 많이 가집니다. 섬유 위에서 배양된 뉴런의 경우, 이 이미지들에서 보이듯 유리 위에서보다 주요 돌기의 길이가 더 짧습니다.등쪽뿌리신경절(Dorsal root ganglia)을 뉴로필라멘트(neuro filament)에 대해 염색하였으며, 이는 녹색으로 표시되었습니다. PLL이 코팅된 유리 및 유리 위 섬유에서 3일간 배양한 후, 등쪽뿌리신경절로부터 신경돌기(neurites)가 방사형으로 뻗어 나옵니다. 또한 섬유 위에서 인접한 신경돌기들이 상당 부분 중첩되어 나타납니다.신경돌기 또한 신경절로부터 방사형으로 뻗어 나옵니다. 하지만 이후 신경돌기는 방향을 틀어 정렬된 섬유의 방향을 따라갑니다. 이러한 절차들을 숙달하면 인접한 신경돌기 간의 겹침이 현저히 줄어듭니다.전기 방사는 약 30분 정도에 완료할 수 있으며, 운동 뉴런과 감각 뉴런은 약 2시간 후에 얻을 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 멸균 기술을 사용하는 것이 중요합니다. 뉴런의 생존율을 극대화하기 위해서는 반복 단계에서 화염 연마된 피펫을 사용하는 것이 필수적입니다.또한, 접착 분자와 전기 방사 섬유를 적절한 시간 동안 배양하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 섬유를 polylysine으로 1시간 미만으로 코팅하면 세포 접착을 지원하기에 코팅이 불충분하게 됩니다. 반면, polylysine을 하룻밤 동안 방치하는 등 너무 오래 두면 섬유가 분해될 수 있습니다.또한 대부분의 현미경으로는 배양 중 섬유 위의 뉴런을 시각화할 수 없다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이는 섬유와 뉴런 돌기의 모습이 매우 유사하기 때문입니다. 이 영상을 시청한 후에는 전기 방사 섬유 기질에서 배아 15일 차 쥐의 운동 뉴런 및 감각 뉴런 일차 배양을 성장시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.고전압 작업은 매우 위험할 수 있으므로 적절한 주의가 필요함을 잊지 마십시오. 작업자를 전기 방사 장치로부터 격리하기 위한 적절한 예방 조치를 항상 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

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