Name: Permeabilized의 연결을 성장 콘스에서 Rhodamine - 굴지와 F - 굴지 이던가 엔드 레이블 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 신경 성장 원추에서 F-액틴 막대 끝을 시각화하고 정량화하는 방법을. 사포닌 투과화와 로다민-액틴 형광 표지를 사용하여 신경 세포의 액틴 역학을 연구할 수 있습니다.

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저자 박사 제임스 밤버그 이러한 연구 협력에 대한 그의 연구실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 NIH의 보조금 HD19950, EY07133에 의해 그리고 미네소타 의료 재단 교부금에 의해 투자되었다.

rhodamine - 굴지 라벨 들어, 뉴런은 35mm 플라스틱 요리의 하단에 배치, 또는 "비디오"메뉴로 접착 coverslips에 유리 coverslips에 양식 있습니다. 1. Coverslips 또는 "동영상"요리 준비 <ol><li> 많은 종류의 연결을 체외 기판에 접착제로 저조한 있습니다. 그들이 적절하게 청소하고 준비하지 않는 경우이 절차에 필요한 유리 coverslips는 충분한 신경 세포 - 기판 접착력을 허용하지 않을 수 있습니다. 유리 coverslips을 세척하고 청소 산성에 대한 자세한 절차는 뱅커와 고슬린으로 편집한 도서 Culturing의 신경 세포에 설명되어 있습니다. 또는 avidly 기판 분자를 바인딩 coverslips, 위해 nitrocellulose 코팅이 단계 1.7 아래 1.8에 설명되어 있습니다. </li><li> 유리 coverslips (예 : 18mm의 사각형 또는 24mm 원)는 DH 2 O에 씻어서 유기 성분을 제거하는 드라이 열을 가능한 (≥ 225 ° C) 한 (며칠 최소 최대 3 개월 이상으로)에 구운 아르 화합물. 1.6 또는 1.3으로 진행 동영상 요리 단계로 이동합니다. </li><li> 고해상도 videomicroscopy에 얇은 투명 유리 기판을 만들려면, 적절한 직경의 원형 구멍 전기 코크 송곳 (또는 이와 유사한 악기)를 사용하여 35 또는 50mm 플라스틱 페트리 또는 조직 문화 요리의 바닥에 뚫고있다. 드릴링은 플라스틱 균열 피하기 위해 가벼운 압력으로 천천히 이루어집니다. 뚫고 구멍의 가장자리는 양쪽으로 부드러운 표면을 만들 가위로 스크랩한 있습니다. </li><li> 1.1 또는 1.2에서 설명한대로 유리 coverslips는 조직 문화의 사용을 위해 청소하고 있습니다. Coverslips은 무독성 실리콘 수족관 시멘트 (18x18mm의 coverslips 들어, 12mm 직경 비트를 사용)를 사용하여, 구멍을 통해 장소에 붙어있다. 시멘트는 24 시간 동안 치료합니다. </li><li> (다음 단계는 살균 조건을 사용하여 완료) 비디오 요리 살균 DH 2 O 3 번 씻어서 건조 공기에 사용할 수 있습니다. </li><li> Coverslips이의 연결을 문화 기판 분자로 코팅하고 있습니다. 첫째, coverslip의 표면 (18x18 coverslip 250 μL) 100 μg / ML humidified 38 ° C 배양기에서 4-8 시간 (또는 야간)을 PBS에 폴리 - D - 라이신의 솔루션을 코팅합니다. Coverslips 그때 폴리 - D - 라이신 언바운드을 제거하는 살균 DH 2 O 3 번 씻어서 건조 공기 사용할 수 있습니다. 많은의 연결 타입은 혈청 단백질이 배지에 포함되어있다면, 폴리 - D - 라이신 혼자와 코팅 coverslips에 양식 있습니다. 그러나, 생체내 조건에서 더 관련성이 높은 결과 자연 기판 분자를 사용하여 얻을 수 있습니다. 이러한 laminin, fibronectin 또는 L1 CAM (1-20 μg / PBS에 ML) 이러한 분자의 솔루션은, 직접적으로 4-8 시간이나 야간을위한 폴리 - D - 라이신 코팅 coverslips에 적용하지만, 우리가 실험실에서 우리는 정기적으로 수 외투 단백질 기판 바인딩을 높이기 위해 세포 유착 분자를 적용하기 전에 nitrocellulose의 박막으로 준비 coverslips. </li><li> 백퍼센트 아밀 아세테이트 5 ML에 5g의 nitrocellulose를 용해하여 1 % nitrocellulose 솔루션을 확인하십시오. coverslip이 솔루션을 10 μL를 적용하고 부드럽게 표면을 통해 그것을 확산. 에어 건조 10 분. </li><li> 25 μg / ML laminin 또는 4 μg / PBS에 ML L1 CAM 및 nitrocellulose 표면에 걸쳐의 솔루션을 250 μL을 적용합니다. humidified 38 ° C 배양기, 기음 기판에 4 시간 (또는 야간) 부화 즉시 배지를 추가, 기판이 건조하지 않도록. </li></ol> 2. 의 연결을 문화의 준비 <ol><li> 배아 일 7.2 여자의 배아는 계란에서 제거하고 stereomicroscope를 사용하여, 흉부 및 복부의 내장을 제거하는 절개 10 % 혈청 배지를 포함 100mm 배양 접시에 배치됩니다. </li><li> 배아는 다음 매체 씻어서 액체 매체와 60mm 요리로 옮겨 더욱 등의 루트 신경 (DRG) 또는 신경 망막 조직의 explants을 제거하고 준비를 해부하고 있습니다. 방법과 홀렌백 및 밤버그하여 편집한 셀 생물학, 신청 : 자세한 해부 설명은 세포 생물학, 볼륨 71, 뉴런의 방법에서 찾을 수 있습니다. DRG의 explants는 1/2-whole 신경이며, 망막 신경 explants 직경이 1mm 이하입니다. </li><li> 외부 조직의 explants 청소 후, 개별 explants는 문화 매체와 문화 요리에 이미있는 coverslips에 시계 집게로 이동됩니다. 해부 현미경, explant는 부드럽게 인큐베이터로 운반하는 동안 움직임을 방지하기 위해 집게로 coverslip의 중심을 누르면됩니다. Explants는 산도 7.4-10 MM HEPES와 버퍼와 humidified 38 ° C 배양기에서 하룻밤 배치 B27 첨가제와 F12 매체 양식입니다. 필요에 따라 성장 요소는 문화 매체, 추가할 수 있습니다. E7 DRG 뉴런이 추가 neurotrophins없이 explants에서 axons을 연장할 수 있지만 Neurotrophins는 종종 기존의 배아에서 문화를 DRG에 추가됩니다. 신경 망막의 Explants이없이이 문화 매체 axons을 확장성장 요인을 dding. </li><li> 문화는 아래의 절차를 시작하기 전에 충분한 axonal 가지를 허용하기 위해 최소한 18 시간 동안 incubated 수 있습니다. </li></ol> 3. Rhodamine - 굴지의 Permeabilization 버퍼의 준비 <ol><li> 138 MM KCl, 10 MM 파이프, 3 MM EGTA, 4mm짜리 MgCl 2, 1 % BSA (산도 = 6.9)이있는 permeabilization 버퍼의 주식 솔루션은 4 명이 C11에서 이주까지 계속하실 수 있습니다. 그냥 사용하기 전에 다음 구성 요소의 최종 농도에 대한 추가됩니다 : 0.025 %의 사포닌, 0.1 MM ATP, 100 nm의 알렉사 - 형석 350 phalloidin합니다. </li><li> 별도의 솔루션은 또한 신선하게 바로 이와 같은 구성 요소를 더한 0.45μM rhodamine 비 근육 굴지 솔루션 교대 vortexed와 rhodamine - 굴지의 대단히 짧은 시간을 해산 5 분 tritrated이다와 함께 사용하기 전에 준비하고, 초기 permeabilization 단계 중 한 분 vortexed입니다 튜브의 중합을 방지하기 위해. 그럼에도 불구하고, 튜브의 필라멘트 조립에 문제가있을 경우,이 솔루션은 사용하기 전에 centrifuged 수 있습니다. </li></ol> 4. F - 굴지 이던가 끝에 Rhodamine - 굴지의의 연결을 문화와 정관의 Permeabilization <ol><li> DRG 또는 망막 explants와 문화 요리는 조심스럽게 인큐베이터에서 제거되고 다음 단계는 실온에서 수행됩니다. </li><li> 솔루션의 모든 변경은 신중하게 이루어져야합니다. 피펫 팁는 coverslip의 가장자리에 배치해야하고, 솔루션은 제거하고 천천히 그리고 최소한의 힘으로 추가되어야합니다. </li><li> 문화 매체는 조심스럽게 피펫으로 제거하지만 꾸준히, 그리고 세포를 커버하기에 충분한 permeabilization 버퍼는 1 분 (18mm X 18mm coverslip, ~ 60 μL를위한)에 대한 추가됩니다. 문화 permeabilization 버퍼를 추가하기 전에 다른 솔루션과 씻어서되지 않으며 coverslip은 permeabilization 버퍼를 추가하기 전에 건조 허용되지 않습니다. </li><li> permeabilization 버퍼는 부드럽게 피펫으로 제거 4 분 0.45 μm의의 rhodamine 비 근육 굴지 포함된 permeabilization 버퍼로 대체됩니다. </li><li> 4 % paraformaldehyde (실험실 학년, 인산염 버퍼, pH를 7.3로 만든), 0.05 %의 글루 타 알데히드와 10 %의 자당의 솔루션을 추가하여 rhodamine - 굴지 함유 버퍼 부드럽게 피펫으로 제거하고, 신경이 고정됩니다. 5 분 고정 후 coverslips는 부드럽게 PBS로 씻어서 있으며, 3 인치 유리 슬라이드에 Slowfade에 장착. </li><li> 변화하는 솔루션에 다른 접근법은 흐름 세포를 사용하는 것입니다. 이것은 상업적으로 사용 가능한 유동 세포 수, 또는 간단한 흐름 세포는 coverslip의 모서리에 스페이서로 플라스틱 작은 조각 (두께 ≤ 1mm)을 넣어 만든 다음 위에 동일한 크기 coverslip을 장착 수 coverslip. 솔루션은 흐름 세포의 한쪽에 피펫을 배치하고 반대편에서 심지 (솜 또는 Kimwipe)와 솔루션을 철수하여 교환할 수 있습니다. </li><li> F - 굴지 가시까지 성장 콘에서 F - 굴지의 형광 - phalloidin 라벨에 rhodamine - 굴지의 결합은 60X 기름 침지 목표를 통해 에피 형광 광학과 시각이며, 이미지가 냉각 CCD 카메라를 사용하여 수집하고 있습니다. 공촛점 현미경을 향상 영상을 제공할 수 있습니다. </li><li> rhodamine - 굴지의 정관의 최고의 부량 모든 이미지는 각 이미지에 대한 디지털 카메라 감도 같은 이득 및 노출 설정을 사용하여 단일 세션에서 수집해야합니다. 라벨의 분석은 각 이미지의 상당 지역에서하여야한다, Metamorph, 이미지 J 또는 이미지 분석을위한 유사한 컴퓨터 도구를 사용할 수 있습니다. </li></ol> 이 절차의 변형 5. 유사 한 : 이전 Rhodamine - 굴지의 레이블에 라이브 셀 이미지를 수집 <ol><li> 비디오 요리는 예열 현미경 스테이지에 배치하고 있으며, 라이브 성장 원뿔 이미지는 회수됩니다. Gridded coverslips 사용할 수 있습니다, 또는 새겨져 및 / 또는 coverslip에 펜 자국은 더 쉽게 라벨 이후에 특정 세포를 찾을 만들 수있는, 또는 비디오 접시는 절차의 기간에 대한 현미경 단계에 위치에 고정하실 수 있습니다. </li><li> rhodamine - 굴지의 Permeabilization, 정관 및 세포 고정은이나 현미경의 무대 역시 비디오 접시에 실시하고 있습니다. 고정 후 PBS는 즉시 이미지에 대한 동영상 요리에 추가됩니다. 나중에 이미지에 대한 샘플을 보존하려면 slowfade 설치 매체가 coverslip에 추가되고 동일한 크기의 coverslip는 부드럽게 (거품을 피하기 위해) 상단에 배치되고 가장자리는 다음 투명 매니큐어로 밀봉하고 있습니다. </li></ol> 6. 유사 둘째, 공동 레이블 추가 단백질 Immunochemistry <ol><li> (4.2-4.4) 위에서 설명한 Rhodamine - 굴지의 설립과 고정은 coverslips 또는 동영상 요리 교양 뉴런 실시하실 수 있습니다. </li><li> 고정 후, 및 PBS의 rinsing, 세포는 PBS에 0.​​1 M 글리신과 함께 15 분 치료 후로 추출 0.1 % 트리톤 X - 100 1 H.위한 2 %의 염소 혈청과 1 % BSA와 PBS에서 (TX - 100) Coverslips1 H.에 대한 1 % BSA가 포함된 PBS에 희석 기본 항체와 incubated 아르 coverslips 그런 다음 씻어서 1 H.에 대한 1 % BSA와 PBS에서 1:1000 희석에 형광 차 항체를 적용하기 전에 2 % 염소 혈청과 1 H 1 %의 BSA와 PBS의 TX - 100, 0.1 %에 incubated 아르 rinsing 후, coverslips 다시 30 분 2 % 염소 혈청과 1 % BSA와 0.1 % PBS에서 TX - 100 incubated 씻어서, 및 안티 변색 중간에 탑재하고 있습니다. 어떤 단백질의 지방화는 초기 permeabilization 단계 (4.3)에 의해 중단될 수 있습니다. 항체와 지역화, 0.05 %의 paraformaldehyde와 0.05 %의 글루 타 알데히드 이러한 단백질을 유지하는 것은 rhodamine - 굴지하여 가시 최종 라벨링에 영향을주지 않고 (rhodamine - 굴지 추가하기 전에 즉, 1) 분 permeabilization 버퍼에 추가할 수 있습니다. </li><li> 트리플 표시 성장 원뿔의 이미지는 형광 또는 공촛점 현미경에 의해 저장됩니다. </li></ol> 7. 유사 세 : F - 굴지 무료 이던가 엔드에 대한 지침의 단서의 효과 평가 <ol><li> 성장 인자 또는지도 큐를는 인큐베이터에서 접시를 제거하고 permeabilization 절차를 시작하기 전에 몇 분 동안 몇 NG / ML (또는 적절한 치료 시간)의 농도에서 보육의 문화 요리에 추가됩니다. 이것은 F - 굴지없는 가시 끝에 성장 요인이나지도 단서의 단기 효과 평가를하실 수 있습니다. </li><li> 의 연결을 문화와 동영상 요리는 예열 현미경 스테이지에 배치 될 수 있으며, 성장 요인이나지도 단서는 permeabilization와 rhodamine - 굴지의 설립을 시작하기 전에 성장 원뿔 근처의 구배에 micropipette에서 발표하실 수 있습니다. 예를 들어, NGF는 신경 망막 신경절 세포에 대한 신경이나 netrin를 DRG에 대한 공개 수 있습니다. 피펫은 permeabilization 절차를 시작하기 전에 같은 짧은 1-2로 분 동안 도입하실 수 있습니다. 이것은 성장 원뿔 선도 마진 (이미지에 대한 참조 인용문 10 참조) F - 굴지 무료로 가시 종료의 형성에지도 큐 기울기의 로컬 효과 평가를하실 수 있습니다. </li><li> 이러한 변화는 위의 6.2에서 설명한 기타의 연결 구성 요소의 항체 - 매개 라벨과 조합하여 사용할 수 있습니다. </li></ol> 8. 유사 푸르 : Transfected 뉴런에서 F - 굴지 무료 이던가 최종 라벨링 <ol><li> RNAi를 (형광등 식별 표시와 함께)를 사용하여 constitutively 활성 또는 지배 - 부정적인 구성이나 단백질 분해의 사용은 F - 굴지 무료 가시 끝이 규제에 단백질의 개입을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 성장 원뿔 내에 단백질의 지방화에 따라, 그리고 그것이 형광등 태그에 융합 경우, transfected 세포에 형광 단백질을 표현 permeabilization시 손실될 수 있습니다. 이 경우, 비디오 요리 미세 permeabilization 전에 transfected 세포를 식별하는 데 사용될 수 있으며, permeabilization는 transfected 세포의 위치를​​ 표시한 다음, 현미경 스테이지에서 수행할 수 있습니다. 또는 GFP - 굴지의 건설은 관심의 GFP - 건설과 함께 공동 transfected 수 있습니다. 이 경우, GFP - 굴지는 F - 굴지에 포함되며, permeabilization 후 transfected 세포의 식별을 가능하게, permeabilization에 의해 손실되지 않습니다. </li><li> 이 변화는 위의 7.1-7.3에 설명한 바와 같이,지도 신호의 추가와 함께하실 수 있습니다. </li></ol> 9. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. NGF의 글로벌 또한 DRG 성장 원추가 5 분 신경 성장 인자 (NGF)에 자극을 때, 굴지의 중합은 최고의 여백에 자극합니다. 총액 F - 굴지과 성장 원추 최고의 마진에서 F - 굴지 가시 끝을을 증가 시키며, rhodamine - 굴지 라벨의 밝은 밴드는 성장 콘 주변 볼 수 있습니다. 그림 1은 unstimulated DRG 성장 원뿔과 NGF 자극 DRG 성장 원뿔에 rhodamine - 굴지의 설립을 비교합니다. 병합된 이미지의 녹색 형광이 phalloidin의 성장 원추의 F - 굴지에 대한 라벨과 빨간 rhodamine - 굴지의 라벨입니다. 가시 끝 라벨을 잘 제어는 단계 4.2 4.3에서 permeabilization 버퍼에 10-6 M 이상 cytochalasin B 또는 D를 추가하는 것입니다. Cytochalasins 캡 F - 굴지 가시 끝이 및 가시 엔드에 rhodamine - 굴지 바인딩 억제. 이것은 심각하게 감소하거나 셀에 rhodamine - 굴지의 결합을 제거한다. 스케일 바, 10 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. NGF 그라디언트 로컬 F - 굴지 가시 끝을을 증가시킵니다. 릴리즈 NGF가 F - 굴지의 무료 가시 끝을 라벨 뒤에 2 분 동안 DRG 성장 원뿔의 한쪽으로 가져온 것을 micropipette가. 아래의 이미지는 NGF의 그라디언트 로컬 가깝게 피펫으로 성장 원추 지역에서 F - 굴지 무료 가시 종료 증가를 자극 해당 노출을 보여줍니다. 병합된 이미지는 녹색으로 phalloidin을 보여줍니다그리고 빨간색 rhodamine - 굴지. 스케일 바, 10 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 활성 음의 단백질은 성장 원추 최고의 여백에 축적. phospho-Ezrin/Radixin/Moesin의 Immunocytochemical 라벨 (펌)를 F - 굴지 무료 가시로 끝납니다. 글루 테르 알데히드 (0.05 %)과 paraformaldehyde (0.05 %)은 음의 현지화을 보존 한 분의 초기 permeabilization 버퍼에 추가되었습니다. Rhodamine - 굴지, 빨강, 파마, 녹색, phalloidin, 파랑. 스케일 바, 10 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 굴지의 중합의 자극 활성 음의 단백질이 필요합니다. Dissociated DRGs는 GFP - 굴지와 GFP 컨트롤 플라스미드 또는 지배 음수 Ezrin / Radixin / Moesin (DN 안건) 건설과 함께 공동 transfected되었습니다. GFP - 굴지의 사용은 permeabilization 후 transfected 세포의 식별을 허용합니다. 여기, NGF 전에 F - 굴지 가시 종료의 라벨 5 분 추가되었습니다. DN 음과 transfected 성장 원추가 근처 untransfected 성장 원추 (하단 패널)와 대조 성장 원추 선도 여백 (로우어 미들 패널), 또는 GFP 제어 (어퍼 미들 패널)와 가시 엔드 수준을 감소 가지고 있습니다. Rhodamine - 굴지, 빨강, GFP - 굴지, 녹색. 스케일 바, 10 μm의.

<ol><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+Understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li>
<li>Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLetourneau%2C+P+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22">Encyclopedia of Neuroscience</a>. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).</li>
<li>Kalil, K., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+and+go%3A+Guidance+cues+signal+to+the+growth+cone+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobio%22%5BJournal%5D)">Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton.</a> Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).</li>
<li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40, 209-227 (2003).</li>
<li>Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins+take+the+reins+in+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins take the reins in growth cones.</a> Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).</li>
<li>Guan, K. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).</li>
<li>Gallo, G., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+growth+cone+actin+filaments+by+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues.</a> J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).</li>
<li>Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+filopodial+dynamics+through+actin-depolymerizing+factor%2Fcofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Sci+Inter%22%5BJournal%5D)">Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin.</a> Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).</li>
<li>Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin%3A+A+functional+node+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin: A functional node in cell biology.</a> Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).</li>
<li>Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ADF%2Fcofilin+mediates+attractive+growth+cone+turning+toward+nerve+growth+factor+and+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1.</a> Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).</li>
<li>Symons, M. H., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+polymerization+in+live+and+permeabilized+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts.</a> J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).</li>
<li>Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+stimulates+an+increase+in+actin+nucleation+and+filament+number+at+the+leading+edge+of+the+lamellipod+in+mammary+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells.</a> J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

방법은 성장 원뿔을 마이 그 레이션의 리더 가장자리에있는 굴지의 cytoskeleton의 역동적인 리모델링에 관련된 세포 구성 요소의 시간적 및 공간적 해상도를 허용 여기를 발표했다. 신속하게 굴지 필라멘트 중합을 자극 NGF 또는 netrin 같은 유인 분자의 동작으로 그림 1과 2에 표시된 활성화 ADF / cofilin 10 굴지 필라멘트 severing 만든 굴지 가시 종료 현지 증가로 드러났습니다. 방법은 radixin, 그림 3과 4의 그림 음 단백질로 중재 성장 콘 chemotropic 응답에 관련된 다른 단백질의 지방화를 허용합니다. 이러한 방법은 또한 마이 그 레이션하는 뉴런, glial 세포 또는 다른 세포 유형에 굴지 기반 운동성의 규정을 분석 적용할 수 있습니다. 성장 원뿔 또는 기타 작은 운동성이있는 구조의 섬세한 성격이 방법의 사용에 큰 제한 사항입니다. 성장 원뿔 최고의 마진이나 세포의 유사한 운동성이있는 지역 굴지의 필라멘트와 ...

<table><tbody><tr><td>18x18 mm 커버슬립</td><td>Gold Seal</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>35mm 페트리 접시</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>아쿠아리움 시멘트</td><td></td><td>DAP 100% 실리콘 아쿠아리움 밀폐제</td><td>모든 철물점</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (mw &amp;gt; 300,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td></td></tr><tr><td>천연 마우스 laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>L1 CAM</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>777-NC</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor 350 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22281</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 비근육 액틴</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>F12 배양 배지</td><td>Invitrogen</td><td>21700-075</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Slowfade </td><td>Invitrogen</td><td>536937</td><td></td></tr></tbody></table>

permeabilized의 연결을 성장 콘스에서 rhodamine - 굴지와 f - 굴지 이던가 엔드 레이블

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

성장 axons의 운동성이있는 팁은 성장 콘이라고합니다. 성장 원뿔 성장 콘 수용체를 바인딩 및 역학과 성장 원추 cytoskeleton 3-6의 조직을 규제 로컬 표현 분자지도 단서과 상호 작용에 의해 개발 조직을 통해 axons 탐색 리드. 이러한 항해 신호의 주요 목표는 성장 콘 주변과 지속적인 굴지의 중합 및 동적 개조 7을 통해 해당 드라이브의 성장 콘 운동성을 가득 채우고 굴지의 필라멘트 meshwork입니다. 긍정적이든 매력적인지도 단서는 자극 굴지 필라멘트 (F - 굴지) 유인 큐의 원본 가까이있는 성장 콘 주변의 지역에서 중합에 의해 회전 성장 원뿔을 유도. 이 굴지의 중합은 최고의 여백과 유인 대한 axonal 신장 지역 성장 콘 돌출부, 접착시킵니다. 굴지 필라멘트 중합 충분한 굴지의 모노머의 가용성과 모노머의 추가를위한 중합 핵이나 굴지 필라멘트 가시 종료에 따라 달라집니다. 굴지 단량체는 여자가 망막 및 지느러미 루트 신경절 (DRG) 성장 콘에서 다량으로 사용할 수 있습니다. 무료로 F - 굴지 가시 엔드 모노머 추가를 위해 사용할 수있게되면 그 결과, 중합은 빠르게 증가합니다. 이것은 가까이 유인 80-10로 성장 원추 지역 계수 (ADF / cofilin)를 depolymerizing F - 굴지의 severing 단백질 굴지의 지역 활성화를 통해 여자는 DRG와 망막 성장 콘에서 발생합니다. 이 강한 ADF / cofilin 활동 중합을위한 새로운 F - 굴지 가시 종료를 만들 수 굴지의 필라멘트 서버스. 다음과 같은 방법이 메커니즘을 보여줍니다. F - 굴지의 총 내용은 형광 phalloidin와 얼룩의 시각이다. F - 굴지 가시 끝이 다른 운동성이있는 세포 11, 12의 이전 연구에서 적응하는 다음에 설명된 절차 permeabilized 아르 성장 콘 이내 rhodamine - 굴지의 결합에 의해 시각입니다. rhodamine - 굴지이 가시 엔드에 굴지의 모노머 추가에 대한 중요한 농도 이상의 농도에 추가되면, rhodamine - 굴지는 무료 끝이 가시로 조립. 매력적인 큐이 같은 성장 원뿔의 한쪽에 위치 micropipette에서 풀려나와 같은 그라디언트에서 제시하는 경우, F - 굴지 가시 종료에 rhodamine - 굴지의 설립은 micropipette 10쪽으로 성장 콘 측면에서 큰 것입니다 . 성장 원뿔은 작고 섬세한 셀 구조입니다. permeabilization, rhodamine - 굴지의 설립, 고정 및 형광 시각화의 절차는 모두 신중하게 수행하고 거꾸로 현미경의 무대에서 진행하실 수 있습니다. 이러한 방법은 마이 그 레이션하는 뉴런, 다른 기본 조직 세포 또는 세포 라인 지방 굴지의 중합을 연구에 적용할 수 있습니다.

의 연결을 성장 원뿔의 가시 끝이 시각화하고 F - 굴지 수치 방법을 설명합니다. 유리 coverslips에 culturing의 뉴런 후, 세포는 사포닌 함유 솔루션 permeabilized 있습니다. 그런 다음, rhodamine - 굴지 포함된 사포닌 버퍼와 짧은 부화는 무료 굴지 가시 종료에 형광 굴지 통합되어 있습니다.

Permeabilized의 연결을 성장 콘스에서 Rhodamine - 굴지와 F - 굴지 이던가 엔드 레이블

성장하는 축삭의 운동성 말단 부위를 성장 원추라고 합니다. 성장 원추는 국소적으로 존재하는...와 상호작용함으로써 발달 중인 조직 내에서 축삭이 경로를 찾아갈 수 있도록 안내합니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 축삭 유도 신호에 노출된 신경 성장 원추 내에서 액틴 중합이 가능한 유리 f actin barbed ends의 위치와 수를 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 커버슬립에서 배양된 뉴런을 사포닌 함유 완충액에 담가 성장 원추의 투과성을 높입니다. 그다음, 루민 액틴 함유 완충액에 세포를 4분 동안 노출시켜 루민 액틴이 성장 원추 내부로 들어가 유리 f actin barbed ends에 중합되도록 합니다.마지막으로, F actin의 분포를 보존하기 위해 세포를 화학적으로 고정하고 세척합니다. rumine actin이 결합된 barbed ends를 확인합니다. 형광 현미경 관찰 및 정량적 이미지 분석을 통해 유인 안내 신호(attractive guidance cues)가 유리 F actin의 수를 증가시킨다는 결과를 얻습니다.이동하는 성장 원추의 선단부에 위치한 barbed ends. 안녕하세요, 저는 미네소타 대학교 의과대학 신경과학과의 Paul Erno입니다. 오늘은 병아리 신경 성장 원추 배양 준비 과정을 시연하겠습니다.우리는 배아 내에서 시냅스 표적을 향해 축삭을 전진하게 하는 역동적인 세포골격 성분인 액틴 필라멘트의 barbed end를 성장 원뿔 내에서 시각화하는 방법을 시연하겠습니다. 이 방법은 액틴 역동성과 신경 성장 원뿔을 조사하는 데 사용되지만, 글리아, 신경능세포 또는 이동성 뉴런과 같은 다른 운동성 신경 세포에도 적용될 수 있습니다. 이제 절차를 시연하겠습니다.오늘 실험실 멤버인 박사후 연구원 Bonnie Marek과 MD PhD 학생인 Jose San Miguel Ruiz가 뉴런의 액틴(actin) 표지에 사용될 비디오 디쉬를 준비하겠습니다. 18mm 정사각형 또는 24mm 원형 유리 커버슬립을 증류수로 헹군 뒤, 건열 멸균기에서 3개월 이상 굽습니다. 커버슬립 세척을 위해 오븐 베이킹 대신 다른 방법을 사용할 수도 있습니다. 코르크 보어(cork boar)나 기타 도구를 사용하여 35mm 또는 50mm 플라스틱 페트리 접시 또는 조직 배양 접시 바닥에 적절한 직경의 원형 구멍을 뚫습니다. 그런 다음, 가위로 뚫린 구멍의 가장자리를 긁어 양면이 매끄러운 표면이 되도록 만듭니다.다음으로, 실리콘 수족관용 접착제를 사용하여 각 디시의 구멍 위에 세척된 커버슬립을 부착하고, 디시를 멸균 증류수로 여러 번 헹굽니다. 이제 디시에 기질 코팅을 할 준비가 되었습니다. PDL과 PBS 100 µg/mL 용액을 커버슬립 또는 비디오 디시에 도포하고, 습도가 유지되는 38 °C 인큐베이터에서 2~4시간 동안 배양합니다.PDL 용액을 흡입하여 제거하고 커버슬립을 멸균 증류수로 3회 헹군 후 공기 중에서 건조시킵니다. 다음으로, 5 mg의 nitrocellulose를 5 mL의 amyl acetate에 녹여 1% nitrocellulose 용액을 제조합니다. 이 용액 10 µL를 커버슬립 상단에 도포하고 기울여 표면 전체에 퍼뜨린 후 약 10분 동안 공기 중에서 건조시킵니다.마지막으로, 25 µg/mL laminin 250 µL 또는 4 µg/mL L1 cam 및 PBS를 니트로셀룰로오스 표면에 도포합니다. 습도가 유지되는 38 °C 인큐베이터에서 6~8시간 동안 배양합니다. 그 후 조직 배양 후드 내에서 기질을 흡입하여 제거하고, 기질이 마르지 않도록 즉시 배양액을 첨가합니다.Explan.배아 7일차 닭 배아를 해부하여 등쪽 뿌리 신경절(dorsal root ganglia, DRG) 또는 망막 신경 조직의 배양물을 준비합니다. DRG 이식편은 전체 신경절의 절반 크기로, 망막 절편은 직경 1 mm 이하로 준비합니다.해부 현미경 하에서 핀셋을 사용하여 박리된 조직(explan)을 커버 슬립 위에 올립니다. 그 다음, 인큐베이터로 옮기는 동안 움직이지 않도록 커버 슬립 중앙에 조심스럽게 눌러 고정합니다. 커버 슬립이 놓인 디쉬를 조심스럽게 옮겨 습도가 유지되는 온습도 인큐베이터에 넣고 하룻밤 또는 18시간 동안 배양합니다.이 기간 동안, explan으로부터 수백 µm 길이의 축삭이 뻗어 나옵니다. saponin A TP와 LOR three 50 fein의 다음 성분들을 추가하여 rumine actin 투과 버퍼를 준비합니다. 이 버퍼의 조성은 서면 프로토콜에 기술되어 있습니다.동일한 성분에 0.45 µM ermine non-muscle actin T rate를 추가하여 별도의 용액을 준비하고, 볼텍싱하여 섞은 후 신경 세포를 투과화 및 염색합니다. 인큐베이터에서 DRG 또는 망막 이식물이 담긴 배양 접시를 조심스럽게 꺼내어 다음 단계를 상온에서 수행합니다. 피펫을 사용하여 배양액을 조심스럽게 제거하고, 세포가 잠길 정도의 투과 버퍼를 추가한 후 1분 동안 인큐베이션합니다.투과 버퍼를 조심스럽게 제거하고 0.45 µM의 rumine non-muscle actin이 포함된 버퍼로 교체하여 4분 동안 배양합니다. 마지막으로 rumine actin 포함 버퍼를 제거하고 4% 파라포름알데히드와 0.05% 글루타르알데히드로 뉴런을 5분 동안 고정합니다. PBS로 조심스럽게 세척한 후 3인치 유리 슬라이드에 slow fade를 사용하여 마운팅합니다.R domine actin의 통합 정도를 최적으로 정량화하기 위해, 60 x 오일 침수 대물렌즈가 장착된 에피 형광 현미경을 사용하여 f actin, barbed ends로의 R domine actin 통합 및 성장 원추 내 f actin의 형광 phalloidin 표지를 시각화하십시오. 모든 이미지는 디지털 카메라의 감도 이득과 노출 설정을 동일하게 유지하여 단일 세션에서 수집해야 합니다. Metamorph Image J 또는 이와 유사한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 동일한 영역의 표지 결과를 분석하십시오.이 절차에 대해 몇 가지 변형을 수행할 수도 있습니다. 한 가지 변형은 F actin 및 barbed ends 외에 다른 단백질의 위치를 파악하기 위한 면역화학법을 포함하는 것입니다. 삽입된 r domine actin을 고정하고 PBS로 헹군 후, 다른 성장 원추 구성 성분에 대한 항체를 추가하고, 이어서 헹굼, 블로킹 및 r domine actin 및 형광 phalloidin과 함께 삼중 염색에 적합한 형광 2차 항체와의 배양 단계를 진행할 수 있습니다.세 번째 변형에서는 성장 인자 또는 유도 신호가 F ACT 및 유리 바브 엔드(free barbed ends)에 미치는 영향을 평가하기 위해, 인큐베이터 내의 배양 접시에 성장 인자나 유도 신호를 처리하고 5~15분 후에 접시를 꺼내 투과 절차를 시작합니다. 이를 통해 성장 인자나 유도 신호가 F ACT 및 유리 바브 엔드에 미치는 단기적 영향을 평가할 수 있습니다. 또는, 신경 세포가 배양된 비디오 접시를 가열된 현미경 스테이지 위에 놓고, 투과 및 로다민-액틴(rhodamine actin) 결합을 시작하기 전에 마이크로피펫을 사용하여 신경 성장 원추에 성장 인자나 유도 신호를 구배 형태로 방출합니다.성장 인자는 투과 절차를 시작하기 전 최소 1~2분 동안 처리할 수 있습니다. 투과 및 고정은 비디오 디시를 현미경 스테이지 위에 둔 상태로 진행할 수 있습니다. 이를 통해 성장 원추 내 F ACT 및 자유 바브드 엔드(free barbed ends) 형성에 미치는 가이드 큐 구배의 국소적 효과를 평가할 수 있습니다.이 영상은 NGF의 전역적 첨가에 반응하여 성장 원추의 모달 성장 가장자리가 빠르게 확장되는 모습을 보여줍니다. DRG 성장 원추를 신경성장인자로 5분 동안 전역적으로 처리하면, 선도 가장자리에서 액틴 중합이 촉진되어 성장 원추 주변부를 따라 로다민 액틴 결합의 밝은 밴드가 관찰됩니다. 이 영상은 NGF를 방출하여 여기에 표시된 NGF 기울기를 형성하는 마이크로 피펫 쪽으로 성장 원추가 회전하는 모습을 보여줍니다.A DRG 성장 원추의 한쪽 면이 2분 동안 NGF 농도 구배에 노출되면, F act 및 자유 바브드 엔드(barbed ends)로의 R domine actin 통합이 국소적으로 촉진됩니다. 이 예시에서는 면역화학법을 통해 phospho RIN ridin moin의 분포를 보여줍니다. NGF를 전역적으로 첨가하여 R Domine actin 통합을 통해 F ACT와 자유 바브드 엔드를 표지하는 것과 더불어, 여기서는 DRG 뉴런에 GFP actin과 우성 음성(dominant negative) ezrin ridin moisan 컨스트럭트를 공동 형질전환시켰습니다. f actin 바브드 엔드를 표지하기 5분 전에 NGF를 첨가하였습니다.우성 부정(dominant negative) ERM 구조체가 형질 도입된 성장 원추(growth cone)는 성장 원추의 앞쪽 가장자리에 f-actin barbed end가 거의 없으며, 이는 인접한 절제되지 않은 성장 원추와 대조적이라는 점에 유의하십시오. 이 절차를 면역화학법과 결합하면, f-actin 및 barbed end의 국소화와 actin 역학 및 조직을 조절하는 다른 단백질의 분포 사이의 관계를 파악할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안, 배양된 성장 원추의 섬세한 구조가 손상되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

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Permeabilized의 연결을 성장 콘스에서 Rhodamine - 굴지와 F - 굴지 이던가 엔드 레이블

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