Name: 에 대한 부정적인 선택 마커의 개발 Entamoeba histolytica /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: 배우세요 Entamoeba histolytica에서 FCU1 키메라 단백질과 5-fluorocytosine을 활용한 음성 선택 시스템을 검증하는 방법을. 이 기술은 유전자 교란 및 독성 인자 연구에 활용됩니다.

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우리는 FCU1 유전자의 순서와 함께 우리를 제공하는 닥터 필립 업스 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NIH 부여 AI 26649에 의해 지원되었다.

1. Entamoeba histolytica에 FCU 부정적 선택 시스템 <ol><li> 벡터 제어 라인 (HM1 / pKT3M) 및 실험 라인 (HM1/pKT3M-FCU1)은 이전에 설명한 기법 1,2에 의해 생성되었습니다. 종자는 T - 25 flasks에 재고 튜브에서 연구하에 라인 TYI - S - 33 3 중간 적절한 항생제 (12 μg / ML G418)을 추가하여 선택을 유지합니다. flasks, 37에서 성장 16~18시간 후 70-80% 합류해야 ° C. </li><li> 따뜻한 TYI - S - 33 중간에 5 Fluorocytosine (5 - FC, 시그마)의 새로운 50mM 주식 솔루션을 준비합니다. 와동이 엄격하게 몇 분 동안 완전히 5 FC를 해산합니다. 필터 - 필터 소독 0.22 μm의를 통해 전달하여 주식 솔루션을. </li><li> 3~5분 위해 얼음에 flasks를 삽입하고 실온에서 5 분 200xg에 centrifuging하여 세포를 수집하여 수확 trophozoites. 신선한 TYI 매체에서 펠렛을 Resuspend하고 세포를 계산합니다. </li><li> 전형적인 실험 설계 1 ML의 최종 볼륨에 48 잘 접시 잘 당 0.5 X 10 4 세포를 사용하며, 각 시험 조건에 대한 세중의 반복. 또한, 형광 측정을 촉진하기 위하여, 별도의 접시는 시점마다 각 변형에 사용됩니다. </li><li> 각 시험 5 - FC 농도, 세중의에 대해 잘 당 종자 0.5 X 10 4 세포. TYI 매체에서 항생제 선택 압력을 유지합니다. 지금 5 - FC 주식 솔루션과 각 잘하는 trophozoites의 필요한 금액을 추가합니다. </li><li> 37 무산소 가방에 접시를 품어 ° C. </li></ol> 2. 선택 효율성의 결정 <ol><li> 2 MG / DMSO에 셀 추적 녹색 CMFDA (Invitrogen)의 ML 주식 솔루션을 준비합니다. 작업 솔루션 주식​​ 혈청 무료 TYI 매체 1000 배 희석하기 위해. </li><li> trophozoite 문화 접시에서 완전히 매체를 제거하고 150 μL 혈청 무료 TYI 포함 CMFDA로 바꿉니다. 37 배양을 계속 ° C 1 시간을 위해. </li><li> 우물에서 염료 솔루션을 제거하고 Spectramax M2 microplate의 spectrofluorometer에서 접시를 참조하십시오. 여기 파장은 492 nm의에서 설정하고 형광 방출 517 NM에서 읽을 수 있습니다. </li><li> 테스트 transfectants 대 제어 세포에 대한 형광 값을 비교합니다. </li><li> 각 시간 간격에 접시를 읽고 계속합니다. 각 플레이트에 적절한 양의 (TYI 전용)과 부정 (25 μg / ML hygromycin) 제어 우물을 사용합니다. </li></ol> 3. 대표 결과 E. histolytica의 transfectants는 코돈 최적화 재조합 FCU1 (그림 1)의 강력한 표현을 보여주었다.이 프로토콜은 E.의 선택 제거에서 결과가 제대로 따라하면 0.5 MM 5 fluorocytosine의 존재에 FCU1을 표현 histolytica 세포. 제어 세포는 반면 5 - FC 5 MM의 농도에서 정상적으로 자라서 72 96 시간 사이의 합류에 도달 계속 (그림 2 - A). 치료 우물이 현미경으로 볼 때 48 시간에 FCU1지고 세포가 완전히 lysed 있습니다. 샘플 다수 (그림 2 - B)를 포함하는 양적 연구에서 사용되는 중요한 염료 CMFDA, 물들일 때 이들은 또한 형광 감소 보여줍니다. FCU1/5-FC 시스템 E.위한 효과적이고 강력한 부정적인 선택 도구 histolytica은 trophozoites. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. E. 생성 부정적인 선택 마커를 표현 histolytica HM1 transfectants (A) 재조합 단백질 FCU1는 안티 - C Myc 항체 (상단 패널)을 사용하여 서양 얼룩을 발견했다. 예상했던대로, 42kDa 밴드는 아니지만 혼자 벡터 제어 transfectants의 FCU의 transfectants에서 총 lysate에서 (화살표로 표시) 감지 수 있습니다. 하단 패널은 같은 얼룩이 로딩 제어로 안티 굴지 항체와 탐지 보여줍니다. (B) 정량 실시간 PCR의 결과 lgl4 제어하는 표준 FCU1 특정 mRNA의 표현을 보여주는. <img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> E. 그림 2.에서는 체외 마약 감도 부정적인 선택 마커를 표현 histolytica의 transfectants (A) 제어 transfectants 및 (b) FCU1 표현 transfectants 48 - 잘 판에 교양의 생존 곡선. 세포의 증가 농도의 존재에 재배되었던 prodrug - 5 - fluorocytosine, X - 축에 표시된로 세포 생존을 각 시간 간격으로 CMFDA의 얼룩에 의해 계량했다. Y - 축 단위 형광을 나타내고 살아있는 세포 인구의 직접적인 반영이다. FCU1 표현 transfectants가 컨트롤에 비해 0.5mM prodrug 농도에 큰 감도를 보여주는 점에 유의하십시오. 대한 세포는 COM 이러한 우물에 120h 시점에서 관찰되지 않았습니다현미경 해당 컨트롤 우물 (데이터가 표시되지 않음)에서 본 합류 성장 앞에 서. Hygro는 대조군으로 사용 25μg / ML hygromycin를 나타냅니다.

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</ol>

이 비디오의 제작이 문서에서 사용되는 시약의 일부를 생산 시그마 알드리치, Inc의 후원했다.

Entamoeba 분자 생물 학적 도구에서 상당한 진보가 있었다고했지만 유전자 4 삭제하거나 혼란 사용할 수있는 현재의 방법은 없습니다. 유전자 특정 표현의 최저는 RNA 6 방해 작은 헤어핀 RNAS 5의 사용에 의해 달성하고 bacterially dsRNA 7 표현되었습니다. 각각의 대상 유전자에 대한 효과적인 동시에 그러나 이러한 방법은 비용이 많이 드는 화학 물질, 항생제에 대한 지속적인 선택과 시간이 지남에 따라 발생 복귀의 높은 발병률 (알리샤 린포드, 개인 통신) 8으로 인해 지속적인 검증에 대한 필요성의 사용 등 여러 가지 제한이 있습니다. DNA 복제 9 기원에 대한 엄격한 순서 요구 사항이 분명이 아니므로 모든 플라스미드는 Entamoeba에 복제할 수 있습니다, 그래서 한번 transfected, 그것은 보통 플라스미드 치료하기가 어렵습니다. 이것은 재조합과 유전자 녹아웃 실험에 그대로 plasmids의 가능한 사용을 제한합니다. 부정적인 선택 마커들은 재조합 subpopulations을 제거하는 데 사용할 수있는 방법을 대상으로 유전자의 핵심 구성 요소입니다. 우리는 성공적으로 코돈을 표명한 것은 Entamoeba histolytica에 FCU1 유전자를 최적화하고 부정적인 선택 마커로서의 가능성을 테스트했습니다. 이 유전자 융합은 인간의 종양 세포의 자살 유전자 치료에 사용되며 RNA 및 DNA 합성 억제에 10 결과 독성 하류 제품에 prodrug 5 - FC를 대사되었습니다. FCU1 최근 Plasmodium 다른 protozoan 기생충에 부정적인 선택 마커로 사용되고 있습니다. FCU1을 표현 Plasmodium berghei 세포는 5 - FC와 함께 체외 및 생체내 치료의 prodrug으로 거의 1000 배 더 민감한 것으로 발견된의 99.9 % 이상 죽였다 말라리아 11 erythrocytic 단계 마우스 모델에서 재조합 기생충 감염. E.가 FCU1을 표현 histolytica 전지는 P.에서 관찰 감도 달리 prodrug 5 FC에만 30 배 증가 감도를 보여주었다 berghei. 이런 경우에 대한 가능성이있는 이유는 독성 metabolites와 경쟁의 성장 매체에서 사용 가능한 세포핵의 대형 수영장 수 있습니다. P. 모두 berghei와 P. falciparum FCU1 마커는 타겟 유전자 장애에 사용되었습니다. 연구 11,12. 우리는 상동 재조합을 사용하여 Entamoeba의 게놈을 조작하는 것을 목표로하고 있습니다. FCU1/5-FC 부정적인 선택 시스템의 검증은 이러한 목표를 향한 중요한 단계입니다.

<table><tbody><tr><td>TYI-S-33 배지</td><td>ATCC</td><td></td><td>본문에 참조 포함</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F7129%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC">5-Fluorocytosine&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7129</td><td></td></tr><tr><td>Cell tracker green CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max M2 플레이트 리더</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

에 대한 부정적인 선택 마커의 개발 entamoeba histolytica</em

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica은 amebiasis의 원인이되는 에이전트이며, 세계 인구의 10 %까지 감염. 유전자 표현의 위 - 아래로 규제를 활성화 분자 기술은 안정적으로 유지 plasmids의 transfection에 의존하고 있습니다. 이들은 Entamoeba의 독성 요인 우리의 이해를 증가하지만, 용량은 역방향 유전학 실험,이 기생충의 연구에 큰 이점 될 수있는 것이다 게놈로 외인성 DNA를 통합할 수 있습니다. 이 유기체에 의해 제공 도전 상동 재조합 이벤트와 transfected trophozoites에서 플라스미드 DNA episomal 치료 난이도에 대해 선택하는 무능력을 포함합니다. 외인성 DNA, 타고난 게놈 통합 이벤트가 발생하는 trophozoites의 식별의 주요 문제에 대한 높은 배경으로 나중에 발생합니다. 우리는 효모 사이 토신의 deaminase 및 유라실 prodrug 5 ​​- fluorocytosine (5 - FC)과 phosphoribosyl transferase 키메라 (FCU1)와 선택의 형질 표현에 따라 부정적인 선택 시스템의 개발을보고합니다. FCU1 효소는 독성 5 - fluorouracil, 5 - fluorouridine - 5&#39; - monophosphate. E.으로 무독성 5 FC로 변환 FCU1을 표현 histolytica 라인 제어 변형에 비해 prodrug에 더 민감한 30 배 이상으로 발견되었다.

우리의 부정적인 선택 시스템의 개발을보고<em&gt; E. histolytica</em&gt; 형질 키메라 단백질의 표현 (FCU1)과 prodrug 5 ​​- fluorocytosine와 선택에 따라. FCU1 단백질은 효모 사이 토신의 deaminase와 phosphoribosyltransferase 유라실의 융합이다. FCU1 표현 증가의 결과<em&gt; E. histolytica</em5 fluorocytosine 향해&gt; 감성.

에 대한 부정적인 선택 마커의 개발 Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica는 아메바성 이질의 원인균이며 전 세계 인구의 최대 10%를 감염시킵니다. ...를 가능하게 한 분자 생물학적 기법들은...

본 실험의 전반적인 목표는 5-FC 및 FCU1 시스템을 Entamoeba histolytica의 음성 선택 방법으로 사용하는 것을 검증하는 것입니다. 48-웰 플레이트에 E. histolytica를 분주하고, FCU1 유전자 또는 적절한 벡터 대조군을 발현하는 라인을 형질전환합니다. 세포를 전구약물인 5-FC로 처리합니다. FCU1을 높은 수준으로 발현하는 세포에서 5-FC는 독성 최종 생성물로 효율적으로 전환됩니다. 생존한 세포 집단을 CMFDA로 염색하여 5-FC 존재 하에 FCU1 발현 세포가 선택적으로 제거되었음을 입증하고, 음성 선택의 효율성을 정량적으로 비교합니다. 이 음성 선택 시스템을 통해 형질전환된 E. histolytica로부터 최초로 에피솜 플라스미드를 제거할 수 있을 것입니다.전통적인 유전자 조작에 대한 저항성이라는 난관을 고려할 때, 이 방법은 유전자를 파괴 및 삭제한 후 당사의 약물 발견 프로그램에서 표적 VIR 인자들을 테스트할 수 있게 해줄 것입니다. 트로포조이트(Trophozoites)는 스톡 배양액이 배양액 내에서 얼마나 잘 성장하는지에 따라 차이가 있을 수 있습니다. 시작 단계에서의 오류는 아티팩트를 생성할 수 있으므로, 초기 배양액의 품질 관리가 매우 중요한 초기 단계입니다.연구 대상인 inba hisa 라인을 스톡 튜브에서 T 25 플라스크로 접종하고, 적절한 항생제가 첨가된 TYIS 33 배지에서 선택 배양을 유지하십시오. 플라스크를 37 °C에서 16시간 동안 배양하여 세포 밀도가 약 80% confluency에 도달하게 합니다. 이 절차를 위해, 항상 따뜻한 TYIS 33에 50 mM 농도의 5-fluorouracil(FC) 스톡 용액을 신선하게 준비하십시오.배지를 수 분 동안 격렬하게 볼텍싱하여 5 FC를 완전히 용해시킨 후, 0.22 micron 필터로 스톡 용액을 여과 멸균하여 트로포조이트(trophozoites)를 수확합니다. 플라스크를 얼음 위에 3~5분 동안 두고, 상온에서 200 ×g로 5분간 원심분리하여 세포를 수집합니다. 펠렛을 신선한 TYI 배지에 다시 현탁하고, 이후의 형광 측정을 용이하게 하기 위해 세포 수를 측정합니다.실험은 3회 반복 수행하며, 각 시점별 균주마다 별도의 48웰 플레이트를 사용하십시오. 각 테스트당 웰당 0.5 mL 부피에 0.5 × 10⁴ cells를 접종하십시오. 5-FC 농도를 설정하고, TYI 배지에서 항생제 선택 압력을 유지하십시오. 이제 각 웰에 필요한 양의 5-FC 스톡 용액을 첨가한 후, TYI 배지를 넣어 최종 부피를 1 mL로 맞추고 플레이트를 혐기성 백에 넣어 37 °C에서 배양하십시오.DMSO에 CellTracker Green CMFDA의 2 mg/mL 스톡 용액을 준비합니다. 그 다음, 지정된 실험 시점에 혈청이 없는 TYI 배지로 스톡 용액을 1000배 희석하여 작업 용액을 만듭니다. Tropho Xite 배양 플레이트에서 배지를 완전히 제거하고 CMFDA가 포함된 혈청 없는 TYI 배지 150 µL로 교체합니다.37 °C에서 1시간 동안 배양을 계속한 후, 웰에서 DI 용액을 흡입하여 제거합니다. 마지막으로 excitation 파장 492 nm 및 fluorescent emission 파장 517 nm를 사용하여 SpectraMax M2 마이크로플레이트 분광 형광 광도계로 플레이트를 판독합니다. 대조군 세포와 테스트 형질전환 세포의 형광 값을 비교합니다.각 시간 간격마다 플레이트를 계속해서 판독하십시오. 각 플레이트에는 항상 적절한 양성 및 음성 대조군 웰을 사용하십시오. Western BLO 분석을 통해 yeast cytosine deaminase와 uracil phospho rib transferase 키메라인 FCU one을 발현하는 lya 형질전환체의 성공적인 생성이 입증되었습니다.이러한 결과는 정량적 PCR 측정값에서도 반영되었습니다. 5-fluorouracil 제어 세포는 최대 5 mM 농도까지 정상적으로 성장하며 72시간에서 96시간 사이에 합류(confluence)에 도달합니다. 이와 대조적으로, FCU1을 발현하는 E. histolytica 세포는 명시야 현미경 관찰 시 0.5 mM의 전구약물 존재 하에서 선택적으로 제거되었습니다.E histolytica 세포에서 FCU를 발현시켰을 때 5종의 FC Pro 약물에 대해 나타나는 선택적 반응은 세포의 소실(clearing)을 통해 확인할 수 있습니다. 본 실험에서는 형질전환 72시간 후까지 배양합니다. 이 실험을 수행할 때는 매 시점마다 성장을 모니터링하는 것이 중요합니다.이 방법은 hit and run 돌연변이 유발법에 사용될 수 있으며, 본 연구에서는 이를 통해 Inba Hisa의 병원성에 관한 중요한 질문들에 대한 답을 찾고자 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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