단클론 박테리아 배양을 준비하는 기술

박테리아 배양으로 시작하여 연속 희석을 수행하여 세포 밀도를 줄입니다.

최종 희석액의 작은 분취량을 취하여 한천 플레이트에 놓습니다.

멸균 유리 구슬을 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포의 공간적 분리를 보장하며, 이는 잘 분리된 콜로니를 얻는 데 필수적입니다.

유리 구슬을 제거한 다음 플레이트를 뒤집어 배양합니다.

개별 세포는 증식하고 별도의 콜로니를 형성하여 각 콜로니가 유전적으로 균일한 박테리아 집단으로 구성된 단클론 배양을 생성합니다.

개별 콜로니를 선택하고 액체 배지가 포함된 별도의 튜브로 옮깁니다.

교반하면서 튜브를 배양합니다. 배양 후 각 배양의 탁도를 평가합니다.

배지에 부유하는 박테리아 세포는 빛을 산란시켜 세포 밀도가 증가함에 따라 배양액을 더 탁하게 보이게 합니다.

다운스트림 응용 분야를 위해 가장 밀도가 높은 단클론 박테리아 개체군을 나타내는 탁도가 가장 높은 튜브를 선택하십시오.

LB 레녹스 육수 100밀리리터로 준비한 세 병에 1번, 2번, 3번으로 라벨을 붙입니다.

생성된 박테리아 배양액 0.1밀리리터를 병 1에 피펫팅합니다. 병의 뚜껑을 덮고 1분 동안 손으로 휘두르면 균질한 용액이 됩니다. 다음으로, 1번 병에서 2번 병으로 0.1밀리리터를 피펫팅합니다. 다시 병의 뚜껑을 덮고 손으로 1분 동안 휘두릅니다. 2번 병에서 3번 병으로 0.1밀리리터를 피펫팅하여 마지막 희석을 수행합니다. 병의 뚜껑을 덮고 손으로 1분 동안 흔듭니다.

그런 다음 20마이크로리터의 용액을 4개의 페트리 접시 각각에 피펫팅합니다. 그런 다음 고압멸균된 직경 3mm의 유리 구슬 4개를 각 페트리 접시에 넣습니다. 페트리 접시의 뚜껑을 닫고 손으로 1분 동안 흔듭니다.

완료되면 페트리 접시를 거꾸로 뒤집고 접시를 섭씨 37도 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.

스테인리스 스틸 주걱을 사용하여 4개의 페트리 접시에서 생성된 단클론 박테리아를 골라 12.5밀리리터의 LB Lennox Broth가 들어 있는 나머지 7개의 튜브에 넣습니다. 튜브를 섭씨 37도 인큐베이터에 24시간 동안 방치한 다음 시각적 비색법을 사용하여 광산란이 가장 큰 튜브를 선택합니다.