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먼저 박테리아가 정착한 쥐 장 부위가 담긴 슬라이드에 박테리아 16S rRNA 특이적 형광 제자리 하이브리다이제이션(FISH) 프로브를 첨가하는 것부터 시작한다.
커버슬립을 깔아 액체가 포함된 프로브를 펴고 증발을 방지하세요.
슬라이드를 가습 챔버에서 고온으로 부양하세요.
이로 인해 RNA 2차 구조가 펼쳐지고, 박테리아 16S rRNA에서 상보적인 서열과 프로브의 하이브리드화가 촉진됩니다.
커버슬립을 제거하고 슬라이드를 미리 예열된 세척 버퍼에 담아 분리된 프로브를 제거합니다.
생리적 pH를 유지하기 위해 인산염 완충제로 세척하세요.
점액 특이적 염료와 핵 염료가 포함된 카운터 스테인을 바르고 배양합니다.
이 염료들은 장내 점액과 박테리아 및 숙주 세포의 DNA에 선택적으로 결합합니다. 버퍼로 슬라이드를 세척하고, 마운트 커버를 마운트 매체로 슬립 슬립으로 슬라이드에 고정하세요.
공초점 현미경으로 FISH 표지된 박테리아, 장 세포, 그리고 절편 내 점액층을 관찰합니다.
액체 차단제나 PAP 펜을 사용해 각 조직 절편 주위에 매우 밀착한 원을 만들어 하이브리다이제이션 용액이 덮어야 할 확장 면적을 제한하고, 잉크 접촉을 피하세요.
하이브리다이제이션 용액을 준비하고 50마이크로리터당 0.5마이크로그램의 프로브를 추가합니다. 용액을 슬라이드의 섹션에 피펫으로 바르세요. 유연한 플라스틱 커버슬립을 덧씌워 액체 양이 전체 구간을 덮도록 하세요.
과도한 하이브리다이제이션 용액이나 PBS에 적신 물티슈나 종이 타월을 넣어 습한 챔버를 만듭니다. 증발을 줄이기 위해 설정된 프로브에 따라 최소 3시간 동안 습한 실내 45도에서 50도 사이에서 배양합니다. 플라스틱 커버 슬립을 제거하고, 슬라이드를 50도까지 예열한 코플린 병 안의 FISH 세척 버퍼에 보관하세요.
코플린 병을 다시 50도 오븐에 10분에서 20분 정도 넣으세요. FISH 세척 완충제를 제거하고 코플린 병에 PBS로 교체하세요. 코플린 병에 PBS를 다시 채운 직후 PBS를 디캔트하세요.
슬라이드를 병에서 꺼내 피펫으로 전체 섹션 위에 카운터 스테인을 뿌리세요. 피펫 팁으로 조직에 닿지 않도록 주의하세요. 섭씨 4도에서 45분간 배양하세요. 얼룩은 새 PBS로 세 번 빠르게 세척하세요.
슬라이드 뒷면을 물티슈나 종이 타월로 닦고, 피펫 팁에 연결된 진공 라인을 이용해 대부분의 PBS가 섹션에서 증발하도록 하세요. 마운팅 매체를 사용해 섹션을 장착하세요. 커버슬립을 슬라이드에 고정하려면 투명 매니큐어를 가장자리에 칠해 주세요. 슬라이드 가장자리에서 벗어나도록 주의하세요. 상온에서 굳히세요.