레 지오넬라 기우모균 외막 소포의 초원심분리 기반 분리

먼저 외막 소포를 방출하는 병원성 그람 음성 박테리아인 레지오넬라 폐실병 배양부터 시작하세요.

이 OMVs는 박테리아 병원성에 기여하는 지단다당류와 막 단백질을 가지고 있습니다.

배양물을 원심분리하여 온전한 박테리아 펠릿으로 만듭니다.

OMV가 포함된 상청액을 수집하고 다시 원심분리기로 잔류 박테리아를 제거하세요.

상원액을 막을 통해 여과하여 남은 박테리아를 제거하고 OMV는 유지하세요.

박테리아 이물질을 제거하기 위해 신선한 막을 사용해 두 번째 여과를 수행합니다.

박테리아가 없는 여과액을 모아 초원심분리기로 OMV를 펠릿으로 만듭니다.

상청액을 버리고 펠릿을 버퍼 안에 다시 현탁한 후 다시 초원심분리기로 느슨하게 결합한 단백질과 지지다당을 제거합니다.

상청액을 제거하고 정제된 OMV를 버퍼에 재현탁합니다.

OMV를 혈액 한천과 BCYE 한천 플레이트에 줄여 배양합니다.

군집 형성이 없다는 점은 박테리아 오염이 없음을 확인시켜 줍니다.

OMVs는 숙주-병원체 상호작용 연구를 위해 저온에 보관하세요.

남은 액체 배양물을 90밀리리터의 신선한 YEB 배지에 넣고, 회전하는 셰이커에서 배양하여 OD₆₀₀이 3.0에서 3.5 사이까지 올릴 때까지 배양합니다. 액체 배양물을 4,000g에서 20분간 원 심분리하여 박테리아를 박테리아에 펠릿으로 넣으세요. 그 후 상청액을 신선한 원심분리관으로 옮깁니다.

박테리아 펠릿을 버리고 샘플을 다시 원심분리한 후 원심분리 과정을 다시 반복합니다. 다음으로 남은 상청액을 두 번 여과해 멸균하세요.

그 후 박테리아가 없는 상원액을 초원심분리관으로 옮기고, 샘플을 100,000g에서 4도 섭씨에서 3시간 동안 돌립니다. 상정액을 빼내고 버리세요. 그 다음 멸균 PBS로 OMV 펠릿을 재현탁하고 모으세요.

오염 단백질과 자유 LPS를 제거하기 위해 초원심분리 단계를 반복합니다. 이제 상원액을 버리고 멸균 면봉으로 초원심분리관을 말리세요. OMV 펠릿을 멸균 PBS 500마이크로리터로 재현탁하세요.

그 후, 혈액 한천과 BCYE 한천 플레이트에 각각 20마이크로리터씩 스트레이크하여 준비된 소포에 박테리아 오염을 방지합니다. 혈액 한천 플레이트는 하룻밤, BCYE 한천 플레이트는 3일간 배양하세요.