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미생물학
0 조회수 • 4:02 분 • February 2nd, 2026
병원성 박테리아에 감염된 쥐 뇌에서 추출한 총 RNA를 예로 들어봅시다. 추출물에는 감염 반응 유전자의 전사체가 포함되어 있습니다.
DNA 분해 효소를 추가하고 잔류 유전체 DNA를 분해하기 위해 인큐베이션합니다.
역전사효소(RT) 효소, 뉴클레오타이드, 비특이적 프라이머를 포함한 마스터 믹스를 추가하세요.
인큐베이션하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성합니다.
RT 효소를 비활성화하기 위해 고온을 투여하세요.
DNA 중합효소, 뉴클레오타이드, 이중 가닥 DNA 결합 염료, 그리고 표적 유전자에 특이적인 프라이머가 포함된 마스터 믹스를 생각해 보세요.
cDNA를 추가하고 가열하여 DNA를 변성시킵니다.
프라이머는 표적 cDNA에 결합하여 새로운 DNA 가닥 합성을 가능하게 합니다.
이 사이클은 표적 유전자를 증폭하기 위해 반복됩니다.
염료는 증폭된 DNA에 결합하여 각 사이클 종료 시 기록되는 형광을 방출합니다.
형광 증가는 감염된 쥐 뇌에서 감염 반응 유전자의 발현을 확인시켜 줍니다.
플랑크톤 세포나 바이오필름 상태 세포를 이용해 모든 쥐를 감염시키고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 안락사를 시행합니다. 다음으로, RNA 추출 키트를 사용해 뇌 조직에서 전체 RNA를 추출합니다.
각 마우스마다 RNA를 추출하기 위해 뇌 전체 조직을 사용하세요. 뇌 조직 전체를 다섯 개의 관으로 나누세요. 뇌 조직 최대 100밀리그램을 채취하고, 키트에 제공된 용해 매트릭스가 들어 있는 각 튜브에 1밀리리터의 용해액을 첨가하세요.
텍스트 프로토콜에 명시된 단계에 따라 RNA를 추출하세요. 다음으로, 역전사 시약 키트가 장착된 열사이클러를 사용하여 유전체 DNA 제거를 포함한 cDNA 합성을 수행합니다. 5배 유전체 DNA 제거 완충제 2마이크로리터와 유전체 DNA 제거 효소 1마이크로리터가 들어있는 튜브에 1마이크로그램의 RNA를 추가합니다.
RNase 없는 물을 10마이크로리터에 도달할 때까지 추가하세요. 42도 섭씨에서 2분간 배양하세요. 반응액에 마스터 믹스 10마이크로리터를 넣고 부드럽게 섞으세요.
즉시 역전사 반응을 진행하여 튜브를 섭씨 37도에 15분간 두세요. 그 후 반응을 85도(섭씨)로 5초간 옮깁니다. 사이버 정량 실시간 PCR 키트를 사용한 실시간 PCR 정량 분석을 수행합니다. 키트 설명서에 따라 효소, 프라이머, 50x ROX 참조 염료 2, 그리고 cDNA 템플릿을 결합하세요. 그 후 RNase 무첨가 물을 추가하여 총 부피가 20마이크로리터에 도달할 때까지 합니다.
각 샘플을 텍스트 프로토콜에 명시된 열 매개변수를 3배로 분석하고, 2-델타 델타 CT 방법을 기반으로 상대적 폴드 변화를 계산합니다.