식물 RNA 침묵을 억제하는 병원체 효과자를 선별하기 위한 공동 침윤 분석법

두 개의 Agrobacterium tumefaciens 현탁액이 같은 부피로 혼합된 혼합물을 가져가며, 각각 GFP를 암호화하는 플라스미드-1과 효과기 단백질을 암호화하는 다른 한 개를 포함합니다.

구멍을 뚫고 바늘 없는 주사기로 혼합물을 건강하고 완전히 팽창한 Nicotiana benthamiana 16c 잎의 하단 표면에 침투하세요.

세균 과증식을 막기 위해 연조직으로 과도한 부유물을 닦아내세요.

침투 구역을 표시하고 최적의 성장 조건에서 식물을 배양하세요.

아그로박테리움 은 플라스미드 DNA를 식물 세포로 전달하며, GFP와 이펙터 유전자는 mRNA로 전사되어 단백질로 번역됩니다.

공장의 방어 시스템은 RNA 침묵을 사용하며, 이중형 siRNA를 RISC에 적재합니다. 승객 가닥이 제거되면, 가이드 가닥이 복합체를 대상으로 하는 GFP mRNA를 퇴화시키도록 지시합니다.

그러나 이펙터 단백질은 siRNA에 결합하여 RISC와의 결합을 차단하고 GFP 형광이 지속되도록 합니다.

이를 통해 식물 RNA 침묵을 억제하는 병원체 효과자를 식별할 수 있습니다.

35S 녹색 형광 단백질을 포함한 아그로박테리움 배양물과 35S 오이 모자이크 바이러스 억제 2b, 추정 효과자, 또는 빈 벡터를 포함한 농박테리아 배양물을 같은 부피로 혼합합니다. 1밀리리터 바늘 없는 주사기를 사용해 니코티아나 베타미아나 16c 잎의 복측 면에 섞인 아그로박테리움 현탁물을 조심스럽고 천천히 침투합니다.

부드러운 조직 물티슈로 잎에 남아 있는 박테리아 부유물을 제거하고, 침투한 반점 가장자리를 마커펜으로 원을 그리세요.