신생아 쥐 비장 식세포에 의한 박테리아 사살의 시험관 평가

JoVE Encyclopedia of Experiments

미생물학

0 조회수 • 3:42 분 • January 30th, 2026

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신생아 쥐의 비장을 기계적으로 해리하여 단일 세포 현탁액을 생성하는 것으로 시작합니다.

현탁액을 튜브로 옮기고, 원심분리기를 사용해 상청액을 제거하세요.

적혈구를 제거하기 위해 용해 완충제에 펠릿을 재현탁합니다.

버퍼를 추가하고 다시 원심분리한 후 상원액을 제거하세요.

세포를 완충제에 재현탁시키고, 호중구와 염증성 단핵구에 발현된 수용체를 표적으로 하는 항체 코팅 자기 마이크로비드로 배양합니다.

원심분리기로 분리해서 묶이지 않은 구슬을 제거하세요. 버퍼를 추가한 후 부유액을 강자성 컬럼을 통과시키고 자기장을 가해 비드에 결합된 셀을 유지합니다.

자기장을 제거하고, 버퍼로 셀을 용출한 뒤 멀티웰 플레이트에 시딩합니다.

선택된 우물에 발광 박테리아의 농도를 점차 증가시키세요.

호중구와 단핵구가 식세포작용을 통해 박테리아를 내화할 수 있도록 인큐베이션하세요.

내부화되지 않은 박테리아를 제거하기 위해 배지를 항생제 함유 배지로 교체하세요.

식세포작용에 의해 유도된 박테리아의 내부 흡수와 이후 사살을 평가하기 위해 일정한 간격으로 발광을 기록합니다.

시험관 내 박테리아 살해 분석법을 수행하려면, 감염되지 않은 비장을 멸균된 60밀리미터 페트리 접시 안에 40마이크로미터 나일론 체에 넣고, 5밀리리터의 PBS와 10% 태아 소 혈청이 첨가된 상태에서 멸균된 3밀리리터 주사기 플런저를 사용해 조직을 단일 세포 현탁액으로 분해합니다. 세포를 15밀리리터 원심분리관으로 옮겨 원심분리로 채취합니다. 펠릿을 3에서 4개의 비장마다 1밀리리터의 적혈구 용해 완충제에 재현탁합니다.

상온에서 5분 후 비장을 PBS로 세척한 후, 펠릿을 250마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시키고, 소 혈청 알부민과 2밀리몰라 EDTA를 보충하여 계수를 진행합니다. 다음, 제조사 프로토콜에 따라 적절한 면역자기 비드로 Ly6 B2 양성 세포를 분리하고, 검정 또는 흰색 96웰 플레이트에 10 곱하기 10에서 5 세포 비율로 농축된 Ly6 B2 양성 세포를 시딩합니다. 각 웰당 최종 부피인 100마이크로리터에 원하는 감염 다수로 박테리아 접종체를 준비하고, 각 웰에 100마이크로리터의 박테리아 접종체 또는 배지를 추가하여 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 배양합니다.

배양 종료 시, 배양지를 200마이크로리터의 신선한 완전 배지로 교체하고, 겐타마이신 100마이크로그램/밀리리터를 보충하여 남은 세포외 박테리아를 제거하고 세포를 다시 세포 배양 인큐베이터에 2시간 더 보관합니다. 배양 종료 시와 이후 각 실험 시점에서, 플레이트 리더기를 사용해 뚜껑이 있는 배양 플레이트의 각 웰에서 발광을 측정한 후 다음 측정 때까지 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 돌려보냅니다.

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마지막 업데이트: 22 8월 2026