신생아 쥐 비장 식세포에 의한 박테리아 사살의 시험관 평가

신생아 쥐의 비장을 기계적으로 해리하여 단일 세포 현탁액을 생성하는 것으로 시작합니다.

현탁액을 튜브로 옮기고, 원심분리기를 사용해 상청액을 제거하세요.

적혈구를 제거하기 위해 용해 완충제에 펠릿을 재현탁합니다.

버퍼를 추가하고 다시 원심분리한 후 상원액을 제거하세요.

세포를 완충제에 재현탁시키고, 호중구와 염증성 단핵구에 발현된 수용체를 표적으로 하는 항체 코팅 자기 마이크로비드로 배양합니다.

원심분리기로 분리해서 묶이지 않은 구슬을 제거하세요. 버퍼를 추가한 후 부유액을 강자성 컬럼을 통과시키고 자기장을 가해 비드에 결합된 셀을 유지합니다.

자기장을 제거하고, 버퍼로 셀을 용출한 뒤 멀티웰 플레이트에 시딩합니다.

선택된 우물에 발광 박테리아의 농도를 점차 증가시키세요.

호중구와 단핵구가 식세포작용을 통해 박테리아를 내화할 수 있도록 인큐베이션하세요.

내부화되지 않은 박테리아를 제거하기 위해 배지를 항생제 함유 배지로 교체하세요.

식세포작용에 의해 유도된 박테리아의 내부 흡수와 이후 사살을 평가하기 위해 일정한 간격으로 발광을 기록합니다.

시험관 내 박테리아 살해 분석법을 수행하려면, 감염되지 않은 비장을 멸균된 60밀리미터 페트리 접시 안에 40마이크로미터 나일론 체에 넣고, 5밀리리터의 PBS와 10% 태아 소 혈청이 첨가된 상태에서 멸균된 3밀리리터 주사기 플런저를 사용해 조직을 단일 세포 현탁액으로 분해합니다. 세포를 15밀리리터 원심분리관으로 옮겨 원심분리로 채취합니다. 펠릿을 3에서 4개의 비장마다 1밀리리터의 적혈구 용해 완충제에 재현탁합니다.

상온에서 5분 후 비장을 PBS로 세척한 후, 펠릿을 250마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시키고, 소 혈청 알부민과 2밀리몰라 EDTA를 보충하여 계수를 진행합니다. 다음, 제조사 프로토콜에 따라 적절한 면역자기 비드로 Ly6 B2 양성 세포를 분리하고, 검정 또는 흰색 96웰 플레이트에 10 곱하기 10에서 5 세포 비율로 농축된 Ly6 B2 양성 세포를 시딩합니다. 각 웰당 최종 부피인 100마이크로리터에 원하는 감염 다수로 박테리아 접종체를 준비하고, 각 웰에 100마이크로리터의 박테리아 접종체 또는 배지를 추가하여 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 배양합니다.

배양 종료 시, 배양지를 200마이크로리터의 신선한 완전 배지로 교체하고, 겐타마이신 100마이크로그램/밀리리터를 보충하여 남은 세포외 박테리아를 제거하고 세포를 다시 세포 배양 인큐베이터에 2시간 더 보관합니다. 배양 종료 시와 이후 각 실험 시점에서, 플레이트 리더기를 사용해 뚜껑이 있는 배양 플레이트의 각 웰에서 발광을 측정한 후 다음 측정 때까지 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 돌려보냅니다.