마우스 치은조직 절편에서 박테리아의 현장 검출

병원성 박테리아에 감염된 쥐 치은절편을 가져와, 박테리아 DNA에 접근하기 위해 사전 처리하세요.

박테리아 DNA를 표적으로 하는 디곡시제닌 표지 DNA 프로브가 포함된 완충제를 적용합니다.

샘플 탈수를 방지하기 위해 커버슬립을 끼우고 밀봉하세요.

DNA를 변성시키기 위해 열을 가한 후, 뜨겁고 습한 환경에서 배양하여 프로브 하이브리다이제이션을 가능하게 합니다.

슬라이드를 냉각시키고 커버슬립을 제거한 뒤, 버퍼로 여러 번 세척해 결합되지 않은 프로브를 제거하세요.

비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단액을 추가하세요.

디골시제닌에 결합하는 효소 결합 항체와 함께 인큐베이팅합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척하세요.

내인성 효소를 선택적으로 비활성화하는 억제제를 추가하세요.

효소와 반응하는 기질을 적용해 색이 있는 침전물을 만듭니다.

물로 헹구어 과도한 기질을 제거하세요.

염료를 넣어 핵을 염색하세요.

과도한 염료를 제거하기 위해 세척하세요.

에탄올에 탈수한 후 자일렌으로 처리하여 조직 투명도를 높이세요.

섹션을 장착하세요.

현미경으로 절개 안의 박테리아를 관찰하세요.

먼저 슬라이드를 2x SSC에 20분간 담그는 것으로 시작하세요. 그동안 표지된 프로브를 하이브리다이저 버퍼에서 1 나노그램/마이크로리터로 희석합니다. 음성 대조군의 경우, 표지되지 않은 프로브 농도의 10배를 사용하세요. 그 후 프로브를 90도 섭씨에서 10분간 가열하여 변성시키고, 얼음 위에서 빠르게 냉각시킵니다.

다음으로, 각 슬라이드에 단백질나제 K와 같은 양의 프로브 희석액을 적용합니다. 그 다음, 매니큐어로 슬립 앤 씰 부위를 조심스럽게 덮으세요. 이제 PCR 기계 블록의 슬라이드를 90도 섭씨에서 10분간 가열한 뒤, 45도 가습 인큐베이터로 하룻밤 옮깁니다.

다음 날에는 슬라이드를 4도 섭씨에서 30분간 식힌 후 조심스럽게 커버 슬립을 제거하세요. 조직이 연약해. 마지막으로, 슬라이드를 실온에서 일련의 SSC 버퍼에 통과시킵니다.

현장에서 하이브리드 슬라이드를 MABT에 5분간 세척하세요. 그 다음 1% 트윈 20에 블로킹 용액 50에서 400마이크로리터를 20분간 발라줍니다. 차단 배양 후에는 차단액에 1에서 1000 항-DIG 알칼리성 인산효소 항체 50에서 400마이크로리터를 도포합니다.

37도 섭씨에서 90분간 결합시키세요. 1차 발효가 끝난 후에는 슬라이드를 MABT 세척액으로 10분간 세척하세요. 그 후 5분간 슬라이드를 1% Tween 20이